一種酶刺激響應(yīng)型智能納米容器及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶刺激響應(yīng)型智能納米容器，由MCM?41介孔二氧化硅和環(huán)糊精通過一條含有酯鍵的化學(xué)鏈相連接形成。所述的酶刺激響應(yīng)型智能納米容器通過先將介孔二氧化硅微球進行表面修飾后與七?(6?脫氧?6?疊氮基)?β?環(huán)糊精通過反應(yīng)組裝成納米容器，再通過自然吸附使藥物存儲在MCM?41介孔二氧化硅的內(nèi)部制備而成。脂肪酶作用于智能納米容器中的酯鍵，實現(xiàn)藥物的釋放，從而促使納米容器吸附?釋放藥物分子。本發(fā)明的智能納米容器作為一種藥物載體系統(tǒng)，能夠?qū)θ梭w中的多種酶做出響應(yīng)，并且對酶刺激響應(yīng)靈敏度高，操作簡便，在生物化學(xué)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景，能夠?qū)崿F(xiàn)靶向治療癌癥殺滅癌細胞，適用于癌癥的治療。
【專利說明】
-種酶刺激響應(yīng)型智能納米容器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于材料科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種酶刺激響應(yīng)型智能納米容器及其制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 智能納米容器，能在外界的某種刺激信號刺激下發(fā)生水解、質(zhì)子化、構(gòu)象、親水性 和溶解度等性質(zhì)變化，實現(xiàn)反饋調(diào)節(jié)，并且根據(jù)刺激信號的性質(zhì)和強弱調(diào)整藥物釋放的時 間、空間和劑量。刺激信號主要包括內(nèi)源性刺激，如pH值、氧化還原物質(zhì)和酶濃度等，和外源 性刺激，如溫度、光、磁場、超聲和電壓等。具有緩釋、控釋和祀向釋放功能的智能納米容器 藥物傳遞系統(tǒng)可W提高藥物生物利用度并降低其毒副作用。具備自組裝能力的超分子實體 是構(gòu)筑具有特殊性能的智能藥物載體的理想擱塊。
[0003] Wang等人（Mingdong W, et al. Qiemical Communications , 2014,50(39): 5068- 5071)將含有疊氮基的苯并咪挫和帶有烘基的β-環(huán)糊精通過點擊反應(yīng)生成一個遇酸可分解 的可控開關(guān)，然后用硅烷偶聯(lián)劑3-氨基丙基和Ξ甲氧基硅烷在介孔二氧化娃表面修飾丙 氨，最終由于介孔二氧化娃-丙氨上有游離的氨基，可W和被修飾的β-環(huán)糊精上面的艦原子 發(fā)生取代反應(yīng)，把遇酸可分解的開關(guān)連接到介孔二氧化娃納米微球的表面上，構(gòu)建了 pH刺 激響應(yīng)型智能藥物納米容器，該智能藥物納米容器能夠?qū)崿F(xiàn)藥物在酸性條件時的抑響應(yīng)吸 附和釋放。Lin等人（Min Lin,et al.Acs Applied Mate;rials&Inte;rfaces,2014,6(8): 5860-5868)制備了能夠在酶作用下發(fā)生響應(yīng)的智能納米容器，通過硅烷偶聯(lián)劑Ξ乙氧基娃 燒把DNA修飾在介孔二氧化娃納米微球表面，如果納米微球的介孔中裝載有藥物分子，微球 表面卷曲形狀的DNA分子就會對納米微球進行封裝，當DNA酶(I酶)加到模擬液體中時，介孔 二氧化娃納米微球表面的DNA就會發(fā)生水解，成為大量細小的片段，介孔處的口打開，藥物 分子就可W釋放出來。
[0004] 目前報道的可控性釋放的智能納米容器雖然能夠?qū)ν獠看碳ぷ鞒鲰憫?yīng)，但是存在 響應(yīng)時間長，響應(yīng)過程繁瑣復(fù)雜，適用范圍狹窄，靈敏度低等問題。此外，有的智能納米容器 中的超分子閥口具有生物毒性，限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種響應(yīng)過程快、靈敏度高、操作性好的酶刺激響應(yīng)型智 能納米容器及其制備方法。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] -種酶刺激響應(yīng)型智能納米容器的制備方法，具體步驟如下：
[000引步驟1，制備介孔二氧化娃微球；
[0009] 步驟2,將介孔二氧化娃微球超聲分散在無水甲苯中，逐滴加入3-氨丙基Ξ乙氧基 硅烷后加熱回流，氮氣保護，攬拌進行無水無氧縮醇反應(yīng)，得到產(chǎn)物MS化-1;
[0010] 步驟3,將MS化-1分散在二甲基亞諷中，然后加入下二酸酢和Ξ乙胺，于35°C~45 °C下反應(yīng)48~60小時，反應(yīng)產(chǎn)物先后用乙醇和甲醇清洗后烘干即得產(chǎn)物MS化-2;
[0011] 步驟4,將MS化-2與2-(2-丙烘氧基）乙醇、N，N-二異丙基碳二亞胺和4-二甲氨基化 晚在二甲基亞諷中混合，于35°C~45°C下反應(yīng)24~36小時，反應(yīng)產(chǎn)物先后用二甲基亞諷和 水清洗后烘干；
[0012] 步驟5,將步驟4得到的產(chǎn)物加入到吸附分子的飽和水溶液中，室溫下吸附72~84 小時；
[0013] 步驟6,將含有屯-(6-脫氧-6-疊氮基)-β-環(huán)糊精、無水硫酸銅和抗壞血酸鋼的N， Ν-二甲基甲酯胺溶液加入到步驟5中的吸附溶液中，反應(yīng)72~84小時，產(chǎn)物用水洗后即得酶 刺激響應(yīng)型智能納米容器。
[0014] 本發(fā)明步驟1中所述的介孔二氧化娃微球優(yōu)選為MCM-41，可參考文獻【W(wǎng)erner Slobcr,Arthur Fink,Ernst Bohn.Controlled growth of monodisperse silica，spheres in the micron size range：Journal of Colloid and Interface Science，1968:P62- 69】制備。
[0015] 優(yōu)選地，步驟2中，所述的介孔二氧化娃微球與3-氨丙基Ξ乙氧基硅烷的摩爾比為 1:1 ~1.2:1。
[0016] 優(yōu)選地，步驟3，4和6中加入反應(yīng)物的量為化學(xué)反應(yīng)計量比，可根據(jù)反應(yīng)情況適當 增加與介孔二氧化娃反應(yīng)的各物質(zhì)的量W達到提高產(chǎn)率的目的。
[0017] 優(yōu)選地，步驟5中，所述的吸附分子為羅丹明B或鹽酸多柔比星(D0X)。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下顯著優(yōu)點：（1)本發(fā)明的酶刺激響應(yīng)型智能納米 容器的制備方法簡單方便；（2)酶刺激響應(yīng)型智能納米容器響應(yīng)過程簡單且迅速，靈敏度 高，應(yīng)用范圍廣；（3)智能納米容器中的超分子閥口具有良好的生物相容性，無毒可降解，且 不產(chǎn)生酸性分解物，在藥物可控釋放領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0019] 圖巧本發(fā)明的酶刺激響應(yīng)型智能納米容器的裝配圖。
[0020] 圖2為本發(fā)明的酶刺激響應(yīng)型智能納米容器的結(jié)構(gòu)圖。
[0021] 圖3為酶刺激響應(yīng)型智能納米容器對羅丹明B的釋放圖。
[0022] 圖4為酶刺激響應(yīng)型智能納米容器對鹽酸柔比星(D0X)的釋放圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖及具體實施例，對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0024] 如圖1所示，為本發(fā)明的酶刺激響應(yīng)型智能納米容器的制備流程圖，首先制備介孔 二氧化娃，隨后對其進行表面修飾，最后將環(huán)糊精與其進行封裝。如圖2為酶刺激響應(yīng)型智 能納米容器的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0025] 本發(fā)明的一種酶刺激響應(yīng)型智能納米容器，具體制備步驟如下：
[00%] 步驟1，制備介孔二氧化娃微球MCM-41，參考文獻（WernerSt郎巧Arthur Fink, Ernst Bohn.Controlled growth of monodisperse silica,spheres in the micron size range：Journal of Colloid and Interface Science，1968:P62-69)審ij備；
[0027]步驟2,將介孔二氧化娃微球超聲分散在無水甲苯中，逐滴加入3-氨丙基蘭乙氧基 硅烷后加熱回流，氮氣保護，攬拌進行無水無氧縮醇反應(yīng)，得到產(chǎn)物MSNs-1，其中介孔二氧 化娃微球與硅烷偶聯(lián)劑3-氨丙基Ξ乙氧基硅烷的摩爾比為1:1~1.2:1;
[00%]步驟3,將MSNs-1分散在二甲基亞諷中，按化學(xué)計量比加入下二酸酢和Ξ乙胺，于 35°C~45°C反應(yīng)48~60小時，反應(yīng)產(chǎn)物先后用乙醇和甲醇清洗后烘干即得產(chǎn)物MS化-2;
[00巧]步驟4,將MS化-2與2-(2-丙烘氧基）乙醇、N，N-二異丙基碳二亞胺和4-二甲氨基化 晚按化學(xué)計量比在二甲基亞諷中混合，于35°C~45°C下反應(yīng)24~36小時，反應(yīng)產(chǎn)物先后用 二甲基亞諷和水清洗后烘干；
[0030] 步驟5,將步驟4的產(chǎn)物加入到吸附分子的飽和水溶液中，室溫下吸附72~84小時， 所述吸附分子為羅丹明B或鹽酸多柔比星(D0X);
[0031] 步驟6,將屯-(6-脫氧-6-疊氮基)-β-環(huán)糊精，無水硫酸銅，抗壞血酸鋼按化學(xué)計量 比溶于Ν，Ν-二甲基甲酯胺后加入到步驟5中的吸附溶液中，繼續(xù)反應(yīng)72~84小時，產(chǎn)物用水 洗清洗，得到上述一種酶刺激響應(yīng)型智能納米容器。
[0032] 實施例1
[0033] -種酶刺激響應(yīng)型智能納米容器的制備方法，具體步驟如下：
[0034] 1.制備介孔二氧化娃微球MCM-41
[0035] 將十六烷基Ξ甲基漠化錠（CTAB，0.5g)，NaOH溶液（2mo 1/L，1.75mL)與此0(240血） 混合，80°C下攬拌30min。逐滴加入正娃酸乙醋(TE0S，2.5mL)，充分攬拌lOmin后形成白色沉 淀。80°C下攬拌化，趁熱過濾，用水和甲醇充分清洗產(chǎn)物，90°C下真空干燥。
[0036] 稱取0.3g干燥固體，超聲分散于異丙醇(60mL)和濃鹽酸(3mL)的混合溶液，加熱回 流化，離屯、分離，用水和甲醇充分清洗，90°C下真空干燥得到介孔二氧化娃微球(MCM-41)。
[0037] 2.介孔二氧化娃的表面修飾
[003引將干燥后的MCM-41(200mg)超聲分散在無水甲苯（lOmL)中，逐滴加入3-氨丙基Ξ 乙氧基硅烷（100化），加熱回流，攬拌反應(yīng)2地，反應(yīng)結(jié)束后固體粉末通過離屯、收集并用無水 甲苯和甲醇清洗若干遍。60°C真空干燥過夜得白色粉末MS化-1。
[0039] 取MSNs-l(180mg)分散在二甲亞諷（lOmL)，加入下二酸?。?.08g)，Ξ乙胺 (0.08g)，在35°C條件下反應(yīng)48小時，反應(yīng)結(jié)束后固體粉末通過離屯、收集并用乙醇和甲醇各 洗1次，干燥過夜得白色粉末MS化-2。
[0040] 取MSNs-2(100mg)分散于二甲基亞諷(90mL)加入2-(2-丙烘氧基）乙醇（0.184邑）， N，N-二異丙基碳二亞胺(0.24g)，4-二甲氨基化晚(0.24g)，在35°C條件下反應(yīng)24小時，反應(yīng) 結(jié)束后固體粉末通過離屯、收集并用二甲基亞諷和水各洗兩遍，干燥過夜得白色粉末MSNs- 3。
[0041] 3.介孔二氧化娃中藥物分子的吸附
[0042] 取MSNs-3(30mg)分散在水(4mL)中，加入50mg羅丹明B，在常溫下攬拌72小時。
[0043] 4.組裝智能納米容器
[0044] 取屯-(6-脫氧-6-疊氮基)-β-環(huán)糊精（25mg)分散在N，N-二甲基甲酯胺（2mL)中，加 入羅丹明B(30mg)，無水硫酸銅（130mg)，抗壞血酸鋼(201.5mg)，將上述溶液加到上步吸附 的溶液中，常溫下攬拌72小時，反應(yīng)結(jié)束后固體粉末通過離屯、收集并用水洗到基本無色，得 到上述一種酶刺激響應(yīng)型智能納米容器MSNPs 1。
[0045] 5.智能納米容器的可控性釋放
[0046] 在石英比色皿中加入pH=7.4的憐酸鹽緩沖溶液3.8mL，稱取2.0mg MSNPs 1置于 折成錐形的已活化的半透膜中，將半透膜尖端朝下放入比色皿中，確保所有MSNPs 1都浸于 緩沖溶液液面W下，加入脂肪酶（Img/mL)，利用巧光分光光度計測其動力學(xué)變化化M = 572nm EX = 553nm)，如附圖3所示，釋放量達到40.3ymol/g。
[0047] 實施例2
[004引本發(fā)明一種酶刺激響應(yīng)型智能納米容器的制備方法，步驟如下：
[0049] 1.制備介孔二氧化娃微球MCM-41
[(K)加]同實施例1步驟1方法制備。
[0051] 2.介孔二氧化娃的表面修飾
[0052] 將干燥后的MCM-41(240mg)超聲分散在無水甲苯（lOmL)中，逐滴加入3-氨丙基Ξ 乙氧基硅烷（100化），加熱回流，攬拌反應(yīng)2地，反應(yīng)結(jié)束后固體粉末通過離屯、收集并用無水 甲苯和甲醇清洗若干遍。60°C真空干燥過夜得白色粉末MS化-1。
[005；3] 取MSNs-l(180mg)分散在二甲亞諷（lOmL)，加入下二酸?。?.08g)，Ξ乙胺 (0.08g)，在40°C條件下反應(yīng)48小時，反應(yīng)結(jié)束后固體粉末通過離屯、收集并用乙醇和甲醇各 洗1次，干燥過夜得白色粉末MS化-2。
[0054] 取MSNs-2(100mg)分散于二甲基亞諷(90mL)加入2-(2-丙烘氧基）乙醇（0.184邑）， N，N-二異丙基碳二亞胺(0.24g)，4-二甲氨基化晚(0.24g)，在40°C條件下反應(yīng)24小時，反應(yīng) 結(jié)束后固體粉末通過離屯、收集并用二甲基亞諷和水各洗兩遍，干燥過夜得白色粉末MSNs- 3。
[0055] 3.介孔二氧化娃中藥物分子的吸附
[0056] 取MSNs-3(30mg)分散在水(4mL)中，加入50mg羅丹明B，在常溫下攬拌72小時。
[0057] 4.組裝智能納米容器
[005引取屯-(6-脫氧-6-疊氮基)-β-環(huán)糊精（25mg)分散在N，N-二甲基甲酯胺（2mL)中，加 入羅丹明B(30mg)，無水硫酸銅（130mg)，抗壞血酸鋼(201.5mg)，將上述溶液加到上步吸附 的溶液中，常溫下攬拌72小時，反應(yīng)結(jié)束后固體粉末通過離屯、收集并用水洗到基本無色，得 到上述一種酶刺激響應(yīng)型智能納米容器MSNPs 1。
[0059] 5.智能納米容器的可控性釋放
[0060] 在石英比色皿中加入pH=7.4的憐酸鹽緩沖溶液3.8mL，稱取2.0mg MSNPs 1置于 折成錐形的已活化的半透膜中，將半透膜尖端朝下放入比色皿中，確保所有MSNPs 1都浸于 緩沖溶液液面W下，加入脂肪酶（Img/mL)，利用巧光分光光度計測其動力學(xué)變化化M = 572nm EX = 553nm)，釋放量達到40.5ymol/g。
[0061] 實施例3
[0062] 本發(fā)明一種酶刺激響應(yīng)型智能納米容器的制備方法，步驟如下：
[0063] 1.制備介孔二氧化娃微球MCM-41
[0064] 同實施例1步驟1方法制備。
[00化]2.介孔二氧化娃的表面修飾
[0066] 將干燥后的MCM-41(200mg)超聲分散在無水甲苯（lOmL)中，逐滴加入3-氨丙基Ξ 乙氧基硅烷（100化），加熱回流，攬拌反應(yīng)36h，反應(yīng)結(jié)束后固體粉末通過離屯、收集并用無水 甲苯和甲醇清洗若干遍。60°C真空干燥過夜得白色粉末MS化-1。
[0067] 取MSNs-l(180mg)分散在二甲亞諷（lOmL)，加入下二酸?。?.08g)，Ξ乙胺 (0.08g)，在45°C條件下反應(yīng)60小時，反應(yīng)結(jié)束后固體粉末通過離屯、收集并用乙醇和甲醇各 洗1次，干燥過夜得白色粉末MS化-2。
[0068] 取MSNs-2(100mg)分散于二甲基亞諷(90mL)加入2-(2-丙烘氧基）乙醇（0.184邑）， N，N-二異丙基碳二亞胺(0.24g)，4-二甲氨基化晚(0.24g)，在45°C條件下反應(yīng)36小時，反應(yīng) 結(jié)束后固體粉末通過離屯、收集并用二甲基亞諷和水各洗兩遍，干燥過夜得白色粉末MSNs- 3。
[0069] 3.介孔二氧化娃中藥物分子的吸附
[0070] 取MSNs-3(30mg)分散在水(4mL)中，加入鹽酸多柔比星(D0X)(50mg)，在常溫下攬 拌84小時。
[0071] 4.組裝智能納米容器
[0072] 取屯-(6-脫氧-6-疊氮基)-β-環(huán)糊精（25mg)分散在N，N-二甲基甲酯胺（2mL)中，加 入多鹽酸柔比星(D0X)(30mg)，無水硫酸銅（130mg)，抗壞血酸鋼(201.5mg)，將上述溶液加 到上步吸附的溶液中，常溫下攬拌84小時，反應(yīng)結(jié)束后固體粉末通過離屯、收集并用水洗到 基本無色，得到上述一種酶刺激響應(yīng)型智能納米容器MSNPs 2。
[0073] 5.智能納米容器的可控性釋放
[0074] 在石英比色皿中加入pH=7.4的憐酸鹽緩沖溶液3.8mL，稱取2.Omg MSNPs 2置于 折成錐形的已活化的半透膜中，將半透膜尖端朝下放入比色皿中，確保所有MSNPs 2都浸于 緩沖溶液液面W下，加入脂肪酶（Img/mL)，利用巧光分光光度計測其動力學(xué)變化化M = 480nm EX = 420nm)，如附圖4所示，釋放量達到37.祉mol/g。
【主權(quán)項】
1. 一種酶刺激響應(yīng)型智能納米容器的制備方法，其特征在于，具體步驟如下： 步驟1，制備介孔二氧化娃微球； 步驟2,將介孔二氧化硅微球超聲分散在無水甲苯中，逐滴加入3-氨丙基三乙氧基硅烷 后加熱回流，氮氣保護，攪拌進行無水無氧縮醇反應(yīng)，得到產(chǎn)物MSNs-I; 步驟3,將MSNs-I分散在二甲基亞砜中，然后加入丁二酸酐和三乙胺，于35°C~45°C下 反應(yīng)48~60小時，反應(yīng)產(chǎn)物先后用乙醇和甲醇清洗后烘干即得產(chǎn)物MSNs-2; 步驟4，將MSNs-2與2-( 2-丙炔氧基）乙醇、N，N-二異丙基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶在 二甲基亞砜中混合，于35°C~45°C下反應(yīng)24~36小時，反應(yīng)產(chǎn)物先后用二甲基亞砜和水清 洗后烘干； 步驟5,將步驟4得到的產(chǎn)物加入到吸附分子的飽和水溶液中，室溫下吸附72~84小時； 步驟6,將含有七-(6-脫氧-6-疊氮基)-β-環(huán)糊精、無水硫酸銅和抗壞血酸鈉的N，N-二 甲基甲酰胺溶液加入到步驟5中的吸附溶液中，反應(yīng)72~84小時，產(chǎn)物用水洗后即得酶刺激 響應(yīng)型智能納米容器。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1中所述的介孔二氧化硅微球優(yōu) 選為 MCM-41。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2中，所述的介孔二氧化硅微球與 3_氨丙基三乙氧基硅烷的摩爾比為1:1~1.2:1。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟5中，所述的吸附分子為羅丹明B 或鹽酸多柔比星。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的制備方法制得的酶刺激響應(yīng)型智能納米容器。
【文檔編號】A61K31/704GK105920613SQ201610465176
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】傅佳駿, 姜昊, 王婷
【申請人】南京理工大學(xué)