基于基本原理的癌癥靶向療法的設計的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的方法、組合物和藥劑盒與來他替尼降低SPOP底物的水平和途徑活性的發(fā)現(xiàn)有關。因此，本文描述了使用來他替尼下調(diào)有需要的受試者中的一種或多種SPOP底物或其信號傳導途徑活性的方法和組合物。
【專利說明】基于基本原理的癌癥靶向療法的設計 交叉引用
[0001 ]本申請要求于2013年12月3日提交的美國臨時申請?zhí)?1 /911，423的權益，該臨時 申請在此通過引用以其全文并入本文。
【背景技術】
[0002] 遍在蛋白（ubiquitin)介導的蛋白質(zhì)降解通常通過遍在蛋白蛋白酶體途徑發(fā)生。 在該途徑中，遍在蛋白-蛋白質(zhì)連接酶(例如，E3連接酶)通過將遍在蛋白鏈連接至待降解的 蛋白質(zhì)而靶向選定的供降解的蛋白質(zhì)。遍在蛋白化使得該蛋白質(zhì)能夠隨后被蛋白酶體復合 物識別，然后該復合物降解該蛋白質(zhì)。斑點（speckle)型P0Z蛋白（SP0P)通過起到底物識別 的作用而與遍在蛋白介導的靶蛋白降解有關。
[0003] SP0P通常包含兩個結構域:MATH域以及痘病毒和鋅指（P0Z)域（或者被稱為BTB 域）。SP0P的一般結構在圖1中示出。SP0P蛋白通常通過其MATH和P0Z域?qū)⒌鞍踪|(zhì)底物(例如， SP0P底物)募集至E3遍在蛋白連接酶。SP0P底物通常與SP0P蛋白的MATH域復合，而滯蛋白-3E3遍在蛋白連接酶與P0Z域相互作用。SP0P介導的SP0P底物向滯蛋白-3型E3遍在蛋白連接 酶的募集有利于SP0P底物的E3介導的遍在蛋白化，由此靶向供蛋白酶體降解的底物。
[0004] 人前列腺腫瘤的外顯子組測序揭示，前列腺腫瘤的子集包含SP0P突變（Nature Genetics 2012;44:685-689,在此通過引用并入本文）。總而言之，發(fā)現(xiàn)SP0P突變存在于6-15%的研究中的前列腺腫瘤中（Nature Genetics 2012;44:685-689)。有趣的是，與前列腺 腫瘤相關的所有鑒別的SP0P突變都在SP0P的底物結合袋內(nèi)（Nature Genetics 2012;44: 685-689)，表明這樣的突變可能損害SP0P底物結合以及隨后的遍在蛋白化（Proc Natl Acad Sci USA.2013 110:6997-7002,在此通過引用并入本文）。據(jù)報道，SRC-3蛋白在38% 的前列腺癌腫瘤樣品中過表達(Br J Cancer.2001;85:1928-36,在此通過引用并入本文）。 另一項研究顯示，SCR-3表達是前列腺癌細胞增殖和存活所需的，并且其水平與前列腺特異 性抗原(PSA)相關。在來自接受前列腺切除術的患者的一批前列腺癌樣品中，證明了具有 SRC3高表達的腫瘤與較低的無復發(fā)生存率有關(Cancer Res ? 2005S印1;65( 17): 7976-83， 在此通過引用并入本文）。這些研究提示了 SCR-3在前列腺癌形成中以及作為不良預后因素 的重要作用。此外，與前列腺癌相關的SP0P突變阻礙了 SP0P誘導SRC-3的遍在蛋白依賴性降 解的能力（Proc Natl Acad Sci USA.2013 110:6997-7002)。也已經(jīng)證明，SRC3在乳腺癌中 在基因水平和轉錄水平上均增加(Nature Reviews Clinical Oncology 2010;7:83-89,在 此通過引用并入本文）。例如，在一項研究中，58%的乳房腫瘤活檢物展示了升高的SRC3基 因表達水平。升高的SRC3水平還與許多其他癌癥有關。除了乳腺癌和前列腺癌之外，在胰腺 癌和胃癌中也顯不了升尚的SRC3水平。
[0005] Kim等人(APMIS.2013; 121:626-33)通過單鏈構象多態(tài)性(SSCP)在45個胃癌樣品、 45個結直腸癌樣品和45個前列腺癌樣品中完成了SP0P的突變和表達分析。此外，他們還通 過免疫組織化學分析了60個胃癌、60個結直腸癌和60個前列腺癌腫瘤標本中的SP0P蛋白表 達。SP0P基因在編碼序列中的三個體細胞錯義突變(2個在前列腺癌中，1個在結直腸癌中） (Serl4Leu、Tyr87Cys和Phel33Leu)全部位于N-末端底物結合域中。在免疫組織化學中， SPOP蛋白在正常的胃、結腸和前列腺上皮細胞中表達，而在30 %的胃癌、20%的結直腸癌和 37%的前列腺癌中發(fā)現(xiàn)了SPOP的喪失。
[0006] SRC3還在乳腺癌和其他惡性腫瘤中起關鍵作用（Science 1997; 277 :965-8，Ann 0ncol.2013;24:1414)。在Burandt(Breast Cancer Res Treat.2013 137:745-53)報道的 研究中，分析了2,197個乳腺癌樣品，并且通過基因譜分析和免疫組織化學（IHC)發(fā)現(xiàn)SRC3 過表達與腫瘤大小、高組織學分級、低疾病特異性和總生存率有關。在11 %的癌中通過熒光 原位雜交(FISH)發(fā)現(xiàn)了 AIB1增加。它與高組織學分級、淋巴結累及以及疾病特異性存活差 有關（Breast Cancer Res Treat.2013137:745-53)。
[0007]在7%的胃癌標本中觀察到SRC3增加，而在40%的胃癌標本中觀察到SRC3過表達 (Int J Cancer.2000;89:217-23) JRC3增加通常與其過表達一致，并與預后不良有關。有 趣的是，8 6個胃腺癌病例中有1 5個（1 7 . 4 % )對雄激素受體是陽性的 (了.〇311.1^8.(：1111.〇11(3.2〇04;1 3〇:253-258)。與（41?-)患者相比，具有4即日性腫瘤(41?+)的患 者具有顯著更差的預后（中值存活期9個月對24個月，P = 0.03)。
[0008] 鑒別出一種新的雌激素受體(ER)靶標一 DEK，其表達也促進乳腺癌細胞中雌激素 誘導的增殖。D E K消耗增加了 E R+乳腺癌細胞系中他莫昔芬誘導的細胞死亡（P L 〇 S 0 N E 2012; 7: e46985) AEK之前被鑒別為DNA重塑蛋白。DEK調(diào)控DNA損傷應答和信號傳導修復。 DEK起到轉錄因子的作用，并且據(jù)報道還是一種癌基因并且在幾乎所有器官和腫瘤中廣泛 表達(Nucleic Acids Res. 2011;39:7465-76) AEK通過促進DNA雙鏈斷裂修復，經(jīng)由p53依 賴性和非依賴性機制，保護腫瘤細胞免受DNA損傷劑的影響和免遭細胞死亡。DEK的高表達 與胃癌的預后不良有關(Diagn.Pathol.2014;9:67)。
[0009] 來他替尼(Lestaurtinib)是一種吲噪并味唑衍生物，其最初作為多種受體激酶的 抑制劑被發(fā)現(xiàn)，該受體激酶包括從1(2(1(： 50 = 0.911]\〇、？06邱（1(：50 = 21611]\〇、3丁八丁3(1(：50=1〇-30nM)、TRKB(IC5Q =〈25nM)、PRKl(IC5Q = 8.6nM)和PKC(IC5〇 = 226nM)以及FLT3(Cancer Res. 1999; 59:2395-401，Blood. 2002; 99:3885-91，其在此通過引用并入本文）。由于其受體 激酶抑制活性，提出來他替尼作為前列腺癌的潛在治療劑。然而，2期人類臨床試驗證明，用 來他替尼治療前列腺癌患者未能實現(xiàn)降低PSA水平的主要臨床終點（Cancer Biol Ther. 2007;6:1360-7,在此通過引用并入本文）。此后，進行了非常有限的來他替尼臨床開 發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的方法、組合物和藥劑盒與來他替尼可以降低SP0P底物或其下游靶標的表 達水平和/或途徑活性的發(fā)現(xiàn)有關。
[0011] 因此，本發(fā)明提供了一種下調(diào)有需要的受試者中的斑點型P0Z蛋白（SP0P)底物信 號傳導的方法，其包括向該受試者施用包含治療有效量的來他替尼或其藥學上可接受的鹽 的藥物組合物，由此下調(diào)該受試者中的SP0P底物信號傳導。
[0012] 在一些實施方案中，該底物選自SRC1、SRC2、SRC3、Daxx、G1 i、AWP-1、滯蛋白-4B、滯 蛋白-7和DEK。在一些實施方案中，該底物是SRC1、SRC2或SRC3。在一些實施方案中，該底物 是SRC3。在一些實施方案中，該底物是DEK。
[0013] 在一些實施方案中，該下調(diào)包括降低該SP0P底物或該底物的下游靶標的水平和/ 或活性。在一些實施方案中，該下調(diào)通過來源于該受試者的細胞中的下游靶標的活性降低 來呈現(xiàn)。在一些實施方案中，該下游靶標是PRK-1。在一些實施方案中，該下調(diào)包括降低該 SP0P底物的水平和/或活性。在一些實施方案中，該下調(diào)通過來源于該受試者的細胞中的底 物的水平降低來呈現(xiàn)。在一些實施方案中，該水平包括表達水平。在一些實施方案中，該表 達水平是蛋白質(zhì)表達水平。在一些實施方案中，該表達水平通過該SP0P底物的轉錄物的水 平來呈現(xiàn)。在一些實施方案中，該下調(diào)通過該細胞的胞質(zhì)部分中底物的水平降低來呈現(xiàn)。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種治療有需要的受試者的前列腺腫瘤的方法，其包括：向該受 試者施用第一劑量的藥物組合物，該藥物組合物包含治療有效量的來他替尼或其藥學上可 接受的鹽;確定來源于該受試者的生物樣品中的SP0P底物水平或其活性；以及如果與未施 用包含治療有效量的來他替尼或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物的對照受試者相比，該 底物水平或其活性降低，則施用額外劑量的該藥物組合物。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種治療受試者的前列腺腫瘤的方法，其包括向該受試者施用包 含治療有效量的來他替尼或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物，其中與對照受試者相比， 該受試者展現(xiàn)出異常高的SP0P底物水平或其活性。
[0016] 在一些實施方案中，該異常高的水平通過該腫瘤中SP0P突變的存在來呈現(xiàn)。在一 些實施方案中，該突變導致該SP0P氨基酸序列的位置31-161之間的氨基酸序列改變。在一 些實施方案中，該氨基酸序列改變包括氨基酸置換。在一些實施方案中，該突變導致在該 SP0P氨基酸序列的￥87^102、5119^125、1(129、1131^133和/或1(134處的置換。在一些實施 方案中，該突變導致Y87C置換、Y87N置換、F102C置換、S119N置換、F125V置換、K129N置換、 W131G置換、F133L置換、F133V置換，或其置換的任意組合。
[0017] 在任意本文方法的實踐中，所述受試者可以是人。在一些實施方案中，該受試者呈 現(xiàn)出疾病的癥狀。在一些實施方案中，該疾病是前列腺疾病。在一些實施方案中，該疾病是 前列腺腫瘤。在一些實施方案中，該前列腺腫瘤是雄激素敏感的。在一些實施方案中，該前 列腺腫瘤是雄激素不敏感的。在一些實施方案中，該前列腺腫瘤是雌激素敏感的。在一些實 施方案中，該前列腺腫瘤是雌激素不敏感的。在一些實施方案中，該疾病是乳房疾病或胃 病。在一些實施方案中，該疾病是乳房腫瘤或胃腫瘤。在一些實施方案中，該乳房腫瘤或胃 腫瘤是雄激素敏感的。在一些實施方案中，該乳房腫瘤或胃腫瘤是雄激素不敏感的。在一些 實施方案中，該乳房腫瘤或胃腫瘤是雌激素敏感的。在一些實施方案中，該乳房腫瘤或胃腫 瘤是雌激素不敏感的。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種下調(diào)前列腺細胞中SP0P底物水平或其活性的方法，其包括： 向該細胞使用有效量的來他替尼，由此下調(diào)該細胞中的SP0P底物或其活性；以及評價該前 列腺細胞中SP0P底物水平或其活性的下調(diào)。
[0019] 在一些實施方案中，該前列腺細胞是前列腺癌細胞。在一些實施方案中，該前列腺 細胞是培養(yǎng)的細胞。在一些實施方案中，該前列腺細胞是雄激素敏感的前列腺細胞。在一些 實施方案中，該前列腺細胞是雌激素敏感的前列腺細胞。在一些實施方案中，該前列腺細胞 是LNCaP細胞。
[0020] 本發(fā)明進一步提供了一種下調(diào)乳房細胞或胃細胞中SP0P底物水平或其活性的方 法，其包括：（a)向該細胞施用有效量的來他替尼，由此下調(diào)該細胞中的SP0P底物或其活性； 以及(b)評價該乳房細胞或胃細胞中SPOP底物水平或其活性的下調(diào)。
[0021] 在單獨但相關的實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療有需要的受試者的乳房腫瘤 或胃腫瘤的方法，其包括：（a)向該受試者施用第一劑量的藥物組合物，該藥物組合物包含 治療有效量的來他替尼或其藥學上可接受的鹽；（b)確定來源于該受試者的生物樣品中的 SP0P底物水平或其活性；以及(c)如果與未施用包含治療有效量的來他替尼或其藥學上可 接受的鹽的藥物組合物的對照受試者相比，該底物水平或其活性降低，則施用額外劑量的 該藥物組合物。
[0022] 在又一個實施方案中，本發(fā)明還提供了一種治療受試者的乳房腫瘤或胃腫瘤的方 法，其包括向該受試者施用包含治療有效量的來他替尼或其藥學上可接受的鹽的藥物組合 物，其中與對照受試者相比，該受試者展現(xiàn)出異常高的SP0P底物水平或其活性。
[0023]在再一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療有需要的受試者的乳房腫瘤或胃腫 瘤的方法，其包括：（a)向該受試者施用第一劑量的藥物組合物，該藥物組合物包含治療有 效量的來他替尼或其藥學上可接受的鹽；（b)確定來源于該受試者的生物樣品中的SP0P底 物水平或其活性；以及(c)如果與未施用包含治療有效量的來他替尼或其藥學上可接受的 鹽的藥物組合物的對照受試者相比，該底物水平或其活性降低，則施用額外劑量的該藥物 組合物。
[0024] 在一些實施方案中，該乳房細胞或胃細胞是原發(fā)的或以其他方式培養(yǎng)的癌性乳房 細胞或胃細胞。在一些實施方案中，該乳房細胞或胃細胞是雄激素敏感或雌激素敏感的細 胞。在一些實施方案中，該乳房細胞是MCF7細胞。在一些實施方案中，該底物選自SRC1、 SRC2、SRC3(0ncogene 2011 ;30:4350-64)(Nat Rev Cancer.2009;9:615-30,其在此通過引 用并入本文）、Daxx(J Biol Chem.2006;281:12664-72,在此通過引用并入本文）、Gli(Dev Cell. 2006; 10:719-29,在此通過引用并入本文）、AWP-1、滯蛋白-4B、滯蛋白-7(0ncogene 2011; 30:4350-64)以及 DEK。
[0025] 本發(fā)明還提供一種藥劑盒，其包含:藥物組合物的至少一個單位劑型，該藥物組合 物包含治療有效量的來他替尼或其藥學上有效的鹽；以及關于實施本文所公開的任何方法 的說明。 援引并入
[0026] 本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請均通過引用并入本文，其程度如 同具體地且個別地指出每一單獨的出版物、專利或?qū)＠暾埦ㄟ^引用而并入。
【附圖說明】
[0027] 本發(fā)明的新穎特征在隨附權利要求中具體闡述。通過參考以下對利用了本發(fā)明原 理的說明性實施方案加以闡述的詳細描述以及附圖，將會獲得對本發(fā)明的特征和優(yōu)點的更 好的理解，在附圖中：
[0028]圖1示出了 SP0P蛋白的結構以及示例性SP0P突變的位點。
[0029] 圖2示出了在以下3種前列腺癌細胞系中，來他替尼及其同源物星形孢菌素（STS) 對細胞生長的抑制:PC3(圖2A)、22RV1 (圖2B)和LNCaP克隆FGC(圖2C)。
[0030] 圖3示出了在以下3種乳腺癌細胞系中，來他替尼及其同源物星形孢菌素（STS)對 細胞生長的抑制:MCF7(圖3A)、BT-474(圖3B)和ZR-75-1 (圖3C)。
[0031]圖4示出了在以下4種胃癌細胞系中，來他替尼及其同源物星形孢菌素（STS)對細 胞生長的抑制:AGS(圖 4A)、MKN-45(圖 4B)、Hs746T(圖 4C)和 NCI-N87(圖 4D)。
[0032]表1示出了來他替尼在所有測試的癌細胞系中的IC5Q的匯總表。
[0033]圖5示出了來他替尼對前列腺癌細胞系中的SRC-3和PRK1蛋白表達水平的影響。 [0034]圖6示出了具有野生型SP0P的細胞相對于具有突變SP0P的細胞的AR轉錄活性調(diào)節(jié) 的工作模型。
[0035] 圖7示出了在兩種前列腺癌細胞中，來他替尼對SRC3(圖7A和7B)和DEK(圖7A和7C) 蛋白表達水平的劑量-響應影響。
[0036] 圖8示出了在兩種乳腺癌細胞中，來他替尼對SRC3 (圖8A和8B)和DEK (圖8A和8C)蛋 白表達水平的劑量-響應影響。
[0037] 圖9示出了在兩種胃癌細胞中，來他替尼對SRC3(圖9A和9B)和DEK(圖9A和9C)蛋白 表達水平的劑量-響應影響。
[0038]圖10示出了人SP0P的氨基酸序列。
【具體實施方式】 [0039] 通用技術：
[0040]除非另有說明，本發(fā)明的實踐將采用免疫學、生物化學、化學、分子生物學、微生物 學、細胞生物學、基因組學和重組DNA的常規(guī)技術，其均在本領域的技術范圍內(nèi)。參見，例如， Fritsch和Maniatis,MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL,第4版（2012);CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0L0GY(F.M.Ausubel，等人編著（1987)) ;METH0DS IN ENZYM0L0GY系列（Academic Press , Inc . ) : PCR 2 : A PRACTICAL APPROACH (M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R. Taylor編著（1995))以及ANIMAL CELL CULTURE (R. I .Freshney編著（1987)，其在此通過引用并入本文）。
[0041]如本說明書和權利要求中使用的，除非上下文明確指定，否則單數(shù)形式"一個"、 "一種"和"該"包括復數(shù)的指示物。例如，術語"一個細胞"包括多個細胞，包括其混合物。 [0042]
[0043] 多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，并且是指任何長度的氨基酸 的聚合物。該聚合物可以是直鏈或支鏈的，其可以包含修飾的氨基酸，并且其可被非氨基酸 中斷。該術語還包括已被修飾的氨基酸聚合物;例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；?、磷 酸化或任何其他操作，如與標記組分的綴合。如本文所用的，術語"氨基酸"是指天然的和/ 或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L光學異構體，以及氨基酸類似物和擬肽。 [0044]如本文所用的，術語"氨基酸"包括天然存在的和合成的氨基酸，以及以類似于天 然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺 傳密碼編碼的那些氨基酸，以及后來被修飾的那些氨基酸，例如，Y _羧基谷氨酸、羥基脯氨 酸和0-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學結構（即， 與氫、羧基、氨基和R基團結合的a碳）的化合物。示例性的氨基酸類似物包括但不限于高絲 氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜和甲硫氨酸甲基锍。這樣的類似物可以具有修飾的R基團（例 如，正亮氨酸)或修飾的肽骨架，只要其保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學結構。"氨 基酸模擬物"是指這樣的化學化合物，其具有與氨基酸的一般化學結構不同的結構，但以類 似于天然存在的氨基酸的方式發(fā)揮作用。
[0045] 在本文中可以用公知的三字母符號或用由IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的 單字母符號來指代氨基酸。
[0046] 在多肽的語境中，"序列"是多肽中的氨基酸在從氨基至羧基末端方向上的順序， 其中該序列中彼此相鄰的殘基在該多肽的一級結構中是連續(xù)的。
[0047]術語"多核苷酸"、"核酸"、"核苷酸"和"寡核苷酸"可互換使用。它們是指任何長度 的核苷酸(無論是脫氧核糖核苷酸還是核糖核苷酸)或其類似物的聚合形式。多核苷酸可具 有任意的三維結構，并且可以執(zhí)行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性實 例:基因或基因片段的編碼區(qū)或非編碼區(qū)、從連鎖分析確定的基因座、外顯子、內(nèi)含子、信使 RNA(mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA，核酶、cDNA、重組多核苷酸、支鏈多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任 意序列的分離的DNA、任意序列的分離的RNA、核酸探針以及引物。多核苷酸可以包含修飾的 核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如果存在的話，可以在聚合物的組裝之前或 之后賦予對該核苷酸結構的修飾。核苷酸的序列可以被非核苷酸組分中斷。多核苷酸可以 在聚合后進一步修飾，例如通過與標記組分綴合。
[0048]如本文中所使用的，"表達"是指多核苷酸被轉錄為mRNA的過程，和/或轉錄的mRNA (也稱為"轉錄物"）隨后被翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)的過程。轉錄物和/或編碼的多肽可以作 為表達水平的讀出來評價。如果多核苷酸來源于基因組DNA，則表達可以包括真核細胞中 mRNA的剪接。
[0049]術語"有效量"或"治療有效量"是指如下文所定義的、足以實現(xiàn)預期應用的本文所 述化合物的量，該應用包括但不限于疾病治療。治療有效量可以根據(jù)預期應用（體外或體 內(nèi)），或所治療的受試者和疾病狀況，例如，受試者的體重和年齡、疾病狀況的嚴重程度、給 藥方式等而改變，這些可以由本領域普通技術人員容易地確定。該術語也適用于將會誘導 革巴細胞中的特定響應例如血小板粘附和/或細胞迀移減少的劑量。具體劑量將根據(jù)選擇的 具體化合物、遵循的給藥方案、是否與其他化合物聯(lián)合施用、施用的時機、所施用至的組織 以及攜帶它的物理遞送系統(tǒng)而變化。
[0050] "亞治療量"可以是小于該藥劑的有效量的量。當與有效量或亞治療量的一種或多 種其他藥劑組合時，由于例如所產(chǎn)生的有效效果的協(xié)同作用或副作用的減少，該亞治療量 可以產(chǎn)生醫(yī)師所期望的結果。
[0051] 如本文所用的，術語"治療"或"處理"在本文中可互換使用。這些術語是指用于獲 得有益或期望的結果的途徑，該結果包括但不限于治療性益處和/或預防性益處。治療性益 處可以意指所治療的潛在病癥的根除或改善。同樣，治療性益處可以伴隨一種或多種與潛 在病癥相關的生理癥狀的根除或改善而實現(xiàn)，使得在受試者中觀察到好轉，盡管該受試者 可能仍受該潛在病癥的折磨。預防性效果包括延遲或消除疾病或病況的出現(xiàn)，延遲或消除 疾病或病況的癥狀發(fā)作，減緩、停止或逆轉疾病或病況的進展，或其任意組合。對于預防性 益處，可以將組合物施用至處于發(fā)展出特定疾病的風險中的受試者，或施用至報告疾病的 一個或多個生理癥狀的受試者，即使可能尚未作出該疾病的診斷。
[0052] 如本文所用的，術語"共同施用"、"與...聯(lián)合施用"及其語法等同語包括兩種或多 種藥劑向動物的施用，使得兩種藥劑和/或其代謝物同時存在于該受試者中。共同施用包括 以單獨的組合物同時施用，以單獨的組合物在不同的時間施用，或以兩種藥劑都存在的組 合物施用。
[0053] 術語"藥學上可接受的鹽"是指從多種本領域公知的有機和無機抗衡離子衍生的 鹽，并且僅舉例而言，包括堿加成鹽和酸加成鹽。在化合物包含酸性部分的情況下可以形成 堿加成鹽。在化合物包含堿性部分的情況下可以形成酸加成鹽。示例性的堿加成鹽包括堿 金屬鹽，例如，鈉、鉀和鋰鹽，堿土金屬鹽，例如，鈣和鎂鹽，銨鹽如銨和四烷基銨鹽，與有機 堿如三乙胺、嗎啉、哌啶和二環(huán)己基胺形成的鹽；以及與堿性氨基酸如精氨酸和賴氨酸形成 的鹽。示例性的酸加成鹽可以包括有機或無機酸的鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硝酸 鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、草酸 鹽、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、天冬氨酸鹽、谷氨酸鹽，等等。在具有超過一個堿性部分的化合 物中，超過一個堿性部分可以被轉化成鹽形式，包括但不限于二鹽或三鹽。或者，具有超過 一個堿性部分的化合物可以僅在一個堿性部分處形成鹽。在本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括具有一 個或多個氨基酸的母體化合物的鹽。任何上述氨基酸都是合適的，特別是被發(fā)現(xiàn)作為蛋白 質(zhì)組分的天然存在的氨基酸，雖然氨基酸通常是帶有具有堿性或酸性基團的側鏈的氨基 酸，例如，賴氨酸、精氨酸或谷氨酸，或是帶有具有中性基團的側鏈的氨基酸，如甘氨酸、絲 氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、異亮氨酸或亮氨酸。
[0054] 如本文所用的，術語"鹵素"或"鹵代"表示氟、氯、溴或碘。
[0055] 術語"信號傳導"、"信號傳導途徑"、"途徑活性"和"信號傳導途徑活性"在本文中 可互換使用以指代這樣的過程，在該過程期間，信號被傳輸進入細胞、離開細胞和/或在細 胞內(nèi)傳輸以激發(fā)細胞內(nèi)的響應。術語"SP0P底物信號傳導"通常是指由SP0P底物介導的一種 或多種信號傳導途徑。示例性的SP0P底物和SP0P底物信號傳導途徑在本文中描述。術語 "SP0P底物信號傳導"包括由SP0P底物和/或定位至SP0P底物途徑的一種或多種下游分子介 導的蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)/糖蛋白、蛋白質(zhì)/核酸和/或核酸/核酸相互作用。這樣的下游 分子的非限制性實例在本文中描述。
[0056] 術語"確定"、"測量"、"評估"、"評價"、"測定"和"分析"在本文中可互換使用以指 代任何形式的測量，并包括確定要素是否存在。這些術語包括定量和/或定性測定。評價可 以是相對或絕對的。"評價...的存在"包括確定某種物質(zhì)存在的量，以及確定其是否存在。
[0057] 概述
[0058]本發(fā)明的方法、組合物和藥劑盒與來他替尼可以降低SP0P底物或其下游靶標的表 達水平和/或途徑活性的發(fā)現(xiàn)有關。因此，本文描述了下調(diào)有需要的受試者中的SP0P底物信 號傳導的方法。某些SP0P底物的異常高的水平和/或途徑活性與多種疾病例如某些類型的 癌癥有關。例如，某些SP0P底物的異常高的水平和/或途徑活性與腫瘤例如前列腺癌、乳腺 癌或胃癌相關。因此，本文公開了多種使用來他替尼治療受試者的前列腺腫瘤、乳房腫瘤或 胃腫瘤的方法和組合物，該受試者包含一種或多種SP0P底物或其信號傳導途徑活性的異常 高的水平。任何這些方法均可以包括向受試者施用包含治療有效量的來他替尼或其藥學上 可接受的鹽的藥物組合物。本文還描述了一種下調(diào)前列腺、乳房或胃細胞中的一種或多種 SP0P底物或其信號傳導途徑活性的方法。該方法可以包括(a)向該細胞施用有效量的來他 替尼或其藥學上可接受的鹽，由此下調(diào)腫瘤細胞如前列腺癌、乳腺癌或胃癌中的一種或多 種SP0P底物或其信號傳導途徑活性，以及(b)評價該腫瘤細胞如前列腺癌、乳腺癌或胃癌中 的一種或多種SP0P底物或其信號傳導途徑活性的下調(diào)。本發(fā)明的方法、組合物和藥劑盒進 一步與以下發(fā)現(xiàn)有關:SPOP底物和SPOP底物途徑活性的來他替尼介導的下調(diào)與來他替尼降 低腫瘤細胞活力的能力相關。
[0059] 因此，本文進一步公開了一種治療有需要的受試者的腫瘤的方法。該方法可以包 括(a)向該受試者施用第一劑量的藥物組合物，該藥物組合物包含治療有效量的來他替尼 或其藥學上可接受的鹽；（b)確定來源于該受試者的生物樣品中的SP0P底物水平或其活性； 以及(c)如果與未施用包含治療有效量的來他替尼或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物的 對照受試者相比，該底物水平或其活性降低，則施用額外劑量的該藥物組合物。本文還公開 了用于實施任意本發(fā)明方法的藥劑盒。
[0060] 示例性的SP0P底物和SP0P底物信號傳導途徑
[0061] 在任意本發(fā)明方法的實踐中，待下調(diào)的SP0P底物可以是能夠與SP0P形成復合物的 任何蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，待下調(diào)的SP0P底物是能夠與野生型SP0P形成復合物的蛋 白質(zhì)。與SP0P (例如，與野生型SP0P)形成復合物可以通過該底物與SP0P的結合來呈現(xiàn)。該結 合可以是弱結合或強結合。該結合可以包括瞬時或永久的結合。在一些實施方案中，該SP0P 底物能夠通過SP0P蛋白的MATH域中的一個或多個氨基酸與SP0P形成復合物。該MATH域可以 包含SP0P氨基酸序列的氨基酸31-161。在一些實施方案中，該SP0P底物能夠與在SP0P蛋白 質(zhì)序列的氨基酸位置31-161之間并且包括該SP0P蛋白質(zhì)序列的氨基酸位置31-161的一個 或多個氨基酸形成復合物。在一些實施方案中，該SP0P底物能夠與在SP0P蛋白質(zhì)序列的氨 基酸位置60-140之間并且包括該SP0P蛋白質(zhì)序列的氨基酸位置60-140的一個或多個氨基 酸形成復合物。在一些實施方案中，該SP0P底物能夠與在SP0P蛋白質(zhì)序列的氨基酸位置87-133之間并且包括該SP0P蛋白質(zhì)序列的氨基酸位置87-133的一個或多個氨基酸形成復合 物。在一些實施方案中，該SP0P底物能夠與SP0P蛋白的片段形成復合物。該片段可以包含 SP0P氨基酸序列的MATH域的部分或全部。例如，該片段可以包含SP0P蛋白質(zhì)序列的氨基酸 31-161、60-140或87-133。
[0062] 可以與SP0P形成復合物的SP0P底物可以包括包含SP0P共有結合序列（SP0P-CBS) 的蛋白質(zhì)。該SP0P-CBS可以包含序列S-S/T-S/T。該SP0P-CBS可以包含序列jt-S-S/T-S/T或 (P-7I-S-S/T-S/T，其中(P是非極性氨基酸并且是極性氨基酸。示例性的非極性氨基酸包 括但不一定限于A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y和Z。示例性的極性氨基酸包括但不一定限于R、N、D、 Q、Z和K。該SP0P-CBS可以包含前面是酸性氨基酸（例如，D或Z)的序列S-S/T-S/T。例如，該 SP0P-CBS可以包含序列D/E-Xi-S-S/T-S/T，其中X是任何氨基酸并且i=0-2。在一些實施方 案中，i = 0。在一些實施方案中，i = l。在一些實施方案中，i = 2。在一些實施方案中，該 SP0P-CBS是DSTT、DVSST、EVTSTT或DSTSS。可以通過在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中搜索含有SP0P-CBS序 列的多肽來鑒別包含SP0P-CBS的多肽。例如，可以使用SP0P-CBS序列來采用蛋白質(zhì)BLAST算 法查詢蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。僅舉例而言，包含SP0P-CBS的示例性SP0P底物包括AWP1、用于激活T 細胞家族成員1的連接體、滯蛋白4B以及滯蛋白7。
[0063]可以通過本領域技術人員已知的任何手段來確定SP0P底物與SP0P或其片段形成 復合物的能力。例如，對于本領域技術人員，多種用于評價蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法 是可用的。在一些實施方案中，通過結合試驗檢測復合物的形成?？梢允褂媒Y合試驗來檢測 SP0P與疑似為SP0P底物的蛋白質(zhì)之間的結合。示例性的結合試驗包括但不限于免疫共沉 淀、下拉試驗(pul 1-down assay)、交聯(lián)蛋白質(zhì)相互作用分析、標記物轉移蛋白質(zhì)相互作用 分析以及far-western印跡分析。用于檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的其他試驗包括例如酵 母雙雜交試驗和表面等離子體共振試驗。
[0064] 免疫共沉淀試驗通常涉及使用捕獲抗體來捕獲靶蛋白以及與該靶蛋白復合的其 他任何蛋白質(zhì)。然后可以通過本領域已知的任何手段例如考馬斯染色、抗體檢測和/或標記 物檢測來測定與該靶蛋白復合的蛋白質(zhì)。僅舉例而言，可以將包含疑似SP0P底物的蛋白質(zhì) 樣品與固定在固體或半固體支持物例如珠子上的SP0P抗體一起溫育?？梢酝ㄟ^該固定的 SP0P抗體捕獲包含SP0P (或SP0P片段）和SP0P結合配偶體（例如，SP0P底物）的任何復合物。 然后可以通過本領域已知的任何手段分析該復合物，以鑒別該SP0P結合配偶體。
[0065] 下拉試驗通常使用捕獲在固體或半固體表面上的釣餌蛋白。然后可將該固定的釣 餌蛋白與包含潛在"獵物"蛋白的蛋白質(zhì)樣品一起溫育。"獵物"蛋白可以與該固定的釣餌蛋 白形成復合物。然后可以將捕獲的"獵物蛋白"洗脫下來并通過本領域已知的任何手段來評 價。
[0066] 可以在結合配偶體的分離或鑒別之前利用化學交聯(lián)將蛋白質(zhì)相互作用"固定"到 位。用于該應用的常見交聯(lián)劑包括不可裂解的NHS-酯交聯(lián)劑，二磺基琥珀酰亞胺基辛二酸 酯(BS3);BS3的可裂解形式，二硫代雙(磺基琥珀酰亞胺基丙酸酯）（DTSSP);以及普遍用于 在ChIP試驗中固定相互作用的亞氨酸酯交聯(lián)劑二硫代二丙亞氨酸二甲酯（DTBP)。交聯(lián)之 后，可以通過本領域技術人員已知的任何手段檢測和/或鑒別蛋白質(zhì)結合配偶體。例如，可 以通過質(zhì)譜法例如高質(zhì)量MALDI質(zhì)譜法來鑒別結合配偶體。
[0067]標記物轉移可以用于蛋白質(zhì)相互作用的篩選或確認，并且可以提供關于相互作用 發(fā)生處的界面的信息。在典型的標記物轉移反應中，將釣餌蛋白與可檢測標記物連接。然后 可以允許該標記的釣餌蛋白與獵物蛋白形成復合物。復合物形成后，與該可檢測標記物的 連接可以從該釣餌蛋白轉移至該獵物蛋白。然后可以通過包括Western印跡分析、蛋白質(zhì)序 列分析和質(zhì)譜法在內(nèi)的多種方法來分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。
[0068] 在far-Western分析中，通常使用標記的或抗體可檢測的"釣館"蛋白來探測和檢 測膜上的靶"獵物"蛋白。含有該獵物蛋白的樣品中的蛋白質(zhì)通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯 酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)或非變性PAGE來分離，然后固定在固體或半固體支持物上。轉移 后，用標記的釣餌蛋白探測該固體或半固體支持物。允許該釣餌蛋白與固定的結合配偶體 形成復合物。依賴于所使用的標記物，檢測系統(tǒng)鑒別對應于該結合配偶體的條帶。
[0069] 酵母雙雜交試驗的前提是用于激活例如報告基因的表達的轉錄因子可以被分成 兩個模塊化組分這一發(fā)現(xiàn)。該模塊化組分可以包括DNA結合組分和轉錄激活組分。在酵母雙 雜交試驗中，用"釣館"和"獵物"質(zhì)粒轉染酵母菌株。該釣餌質(zhì)粒通常編碼與兩個模塊化組 分之一(例如，DNA結合組分)融合的"釣館"蛋白，而該"獵物"質(zhì)粒通常編碼與兩個模塊化組 分中的另一個(例如，轉錄激活組分)融合的"獵物"蛋白的疑似結合配偶體。包含該"釣館" 蛋白和結合配偶體的復合物的形成通常使該轉錄因子的兩個組分足夠靠近，以實現(xiàn)報告基 因的轉錄。激活的報告基因轉錄的檢測可以指示該釣餌蛋白與結合配偶體之間的復合物的 形成。在一些實施方案中，該釣餌蛋白是SP0P或SP0P片段，而結合配偶體是疑似SP0P底物。 在一些實施方案中，該釣餌蛋白是疑似SP0P底物，而結合配偶體是SP0P或SP0P片段。
[0070] 還可以利用表面等離子體共振(SPR)來檢測SP0P結合配偶體。SPR通常利用固定在 SPR晶體上的釣餌蛋白。將包含"獵物"蛋白的液體溶液注射在釣餌層上。釣餌與獵物之間的 復合物的形成可以通過SPR信號（以響應單位RU表示）的增加來呈現(xiàn)。
[0071]在一些實施方案中，待下調(diào)的SP0P底物是能夠被SP0P/遍在蛋白連接酶復合物遍 在蛋白化的蛋白質(zhì)。SP0P底物被SP0P/遍在蛋白連接酶復合物遍在蛋白化的能力可以通過 本文所述的或其他本領域已知的方法在體內(nèi)或體外確定。例如，SP0P底物被SP0P/遍在蛋白 連接酶復合物的遍在蛋白化可以在體外確定。示例性的體外遍在蛋白化測定包括在溶液中 合并（1)疑似SP0P底物，（2)遍在蛋白，（3) SP0P/遍在蛋白連接酶，和(4)遍在蛋白化所需的 任何反應組分?？梢詫⒃撊芤簻赜阋园l(fā)生SP0P底物的遍在蛋白化的時間。
[0072] SP0P底物被SP0P/遍在蛋白連接酶復合物的遍在蛋白化可以在體內(nèi)確定。僅舉例 而言，可以用標記的遍在蛋白、疑似SP0P底物和/或SP0P轉染培養(yǎng)的細胞?？梢杂玫鞍酌阁w 抑制劑處理該細胞，以使得遍在蛋白化的蛋白質(zhì)能夠積累?？梢詫瑯擞浀谋樵诘鞍椎?遍在蛋白化的蛋白質(zhì)固定在固體或半固體支持物上，并通過本領域已知的任何手段例如免 疫測定來檢測和/或鑒別。
[0073] SP0P底物可以包括被SP0P/遍在蛋白連接酶復合物降解的蛋白質(zhì)。SP0P介導的 SP0P底物的降解可以在體內(nèi)或體外確定?？梢酝ㄟ^例如在存在或不存在SP0P的情況下溫育 表達SP0P底物的細胞，并將在SP0P的存在下生長的細胞中的SP0P底物水平與在不存在SP0P 的情況下生長的細胞中的SP0P底物水平進行比較，在體內(nèi)確定SP0P介導的SP0P底物的降 解。與在不存在SP0P的情況下生長的細胞中的SP0P底物水平相比，在SP0P的存在下生長的 細胞中的SP0P底物水平的降低可以指示SP0P介導的SP0P底物的降解。
[0074] 在一些實施方案中，待下調(diào)的SP0P底物途徑活性是受試者中的雄激素信號傳導途 徑。在一些情況下，待下調(diào)的SP0P底物增強雄激素信號傳導途徑的活性。雄激素信號傳導通 常由雄激素受體介導。雄激素配體與AR的結合通常誘導AR的核易位。然后AR可以募集能夠 調(diào)節(jié)靶基因的AR介導的轉錄調(diào)節(jié)的輔調(diào)節(jié)蛋白。例如，激活的AR可以與AR響應元件結合并 激活AR靶基因的轉錄。示例性的AR靶基因包括但不限于TMPRSS2、IGF 1-R、NKXX3.1、CXCR4、 皿八1(、]\^?、財41、61^81和?仙?5。這些41?靶基因代表了定位至3?0?底物途徑的下游分子的非 限制性實例。
[0075]在一些實施方案中，增強雄激素受體信號傳導的SP0P底物是AR輔調(diào)節(jié)蛋白，其還 增強雌激素受體(ER)信號傳導。作為SP0P底物的示例性AR和ER輔調(diào)節(jié)蛋白包括pl60輔激活 物家族蛋白質(zhì)。P160輔激活蛋白可以包括SRC1、SRC2 (TIF2)和SRC3 (也稱為AIBi)。這些P160 輔激活蛋白可以激活AR/ER靶基因的AR/ER介導的轉錄激活。具體地，SRC3可以顯著地激活 靶基因的AR/ER介導的轉錄，并且可以被SP0P/E3遍在蛋白化連接酶復合物遍在蛋白化。因 此，在一些實施方案中，本發(fā)明方法包括下調(diào)有需要的受試者中的P160輔激活蛋白信號傳 導途徑。在一些實施方案中，該P160輔激活蛋白是SRC3。不希望受理論的限制，有可能SP0P 活性降低可以導致SRC3的遍在蛋白化減少，由此提高SRC3蛋白水平并隨后增加AR特異性的 基因表達。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明方法包括下調(diào)有需要的受試者中的SRC3水平或 其信號傳導活性。
[0076] 影響雄激素信號傳導的SP0P底物還可以包括例如AN1型鋅指蛋白eUWPlhAWPl通 常是指與腫瘤壞死因子受體相關因子2(TRAF2)相互作用的鋅指蛋白（Int J Biochem Cell Biol 2011 ;43:1612-1620)。降低AWP1蛋白水平可以增加腫瘤壞死因子a(TNFc〇誘導的細胞 死亡（Int J Biochem Cell Biol 2011;43:1612-1620)。相反，增加AWP1 蛋白可以抑制細胞 死亡，由此增強腫瘤形成。AWP1還與一種蛋白激酶C家族絲氨酸/蘇氨酸激酶一PRK1相互作 用(Gene 2000;256:113-121) 1RK1的刺激可以導致AR的配體依賴性超活化(EMBO J 2003; 22: 270-280)。不希望受理論的限制，有可能SPOP活性降低可以導致AWP1的遍在蛋白化減 少，由此提高AWP1蛋白水平和AWP1活性。AWP1途徑活性可以減少例如前列腺腫瘤細胞的細 胞死亡。此外，AWP1途徑活性可以增強PRK1信號傳導并隨后誘導AR超活化。因此，在一些實 施方案中，本發(fā)明方法包括下調(diào)有需要的受試者中的AWP1或AWP1信號傳導。
[0077]影響雄激素信號傳導的SP0P底物還可以包括Gli蛋白。Gli蛋白通常是指介導 hedgehog信號傳導途徑的一類蛋白質(zhì)轉錄因子。Gli蛋白可以包括Glil、Gli2和Gli3。特別 是，Glil可以在人體中充當癌蛋白。Gli途徑活性可以增強AR特異性的基因表達，并且可以 使得雄激素敏感的LNCaP細胞能夠在雄激素耗盡的培養(yǎng)基中生長。不希望受理論的限制，有 可能SP0P活性降低可以導致Gli的遍在蛋白化減少，由此提高Gli蛋白水平并隨后增加AR特 異性的基因表達。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明方法包括下調(diào)有需要的受試者中的Gli 底物信號傳導。在特定的實施方案中，該Gli底物信號傳導途徑是Glil底物信號傳導途徑。 [0078] SP0P底物可以潛在地包括DEK;其蛋白質(zhì)序列存在DSSTT和DESSS共有基序，提示 DEK可能能夠被SP0P介導的途徑降解，并且如果SP0P具有失能突變或由于其他原因的蛋白 質(zhì)表達喪失，則其水平提高。在前列腺癌和胃癌細胞中，DEK的表達水平似乎高于SRC3，而在 乳腺癌中DEK表達水平較低，但在用來他替尼處理乳腺癌細胞后顯示出降低，這與SRC3相 似。
[0079]在一些實施方案中，待下調(diào)的SP0P底物或底物途徑活性影響細胞增殖、存活和/或 凋亡。例如，SP0P底物可以抑制細胞中的凋亡。這類SP0P底物的信號傳導活性的下調(diào)可能能 夠增強腫瘤細胞例如前列腺腫瘤細胞的凋亡。抑制細胞凋亡的示例性SP0P底物包括但不限 于AWP1和Daxx。Daxx途徑活性可以抑制細胞死亡。例如，Daxx途徑活性可以通過抑制腫瘤抑 制基因P53的活性來抑制細胞死亡。不希望受理論的限制，有可能SP0P活性降低可以導致 Daxx的遍在蛋白化減少，由此提高Daxx蛋白水平并隨后抑制例如腫瘤細胞的細胞死亡。因 此，在一些實施方案中，本發(fā)明方法包括下調(diào)有需要的受試者中的Daxx底物信號傳導。
[0080] SP0P底物水平或活性的下調(diào)
[0081] 在任意本發(fā)明方法的實踐中，向有需要的受試者施用包含治療有效量的來他替尼 的藥物組合物可以導致該受試者中SP0P底物水平和/或途徑活性的下調(diào)。同樣，向腫瘤細胞 施用有效量的來他替尼可以導致該腫瘤細胞中的SP0P底物水平和/或途徑活性。示例性的 SP0P底物及其途徑活性在本文中描述。SP0P底物水平和/或其途徑活性的下調(diào)可以通過多 種本文所述或其他本領域已知的方法來確定。例如，受試者中SP0P底物水平和/或其途徑活 性的下調(diào)可以通過與對照受試者和/或?qū)φ杖后w的比較來確定。如果與對照受試者和/或?qū)?照群體相比，受試者中SP0P底物或信號傳導的水平降低，則可以認為該SP0P底物和/或其信 號傳導在受試者中下調(diào)。該對照受試者可以是未施用來他替尼的個體。同樣，對照群體可以 包含多個未施用來他替尼的個體。該對照受試者可以是需要SP0P底物下調(diào)或SP0P底物活性 下調(diào)、未施用來他替尼的受試者。與有需要但未施用來他替尼的對照受試者相比，其SP0P底 物或途徑活性可以降低。
[0082] 對照受試者不必是與所述受試者不同的個體，而可以是在早些時間點的同一受試 者，例如，在接受第一劑量的來他替尼之前的同一受試者。因此，可以將來他替尼第一次施 用后受試者中SPOP底物或其信號傳導的下調(diào)與來他替尼第一次施用前同一受試者中的 SP0P底物水平或其途徑活性進行比較。例如，一種評價有需要的受試者中的SP0P下調(diào)的方 法可以包括在第一時間點測定該受試者或來源于該受試者的生物樣品中的SP0P底物水平 或其途徑活性。該受試者可以患有、疑似患有任意本文所述的疾病，或疑似處于任意本文所 述疾病的增加的風險中。例如，該受試者可以患有前列腺腫瘤、乳房腫瘤或胃腫瘤。該第一 時間點可以是在施用如本文所述的組合物前的時間點。該方法可以進一步包括在第二時間 點測定該受試者或來源于該受試者的生物樣品中的SP0P底物水平或其途徑活性。該第二時 間可以在該組合物的施用后?？梢詫⒃谠摰诙r間點測定的水平與在該第一時間點測定的 水平進行比較，以確定是否已發(fā)生下調(diào)。在一些實施方案中，下調(diào)指示該藥物組合物的施用 的臨床效力。在一些實施方案中，該方法進一步包括如果SP0P底物水平或其途徑活性降低， 則施用額外劑量的藥物組合物。
[0083]可以在受試者或來源于該受試者的生物樣品中確定SP0P底物水平或其信號傳導。 該生物樣品可以是流體樣品。示例性的流體樣品包括例如全血、血漿、血清、腹水、腦脊液、 汗液、尿液、眼淚、唾液或口腔樣品。該生物樣品還可以是固體生物樣品。示例性的固體生物 樣品包括例如糞便或組織活檢物。該生物樣品可以帶有或疑似帶有病變細胞或病變組織。 該病變細胞或組織可以是腫瘤細胞或腫瘤組織。該腫瘤細胞或組織可以是癌細胞或癌組 織。例如，該細胞可以是腫瘤干細胞或循環(huán)腫瘤細胞。該生物樣品可以帶有或疑似帶有來源 于病變細胞或組織的大分子。該生物樣品可以是帶有或疑似帶有來源于病變細胞或組織的 大分子的基本無細胞的樣品。該大分子可以是多肽和/或多核苷酸。例如，該多核苷酸可以 是RNA或DNA。
[0084] SP0P底物水平可以指SP0P底物表達水平。SP0P底物表達水平可以指受試者或生物 樣品中SP0P底物的蛋白質(zhì)水平和/或濃度。可以通過本領域已知的任何手段來確定蛋白質(zhì) 水平和/或濃度。示例性的方法包括但不限于western印跡、ELISA、免疫沉淀、放射免疫測 定、質(zhì)譜法、成像例如PET成像、免疫熒光、蛋白質(zhì)微陣列和免疫組織化學。
[0085] SP0P底物水平可以指編碼該SP0P底物蛋白的多核苷酸的水平和/或濃度。例如，該 多核苷酸可以是DNA和/或RNA。評價多核苷酸的水平和/或濃度的方法是本領域技術人員已 知的。示例性的方法包括但不限于測序、新一代測序、微陣列、聚合酶鏈反應(PCR)、實時PCR (RT-PCR)、數(shù)字PCR、原位雜交（ISH)、RNA酶保護測定，等等。
[0086] SP0P底物水平可以通過經(jīng)由例如遍在蛋白-蛋白酶體降解途徑靶向SP0P底物以供 降解的水平來呈現(xiàn)。這樣的證明可以包括但不限于SP0P底物遍在蛋白化的呈現(xiàn)。在本文中 描述了用于評價SP0P底物遍在蛋白化的示例性方法。例如，SP0P底物遍在蛋白化的增強可 以指示SP0P底物下調(diào)的增強。SP0P底物水平可以通過評價SP0P底物的SP0P介導的降解來呈 現(xiàn)。本文中描述了用于評價SP0P底物的SP0P介導的降解的示例性方法。
[0087]可以通過本領域技術人員已知的任何方法，和/或通過本文描述的方法來確定受 試者或來源于該受試者的生物樣品中的SP0P底物信號傳導的水平。示例性的SP0P信號傳導 途徑在本文中描述，并且包括例如雄激素受體信號傳導、PRK1活性和細胞死亡的抑制?？梢?以多種方式確定雄激素受體信號傳導。例如，可以通過測定雄激素受體激活的轉錄物的水 平和/或濃度來確定雄激素受體信號傳導?？梢酝ㄟ^本文所述的方法例如RT_PCR、RNA酶保 護測定、原位雜交等來確定轉錄物(例如，mRNA轉錄物）的水平和/或濃度。雄激素受體激活 的基因包括但不限于 了]^1?52、16?1-1?、1^?3.1、0乂〇?4、獻1(、]\^?、財41、61^81和?仙？5。舉其 他例子來說，可以通過雄激素受體測定來確定雄激素受體信號傳導。在示例性的雄激素受 體報告測定中，用在雄激素受體響應元件的控制下表達報告基因的質(zhì)粒轉染細胞?？梢杂?該測定中檢測到的報告物的水平來推斷雄激素受體活性?？梢酝ㄟ^評價受試者或來源于該 受試者的生物樣品對雄激素的敏感性來確定雄激素受體信號傳導。例如，可以通過劑量-響 應曲線或通過測量受試者或生物樣品對已知量的雄激素的響應來確定對雄激素的敏感性。 [0088]可以通過本文所述或其他本領域已知的方法來確定PRK1活性。例如，可以通過評 價已知PRK1靶標的磷酸化來確定PRK1活性。已知的PRK1靶標包括，例如，組蛋白H3 WRK1可 以將組蛋白H3在其蘇氨酸11位置(H3T11)磷酸化。PRK1介導的H3T11磷酸化可以導致增強的 雄激素受體信號傳導?？梢酝ㄟ^例如Western印跡和/或激酶試驗來確定H3T11磷酸化。 [0089]另一種示例性的SP0P信號傳導途徑涉及TNFa誘導的細胞死亡的AWP1介導的抑制。 TNFa信號傳導途徑可以包括NF-kB的激活。NF-kB的激活可以包括蛋白質(zhì)TRAF2和RIP的募 集。TRAF2轉而可以募集多組分蛋白激酶IKK，使得絲氨酸-蘇氨酸激酶RIP能夠?qū)⑵浼せ?。?種在正常情況下與NF-kB結合并抑制其易位的抑制性蛋白質(zhì)一 iKBa可以被IKK磷酸化，并且 隨后被降解，從而釋放NF-kB JF-kB通常是指一種異二聚體轉錄因子，其易位至細胞核，并 介導與細胞存活和增殖、炎癥反應以及抗凋亡因子有關的大量蛋白質(zhì)的轉錄。TNFa信號傳 導途徑可以包括MAPK途徑的激活。例如，TNFa信號傳導可以誘導應激相關的JNK途徑，可以 誘導P38-MAPK途徑，并且還可以誘導ERK。募集的TRAF2/Rac可以激活MLK2/MLK3、TAK1、 MEKK1和ASK1的誘導JNK的上游激酶（或者直接誘導，或者分別通過GCK和Trx誘導hSRC-Vav-Rac軸可以激活MLK2/MLK3 H2/MLK3激酶可以將MKK7磷酸化，然后磷酸化的MKK7可以 激活JNK<JNK可以易位至細胞核并激活轉錄因子如c-Jun和ATF2<JNK途徑可以是促凋亡途 徑。TNFa還可以誘導細胞壞死。細胞壞死可以是胱天蛋白酶非依賴性的細胞死亡。TNFa誘導 的壞死可以與活性氧(R0S)的生成相關?？梢酝ㄟ^本領域已知的任何手段評價R0S。例如，可 以通過氧化時發(fā)熒光的報告探針來評價R0S。氧化時發(fā)熒光的示例性探針包括7'-二氯熒光 素(DCF)、羧基-H2DCFDA、H2DFFDA、二氫鈣黃綠素、AM、氨基苯基熒光素、羥基苯基熒光素和 ?丐黃綠素，等等。用于評價R0S的試劑盒可以從例如Abcam、Cell Bio Labs、Life Technologies和Sigma-Aldrich商購。還可以通過形態(tài)學分析來確定壞死。壞死的形態(tài)學標 志包括但不限于遺傳物質(zhì)的密集的聚集和進行性破壞，以及細胞和細胞器的膜的破壞。例 如，由于DNA降解，核染色質(zhì)可能褪色?？梢酝ㄟ^細胞核的收縮、通過染色質(zhì)凝聚以及細胞碎 裂來呈現(xiàn)壞死。質(zhì)膜可能表現(xiàn)為不連續(xù)的。該不連續(xù)的膜可能由細胞出泡和微絨毛的損失 而導致?？梢酝ㄟ^本領域已知的任何手段評價細胞死亡，包括但不限于細胞計數(shù)、MTT試驗、 TUNEL染色、膜聯(lián)蛋白V染色、膜聯(lián)蛋白V/碘化丙錠染色，等等。
[0090]示例性的發(fā)明方法可以包括向腫瘤細胞施用有效量的來他替尼，由此下調(diào)該細胞 中的SP0P底物水平或其活性。該方法可以進一步包括評價該腫瘤細胞中SP0P底物水平或其 活性的下調(diào)。評價下調(diào)的方法在本文中描述。該腫瘤細胞可以包含SP0P底物的升高的水平 或途徑活性。該腫瘤細胞可以是來源于如本文所述的受試者的細胞。該腫瘤細胞可以是前 列腺、乳房或胃腫瘤細胞。該腫瘤細胞可以是雄激素或雌激素敏感的前列腺、乳房或胃腫瘤 細胞。該腫瘤細胞可以是培養(yǎng)的細胞。該培養(yǎng)的細胞可以是例如LNCaP、PC3或MCF7細胞。在 一些實施方案中，該有效量是0 ? 01nM、0 ? 05nM、0 ? lnM、0 ? 5nM、lnM、5nM、10nM、20nM、30nM、 40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、 450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM、750nM、800nM、850nM、900nM、950nM、lOOOnM、 1lOOnM、1200nM、1300nM、1400nM、1500nM、1600nM、1700nM、1800nM、1900nM、2000nM、2100nM、 2200nM、2300nM、2400nM、2500nM、2600nM、2700nM、2800nM、2900nM、3000nM、3100nM、3200nM、 3300nM、3400nM、3500nM、3600nM、3700nM、3800nM、3900nM、4000nM、5000nM、6000nM、7000nM、 8000nM、9000nM、10000nM(10yM)、15yM、20yM、25yM、30yM、35yM、40yM、45yM、50yM、55yM、60y 1、65處、70處、75處、80虛、85虛、90處、95處、100處、200處、300處、400處、500處、600虛、70011 M、800yM、900yM或lOOOyM(lmM)。在一些實施方案中，該有效量是0.01-10nM、10nM-100nM、 30nM-1000nM、100nM-3000nM、500nM-10，000nM(10yM)、卜100虛或50yM-1000yM(ImM)。
[0091]有效量的來他替尼的施用或包含來他替尼的藥物組合物的施用可以使SPOP底物 水平或其途徑活性下調(diào)至少5 %、10 %、15 %、20 %、25 %、30 %、35 %、40 %、45 %、50 %、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或超過 99%。本 文所述的藥物組合物的施用可以使SP0P底物水平或其途徑活性下調(diào)5-20%、10-40%、30_ 60%、40-80%、60-95%或75-99%。
[0092]通過施用包含來他替尼的藥物組合物對SP0P底物水平或其途徑活性的下調(diào)可能 對受試者具有治療性益處。例如，在受試者罹患腫瘤或癌癥(例如，前列腺腫瘤或癌癥)的情 況下，受試者中SP0P底物水平或其途徑活性的下調(diào)可以降低受試者中前列腺腫瘤或癌細胞 的活力。SP0P底物水平或其途徑活性的下調(diào)可以延遲或中止受試者中的腫瘤或癌細胞生 長、可以減少受試者中的癌細胞數(shù)目、可以縮小受試者中的腫瘤或癌、可以防止或延遲受試 者中腫瘤或癌的轉移，或者可以預防性地防止受試者中腫瘤或癌的形成。在患有前列腺癌 的受試者中，SP0P底物水平或其活性的下調(diào)可以降低該受試者中的血液PSA水平。
[0093]受試者中SP0P底物水平或其活性的下調(diào)可以用作受試者中來他替尼的治療效力 的指示物。因此，本發(fā)明方法可以包括(a)向該受試者施用第一劑量的藥物組合物，該藥物 組合物包含治療有效量的來他替尼或其藥學上可接受的鹽；（b)確定來源于該受試者的生 物樣品中的SP0P底物水平或其活性；以及(c)如果與未施用包含治療有效量的來他替尼或 其藥學上可接受的鹽的藥物組合物的對照受試者相比，該底物水平或其活性降低，則施用 額外劑量的該藥物組合物。
[0094]示例性受試者
[0095]在任意本發(fā)明方法的實踐中，受試者可以是需要SP0P底物水平或其途徑活性的下 調(diào)的任何受試者。本文描述了示例性的受試者。
[0096]需要SP0P底物水平或其途徑活性的下調(diào)的受試者可以具有包含升高的SP0P底物 水平或途徑活性的細胞或組織。需要SP0P底物水平或其途徑活性的下調(diào)的受試者可以具有 包含升高的SP0P底物水平或途徑活性的細胞或組織。包含升高的SP0P底物水平或途徑活性 的受試者細胞或組織可以是病變組織或細胞，例如腫瘤或癌性組織或細胞。在一些實施方 案中，與非病變組織或細胞相比，該病變細胞或組織包含升高的SP0P底物水平或途徑活性。
[0097]升高的SP0P底物和/或其途徑活性可以具有本文所述的任意SP0P底物或信號傳 導。在一些實施方案中，該升高的SP0P底物和/或途徑活性是P160類固醇激活物，如SRC1、 SRC2或SRC3。在一些實施方案中，該升高的SP0P底物和/或其途徑活性是SRC3。該升高的 SP0P底物和/或其途徑活性可以是AWP1。該升高的SP0P底物和/或其途徑活性可以是Gli。該 升高的SPOP底物和/或其途徑活性可以是Gli-l、Gli-2和/或Gli-3。升高的SPOP底物信號傳 導途徑可以導致增加的PRK1信號傳導和/或PRK1表達。
[0098]可以在受試者或來源于該受試者的生物樣品中確定升高的SP0P底物水平或途徑 活性。本文描述了示例性的生物樣品。
[0099]在一些實施方案中，與參考受試者或參考生物樣品中的SP0P底物的水平或途徑活 性相比，受試者或來源于該受試者的生物樣品中的SP0P底物的水平或途徑活性升高。在一 些實施方案中，該參考受試者不具有或未被懷疑具有與升高的SP0P底物水平相關的疾病。 在一些實施方案中，該參考生物樣品來源于需要SP0P底物下調(diào)的受試者的非病變組織。在 一些實施方案中，如果受試者或來源于該受試者的生物樣品中的SP0P底物的水平或途徑活 性高于SP0P底物的閾值水平或途徑活性，則該水平或途徑活性被認為是升高的?？梢杂杀?領域技術人員通過例如考慮在不需要SP0P下調(diào)的受試者群體中發(fā)現(xiàn)的SP0P底物或底物途 徑活性的范圍或平均值來確定該閾值水平或途徑活性。
[0100]在一些實施方案中，受試者或來源于該受試者的生物樣品中的SP0P底物的水平或 途徑活性比參考受試者或參考生物樣品中的SP0P底物的水平或途徑活性高5-50%、高40-100%、高80-200%、高100-500%、高400-1000%或高超過1000%。在一些實施方案中，受試 者或來源于該受試者的生物樣品中的SP0P底物的水平或途徑活性比參考受試者或參考生 物樣品中的SP0P底物的水平或途徑活性高5%、10%、15 %、20 %、25 %、30 %、35 %、40 %、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、 130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、400%、500%、 600%、700%、800%、900%、1000%或者高超過 1000%。
[0101]受試者或來源于該受試者的生物樣品可以展現(xiàn)出升高的SP0P底物途徑活性。如本 文所述，升高的SP0P底物途徑可以是雄激素受體信號傳導途徑。可以通過如本文所述或本 領域已知的多種方式來確定雄激素受體信號傳導。
[0102] 在一些實施方案中，升高的SP0P底物途徑導致細胞死亡的抑制，例如TNFa誘導的 途徑的AWP1介導的抑制。本文描述了示例性的TNFa誘導的途徑。本文描述了用于評價細胞 死亡的方法。
[0103] 在一些實施方案中，需要SP0P底物水平或其途徑活性下調(diào)的受試者或來源于該受 試者的生物樣品展現(xiàn)出一種或多種SP0P突變。所述一種或多種SP0P突變可包括在編碼SP0P 蛋白的多核苷酸(例如，DNA或RNA)(例如，SPOP基因）中的突變。該突變可以影響SPOP基因的 任何部分。所述一種或多種SP0P突變可包括SP0P蛋白中的突變。所述一種或多種SP0P突變 可以是點突變、插入、缺失、擴增、易位、倒位或雜合性丟失。在一些實施方案中，該突變是失 能突變或顯性失活突變。該突變可以是移碼突變。移碼突變可破壞讀框，導致與原序列相比 完全不同的經(jīng)翻譯的蛋白質(zhì)。該突變可以是無義突變。無義突變可導致提前終止密碼子，從 而編碼截短的且可能無功能的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。該SP0P突變可以是無義突變，其中單核苷酸改 變引起在經(jīng)翻譯的蛋白質(zhì)中的氨基酸置換。該突變可引起在SP0P蛋白的MATH域中的改變。 該突變可以改變SP0P氨基酸序列的位置31-161之間的氨基酸序列。該突變可引起SP0P氨基 酸序列的￥87、？102、3119、？125、1(129、1131小133和/或1(134處的置換。在一些實施方案中， 該突變引起Y87C置換、Y87N置換、F102C置換、S119N置換、F125V置換、K129N置換、W131G置 換、F133L置換、F133V置換或其置換的任意組合。該突變可降低SP0P蛋白與SP0P底物的結合 效力。該突變可降低SPOP促進SPOP底物的遍在蛋白化的能力。該突變可減少SPOP底物的降 解。
[0104] 可通過本領域已知的任何手段確定SP0P突變的存在，其包括基因分型試驗和測序 方法。測序方法可包括新一代測序、靶向測序、外顯子組測序、全基因組測序、大規(guī)模平行測 序等。若干用于新一代測序的平臺是商購可得的。商購可得的平臺包括，例如，用于合成測 序、離子半導體測序、焦磷酸測序、可逆染料終止子測序、連接測序、單分子測序、雜交測序 和納米孔測序的平臺。用于合成測序的平臺可從例如IIlumina、454Life Sciences、 Helicos Biosciences和Qiagen獲得。Illumina平臺可包括，例如，Illumina的Solexa平臺、 Illumina的基因組分析儀，并且在Gudmundsson等人(Nat .Genet ? 2009 41:1122-6)，0ut等 人(Hum.Mutat.2009 30:1703-12)和Turner(Nat.Methods 2009 6:315-6)，美國專利申請 公開號 US20080160580 和 US20080286795,美國專利號 6306597、7115400 和 7232656 中描述， 這些文獻通過引用并入于此。454Life Science平臺包括，例如，GS Flex和GS Junior，并且 在通過引用并入于此的美國專利號7,323,305中描述。來自Helicos Biosciences的平臺包 括True Single Molecule Sequencing平臺。用于離子半導體測序的平臺包括，例如，Ion Torrent Personal Genome Machine(PGM)，并且在通過引用并入于此的美國專利號 7948015中描述。用于焦磷酸測序的平臺包括GS Flex 454系統(tǒng)，并且在通過引用并入于此 的美國專利號7211390、7244559、7264929中描述。用于連接測序的平臺和方法包括，例如， SOLiD測序平臺，并且在通過引用并入于此的美國專利號5750341中描述。用于單分子測序 的平臺包括來自Pacific Bioscience的SMRT系統(tǒng)和Helicos True Single Molecule Sequencing平臺。納米孔測序方法在通過引用并入于此的Soni GV and Meller A.Clin Chem 53:1996-2001 [ 2007 ]中描述。納米孔測序DNA分析技術正在被包括Oxford Nanopore Technologies (Oxford, Uni ted Kingdom)在內(nèi)的許多公司進行工業(yè)開發(fā)。納米孔測序通常 是指一種單分子測序技術，通過該技術，當DNA單分子穿過納米孔時直接對其進行測序。納 米孔可以是直徑為1納米數(shù)量級的小孔。在導電流體中浸沒納米孔以及跨過它施加電勢（電 壓)可導致由離子通過納米孔傳導引起的輕微的電流。流動的電流的量對納米孔的大小和 形狀敏感，并且對例如DNA分子的堵塞敏感。當DNA分子穿過納米孔時，DNA分子上的每一個 核苷酸可以不同程度地阻塞納米孔，從而不同程度地改變通過納米孔的電流的量級。因此， 當DNA分子穿過納米孔時電流的這種變化代表了該DNA序列的讀取結果。盡管自動化Sanger 法被認為是'第一代'技術，但本發(fā)明的方法也可以采用Sanger測序，包括自動化Sanger測 序。
[0105] 任何本文所述的受試者可能患有、被診斷為患有、被懷疑患有與異常高水平的 SP0P底物相關的疾病，或被懷疑處于發(fā)展為該疾病的風險中。例如，該受試者可能被診斷為 患有、被懷疑患有與異常高水平的SRC3相關的疾病，或被懷疑處于發(fā)展為該疾病的風險中。 與異常高水平的SRC3相關的示例性疾病包括但不限于前列腺癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌。
[0106] 任何本文所述的受試者可以是動物。該動物可以是脊椎動物。示例性的脊椎動物 包括兩棲動物、禽類、哺乳動物和爬行動物。示例性的哺乳動物包括但不限于小鼠、兔、豚 鼠、貓、狗、豬、綿羊、馬、牛、人和猴。示例性的兩棲動物包括但不限于蛙、蟾蜍、火蜥蜴和蠑 螈。示例性的爬行動物包括但不限于蜥蜴、蛇和龜。示例性的禽類包括但不限于雞、水禽、 雀、燕雀、鷹、隼和雕。在一些實施方案中，該受試者是無脊椎動物，例如秀麗隱桿線蟲 (Caenorhabditis elegans)，或昆蟲，例如黑腹果繩（Drosophila melongaster) 〇 [0107]示例性化合物
[0108]通常，本發(fā)明的方法包括向受試者施用包含治療有效量的式（I)化合物或其藥學 上可接受的鹽的藥物組合物。在一些實施方案中，本發(fā)明方法包括向腫瘤細胞施用有效量 的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽。在一些實施方案中，式I化合物是：
(I)， 其中R1、R2、R3和R4獨立地為H、乙?；被?、鹵素、C0NH 2、0H、CH2CH2Br，其中W1和W2獨立 ttSH、0、02j*X*0H、C0NH0H、C0NH2、C0NHCH2CH20H、C02Et、C02Me、CH20H、 CH2〇COCH2CH2C〇2H、CH2N3、CH2NH2、CH2NHCH2C〇2Me、CH2NHCH2C〇2H、CH 2N = CH-NMe2、 CH2NH⑶CH2NH2、_CH2O -、CH2NHMe、CH2NHCH2CH = CH2、CH2NHCH2CH(OH) CH2O、CH2SMe、CH2S (0) Me、-〇-、
其中Y為0H、0-乙?；蛘遆和Y-起形成環(huán)。
[0109] 在一些實施方案中，R\R2、R3和R4中的至少一個為H。在一些實施方案中，R\R 2、R3 和R4中的至少兩個為H。在一些實施方案中，R\R2、R3和R 4中的至少三個為H。在一些實施方案 中，R\R2、R3和R4中的每一個均為H。在一些實施方案中，W 1和W2中的至少一個為H。在一些實 施方案中，X或Y中的至少一個為0H。在一些實施方案中，X為CH 20H。
[0110] 在一些實施方案中，R\R2、R3和R4中的每一個均為IW 1和W2為H，X為CH20H，并且Y為 0H〇
[0111] 在一些實施方案中，所述化合物是式(II)化合物或其藥學上可接受的鹽：
[0112] 這樣的化合物在本文中通常被稱為"來他替尼"、"CEP-701"、"KT-5555"、"SPM-924"。這樣的化合物和制備該化合物的方法在美國專利號4923986、PCT公開號 TO2007075307、W02008086510中描述，所有這些參考文獻均通過引用并入于此。通常，來他 替尼可以配制成藥學上可接受的游離堿或鹽的形式。本文描述了藥學上可接受的鹽。
[0113] 式I或式II化合物(例如，來他替尼）可通過若干供應商購買以供制備所述藥物組 合物。例如，來他替尼在CAS登錄庫中列出（CAS號111358-88-4)。來他替尼可以購自例如 Tocris Biosciences(目錄號3395)、LC Laboratories)目錄號L-6307)、Cayman Chemical (目錄號 12094 )、Bio Vi si on，Inc ?(目錄號 1805-1000)和 Santa Cruz Biotech (目錄號 sc-218657)等。在一些實施方案中，式I或式11化合物或包含該化合物的藥物組合物可由 Cephalon, Inc ?或Abbott Laboratories，Inc ?制備。
[0114] 藥物組合物
[0115] 通常，本發(fā)明的方法使用包含治療有效量的來他替尼的藥物組合物。包含有效量 的式I或式II化合物的組合物可包含藥學上可接受的載體。該組合物的藥學上可接受的載 體可包括但不限于氨基酸、肽、生物聚合物、非生物聚合物、單糖或淀粉、無機鹽和樹膠，它 們可以單獨地或以其組合存在。在可接受的載體中使用的肽可包括例如明膠和/或白蛋白。 纖維素或其衍生物可以在藥學上可接受的載體中使用。在可接受的載體中使用的糖可以是 乳糖和/或葡萄糖。可在該藥物組合物中使用的其他有用的糖包括但不限于果糖、半乳糖、 乳糖醇（lacticol)、麥芽糖醇、麥芽糖、甘露醇、松三糖、肌醇、palatinate、棉子糖、水蘇糖、 蔗糖、海藻糖、木糖醇、它們的水合物，和它們的組合。藥學上可接受的載體可包含粘合劑。 粘合劑的實例包括但不限于淀粉(例如，玉米淀粉或馬鈴薯淀粉）、明膠;天然的或合成的樹 膠如阿拉伯膠、褐藻酸鈉、粉末狀西黃蓍膠、瓜爾膠、纖維素或纖維素衍生物(例如，甲基纖 維素、乙基纖維素、乙酸纖維素）；微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮和它們的混合物。在可接受 的載體中使用的無機鹽可以是鎂鹽，例如，氯化鎂或硫酸鎂?？梢允褂闷渌麩o機鹽，例如鈣 鹽。鈣鹽的實例包括但不限于氯化鈣、硫酸鈣。可在藥學上可接受的載體中使用的物質(zhì)的其 他實例包括但不限于植物油，如花生油、棉籽油、橄欖油、玉米油；多元醇，如甘油、丙二醇、 聚乙二醇;無熱原水、等滲鹽水、磷酸鹽緩沖溶液;乳化劑，如吐溫權;濕潤劑、潤滑劑、著色 劑、調(diào)味劑、防腐劑。
[0116]術語"濕潤劑"可與"表面活性劑"可互換地使用，并且是指降低液體的表面張力從 而使液體更容易擴散的物質(zhì)?？捎糜谛纬杀景l(fā)明的藥物組合物和劑型的表面活性劑包括但 不限于親水性表面活性劑、親脂性表面活性劑及其混合物。換言之，可以采用親水性表面活 性劑的混合物，可以采用親脂性表面活性劑的混合物，或者可以采用至少一種親水性表面 活性劑和至少一種親脂性表面活性劑的混合物。
[0117] 合適的親水性表面活性劑通常可具有至少10的HLB值，而合適的親脂性表面活性 劑通?？删哂械扔诨蛐∮诩s10的HLB值?？捎糜诒碚鞣请x子兩性分子化合物的相對親水性 和疏水性的有用的參數(shù)是親水親脂平衡值（"HLB"值）。具有較低HLB值的表面活性劑是更疏 水的，并且在油中具有更大的溶解度，而具有較高HLB值的表面活性劑是更親水的，并且在 水溶液中具有更大的溶解度。親水性表面活性劑通常被認為是HLB值大于約10的那些化合 物，以及HLB度量通常不適用的陰離子、陽離子或兩性離子化合物。類似地，親脂性（即，疏水 性)表面活性劑通常被認為是HLB值等于或小于約10的化合物。然而，表面活性劑的HLB值僅 提供了通常用來使得能夠配制工業(yè)、藥物和化妝品乳液的粗略的指導。
[0118] 親水性表面活性劑可以是離子型的或非離子型的。合適的離子型表面活性劑包括 但不限于烷基銨鹽、氨基酸的脂肪酸衍生物、氨基酸的甘油酯衍生物、夫西地酸鹽、寡肽和 多肽、寡肽和多肽、卵磷脂和氫化卵磷脂、溶血卵磷脂和氫化溶血卵磷脂、磷脂及其衍生物、 脂肪酸鹽、溶血磷脂及其衍生物、肉堿脂肪酸酯鹽、烷基硫酸酯的鹽、多庫酯鈉、?；樗狨?(acylactylates)、單甘油酯和二甘油酯的單乙酰化和二乙?；木剖狨?、琥I自?；膯?甘油酯和二甘油酯、單甘油酯和二甘油酯的檸檬酸酯，和它們的混合物。
[0119] 在上述組內(nèi)，離子型表面活性劑包括但不限于卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂、溶血磷 脂及其衍生物、肉堿脂肪酸酯鹽、脂肪酸鹽、烷基硫酸酯的鹽、多庫酯鈉、?；樗狨?、單甘 油酯和二甘油酯的單乙?；投阴；木剖狨ァ㈢牾；膯胃视王ズ投视王?、單 甘油酯和二甘油酯的檸檬酸酯，和它們的混合物。
[0120] 離子型表面活性劑可以是離子化形式的脂肪酸的乳酰酯、卵磷脂、溶血卵磷脂、磷 脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰絲氨酸、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂 酰絲氨酸、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、PEG-磷脂酰乙醇胺、PVP-磷脂 酰乙醇胺、硬脂酰乳酰乳酸酯（8丨631'〇71-2-13(^713丨6)、硬脂酰乳酸酯、琥1自酰化單甘油 酯、單/二甘油酯的單/二乙酰化的酒石酸酯、單/二甘油酯的檸檬酸酯、膽酰肌氨酸 (cholylsarcosine)、己酸酯、辛酸酯、癸酸酯、月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、油酸酯、亞 油酸酯、亞麻酸酯、硬脂酸酯、蓖麻油酸酯、十二烷基硫酸酯、十四烷基硫酸酯（teracecyl sulfate)、多庫酯、月桂酰肉堿、棕櫚酰肉堿、肉豆蔻酰肉堿以及它們的鹽和混合物。
[0121] 親水性非離子型表面活性劑可包括但不限于烷基葡萄糖苷，烷基硫代葡萄糖苷， 烷基麥牙糖甘，十^烷基聚乙^醇甘油醋，聚氧化稀烷基釀如聚乙^醇烷基釀，聚氧化稀燒 基酚如聚乙二醇烷基酚，聚乙二醇甘油脂肪酸酯，聚氧化烯烷基酚脂肪酸酯如聚乙二醇脂 肪酸單酯和聚乙二醇脂肪酸二酯，聚甘油脂肪酸酯，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物及其混 合物，聚氧化烯失水山梨醇脂肪酸酯如聚乙二醇失水山梨醇脂肪酸酯，多元醇與由甘油酯、 植物油、氫化植物油、脂肪酸和留醇組成的組中的至少一個成員的親水性酯交換產(chǎn)物，聚氧 乙烯留醇及其衍生物或類似物，聚氧乙烯化維生素及其衍生物，聚乙二醇失水山梨醇脂肪 酸酯，以及多元醇與由甘油三酯、植物油和氫化植物油組成的組中的至少一個成員的親水 性酯交換產(chǎn)物。該多元醇可以是甘油、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇、丙二醇、季戊四醇或糖 類。
[0122] 其他親水性非離子型表面活性劑包括但不限于TOG-10月桂酸酯、PEG-12月桂酸 酯、PEG-12油酸酯、PEG-15油酸酯、PEG-20油酸酯、PEG-20月桂酸酯、PEG-32二月桂酸酯、 PEG-32月桂酸酯、PEG-20二油酸酯、PEG-32油酸酯、PEG-200油酸酯、PEG-400油酸酯、PEG-15 硬脂酸酯、PEG-32二硬脂酸酯、PEG-40硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯、PEG-20二月桂酸酯、 PEG-25甘油基三油酸酯、PEG-32二油酸酯、PEG-20甘油基月桂酸酯、PEG-20三油酸酯、PEG-30甘油基月桂酸酯、PEG-20甘油基硬脂酸酯、PEG-20甘油基油酸酯、PEG-30甘油基油酸酯、 PEG-30甘油基月桂酸酯、PEG-40甘油基月桂酸酯、PEG-50氫化蓖麻油、PEG-40蓖麻油、PEG-35蓖麻油、PEG-60蓖麻油、PEG-40棕櫚仁油、PEG-40氫化蓖麻油、PEG-60氫化蓖麻油、PEG-60 玉米油、PEG-6癸酸/辛酸甘油酯、PEG-8癸酸/辛酸甘油酯、聚甘油基-10月桂酸酯、PEG-30膽 固醇、PEG-25植物甾醇、PEG-30大豆甾醇、PEG-40失水山梨醇油酸酯、PEG-80失水山梨醇月 桂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、P0E-9十二烷基醚、POE-23十二烷基醚、P0E-10油醚、 P0E-20油醚、P0E-20硬脂醚、生育酚PEG-100琥珀酸酯、PEG-24膽固醇、聚甘油基-10油酸酯、 吐溫40、吐溫60、蔗糖單硬脂酸酯、蔗糖單月桂酸酯、蔗糖單棕櫚酸酯、PEG10-100壬基苯酚 系列、PEG15-100辛基苯酚系列和泊洛沙姆。
[0123] 合適的親脂性表面活性劑包括但不限于脂肪醇，甘油脂肪酸酯，乙酰化甘油脂肪 酸酯，低級醇脂肪酸酯，丙二醇脂肪酸酯，失水山梨醇脂肪酸酯，聚乙二醇失水山梨醇脂肪 酸酯，留醇和留醇衍生物，聚氧乙烯化留醇和留醇衍生物，聚乙二醇烷基醚，糖醚，糖酯，多 元醇與由甘油酯、植物油、氫化植物油、脂肪酸和留醇組成的組中的至少一個成員的疏水性 酯交換產(chǎn)物，油溶性維生素/維生素衍生物，單甘油酯和二甘油酯的乳酸衍生物，以及它們 的混合物。在該組內(nèi)，優(yōu)選的親脂性表面活性劑包括甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯及其混 合物，或者是多元醇與由植物油、氫化植物油和甘油三酯組成的組中的至少一個成員的疏 水性酯交換產(chǎn)物。
[0124] 可在所述藥物組合物中使用的潤滑劑包括但不限于瓊脂、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、礦 物油、輕質(zhì)礦物油、甘油、山梨糖醇、甘露醇、聚乙二醇、其他二醇、硬脂酸、月桂基硫酸鈉、滑 石、氫化植物油（例如，花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油）、硬脂酸 鋅、油酸乙酯、乙基月桂酸酯或它們的混合物。舉例而言，另外的潤滑劑包括syloid硅膠、合 成二氧化硅的凝聚型氣溶膠或它們的混合物?？扇芜x地以小于藥物組合物的約1重量％的 量添加潤滑劑。
[0125] 所述組合物可包含增溶劑以確?；衔锏牧己萌芙獠p少本發(fā)明的化合物的沉 淀。增溶劑可用來提高化合物或其他活性成分的溶解度，或可用來使組合物保持為均勻的 溶液或分散體。合適的增溶劑的實例包括但不限于醇和多元醇如乙醇、異丙醇、聚乙烯醇、 明膠、甘露醇、羧甲基纖維素鈉(CMCNa)、聚維酮、丙二醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、 環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物，分子量平均約200至約6000的聚乙二醇醚如PEG，酰胺和其他含氮 化合物如2-吡咯烷酮、2-哌啶酮、e-己內(nèi)酰胺、N-烷基吡咯烷酮、N-羥烷基吡咯烷酮、N-烷基 哌啶酮、N-烷基己內(nèi)酰胺、二甲基乙酰胺和聚乙烯吡咯烷酮;酯如丙酸乙酯、檸檬酸三丁酯、 乙酰檸檬酸三乙酯、乙酰檸檬酸三丁酯、檸檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、三 乙酸甘油酯、丙二醇單乙酸酯、丙二醇二乙酸酯、己內(nèi)酯及其異構體、戊內(nèi)酯及其異構 體、丁內(nèi)酯及其異構體，以及本領域中已知的其他增溶劑如二甲基乙酰胺、異山梨醇二甲 醚、N-甲基吡咯烷酮、單辛精、二乙二醇單乙醚、水或它們的混合物和/或組合。
[0126] 還可以使用增溶劑的混合物。實例包括但不限于油酸乙酯、辛酸乙酯、三乙酸甘油 酯、檸檬酸三乙酯、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羥乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、 羥丙基甲基纖維素、羥丙基環(huán)糊精、乙醇、聚乙二醇200-100、卡必醇(transcutol)、丙二醇、 四氫呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)和二甲基異山梨醇酯。特別優(yōu)選的增溶劑包括山梨糖 醇、甘油、三乙酸甘油酯、乙醇、PEG-400、四氫呋喃聚乙二醇醚和丙二醇。
[0127] 可包含的增溶劑的量沒有特別限制?？蓪⒔o定的增溶劑的量限制為生物可接受的 量，這可由本領域技術人員容易地確定。在一些情況下，包含遠超過生物可接受量的量的增 溶劑可能對于例如最大化藥物的濃度是有利的，其中在向受試者提供該組合物之前使用常 規(guī)技術如蒸餾或蒸發(fā)去除過量的增溶劑。因此，基于藥物和其他賦形劑的合并重量，增溶劑 (如果存在)可以是按重量計10%、25%、50%、75%、100%或最高約200%的重量比。如果需 要，也可以使用極小量的增溶劑，如5%、2%、1%、0.5%或甚至更少。一般而言，增溶劑可以 以按重量計約1 %至約100 %，更典型地約5 %至約25 %的量存在。
[0128] 所述組合物可包含一種或多種藥學上可接受的添加劑，該添加劑可包括但不限于 防粘劑、消泡劑、緩沖劑、抗氧化劑、聚合物、防腐劑、螯合劑、增味劑、遮光劑、懸浮劑、填充 劑、增塑劑和它們的混合物。
[0129] 在一些實施方案中，按w/w、w/v或v/v計，藥學上可接受的載體包括藥物組合物的 大于90 %、大于80 %、大于70 %、大于60 %、大于50 %、大于40 %、大于30 %、大于20 %、大于 10%、大于9 %、大于8 %、大于6%、大于5%、大于4 %、大于3%、大于2%、大于1 %、大于 0.5%、大于0.4%、大于0.3%、大于0.2%、大于0.1%、大于0.09%、大于0.08%、大于 0.07%、大于0.06%、大于0.05%、大于0.04%、大于0.03%、大于0.02%、大于0.01 %、大于 0.009%、大于0.008 %、大于0.007 %、大于0.006 %、大于0.005 %、大于0.004 %、大于 0.003 %、大于 0.002 %、大于 0.001 %、大于 0.0009 %、大于 0.0008%、大于 0.0007 %、大于 0.0006%、大于0.0005%、大于0.0004%、大于0.0003%、大于0.0002%或大于0.0001 %。
[0130] 在一些實施方案中，按w/w、w/v或v/v計，所述組合物中式I或式II化合物的濃度包 括藥物組合物的小于100%、小于90%、小于80%、小于70%、小于60%、小于50%、小于 40%、小于30 %、小于20 %、小于10 %、小于9 %、小于8 %、小于6 %、小于5 %、小于4%、小于 3 %、小于2 %、小于1 %、小于0.5 %、小于0.4 %、小于0.3 %、小于0.2 %、小于0.1 %、小于 0.09%、小于0.08%、小于0.07%、小于0.06%、小于0.05%、小于0.04%、小于0.03%、小于 0.02%、小于0.01 %、小于0.009 %、小于0.008 %、小于0.007 %、小于0.006 %、小于 0.005 %、小于 0? 004%、小于 0.003 %、小于 0.002 %、小于 0.001 %、小于 0.0009 %、小于 0 ? 0008 %、小于0 ? 0007 %、小于0 ? 0006 %、小于0 ? 0005 %、小于0 ? 0004 %、小于0 ? 0003 %、小 于0.0002%或小于0.0001 %。
[0131 ]在一些實施方案中，按w/w、w/v或v/v計，式I或式II化合物的濃度在藥物組合物的 約0.0001 %至約50 %、約0.001 %至約40 %、約0.01 %至約20%、約0.02 %至約29 %、約 0.03%至約28%、約0.04% 至約27%、約0.05%至約 26%、約0.06%至約25 %、約0.07% 至 約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1 %至約21 %、約0.2 %至約20 %、約 0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約 15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%或約1 %至約10%的范圍內(nèi)。
[0132]在一些實施方案中，按w/w、w/v或v/v計，式I或式II化合物的濃度在藥物組合物的 約0.0001 %至約5%、約0.001 %至約4%、約0.01 %至約2%、約0.02%至約1 %或約0.05% 至約0.5%的范圍內(nèi)。
[0133] 在一些實施方案中，所述藥物組合物中式I或式II化合物的量為約O.OOOOlmg、 0?0001mg、0?001mg、0?005mg、0?01mg、0?05mg、0?lmg、0?25mg、0?5mg、lmg、2mg、4mg、8mg、 10mg、12mg、14mg、16mg、18mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、 70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、 450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、lg、1.lg、 1.2g、l.3g、l.4g、l.5g、l.6g、l.7g、l.8g、l.9g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g、5g、6g、7g、8g、 9g或10g〇
[0134] 以下描述了藥物組合物的一些非限制性實例。
[0135] 用于口服施用的藥物組合物
[0136] 可配制包含有效量的式I或式II化合物的藥物組合物用于口服施用。在一些實施 方案中，用于口服施用的包含有效量的式I或式II化合物的藥物組合物是固體藥物組合物。 在一些實施方案中，該固體藥物組合物可以呈現(xiàn)為離散的（例如，單位）口服劑型。離散口服 劑型的非限制性實例包括片劑、膠囊、囊片、明膠膠囊、持續(xù)釋放制劑、錠劑、薄膜、棒棒糖 (1〇11 ipops)和口 香糖。
[0137] 離散口服劑型如片劑可通過已知技術進行包衣，以延遲或延長在胃腸道中的吸 收，從而提供一段較長時間的持續(xù)作用。在一些實施方案中，式I或式II化合物與一種或多 種惰性固體稀釋劑如碳酸鈣或磷酸鈣混合。在一些實施方案中，式I或式II化合物呈現(xiàn)為軟 明膠膠囊，其中該化合物例如與水或油介質(zhì)如花生油或橄欖油混合。
[0138] 在一些實施方案中，用于口服施用的包含有效量的式I或式II化合物的藥物組合 物是液體藥物組合物。用于口服施用的液體組合物的非限制性實例包括親水性懸浮液、乳 液、液體、凝膠、糖漿、漿液、溶液、酏劑、軟膠囊、酊劑和水凝膠。在一些實施方案中，用于口 服施用的包含有效量的式I或式II化合物的固體或液體組合物包含各種甜味劑或調(diào)味劑或 著色劑。著色劑的實例包括適用于食物的染料，如那些被稱為F.D.&C.的染料，和天然著色 劑，如葡萄皮提取物、甜菜紅粉末、0胡蘿卜素、胭脂樹、洋紅、姜黃、紅辣椒等。也可以使用任 何上述有色化合物的衍生物、類似物和異構體。
[0139] 這樣的劑型可通過本領域例如藥學領域技術人員公知的方法來制備。這樣的方法 將包括使式I或式II化合物與藥學上可接受的載體結合。
[0140] 本發(fā)明進一步包括包含有效量的式I或式II化合物的無水藥物組合物和劑型，因 為水可促進該化合物的降解。在一些實施方案中，使用無水或低水分含量的成分制備本發(fā) 明的無水藥物組合物和劑型。在一些實施方案中，在低濕度或低水分條件下制備本發(fā)明的 無水藥物組合物和劑型。如果預期在生產(chǎn)、包裝和/或儲存過程中與水分和/或濕度實質(zhì)接 觸，則可將含有乳糖的本發(fā)明藥物組合物制備成無水的?？芍苽洳Υ姘行Я康氖絀或 式II化合物的無水藥物組合物，使得維持其無水的性質(zhì)。例如，可使用已知防止暴露于水的 材料包裝該無水組合物，使得它們可被包含在合適的處方藥劑盒中，該藥劑盒的實例包括 但不限于密封的箱、塑料等，單位劑量容器，泡罩包裝和條帶包裝。
[0141] 用于注射或腸胃外施用的藥物組合物
[0142] 在一些方面，所述藥物組合物被配制用于腸胃外施用。"腸胃外施用"通常是指除 了胃腸道以外的施用途徑。腸胃外施用的實例包括但不限于靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌內(nèi)注 射、輸注或植入。輸注可以是皮內(nèi)或皮下輸注，或通過經(jīng)皮植入物進行。用于腸胃外施用的 示例性藥物組合物在通過引用并入于此的以下文獻中公開：美國專利申請公開號2006/ 0287221，美國專利號5244925、4309421、4158707和5164405,所有這些文獻均通過引用并入 于此。
[0143] 配制用于腸胃外施用的組合物可包括常用于注射和/或輸注的水性溶液和/或緩 沖液。常用的水性緩沖液和/或溶液可包括但不限于約〇. 9%的氯化鈉溶液、磷酸鹽緩沖液、 乳酸林格氏溶液(Lactated Ringer's solution)、乙酸林格氏溶液(Acetated ringer's solution)、磷酸鹽緩沖鹽水、檸檬酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、組氨酸緩沖液、HEPES緩沖液、 甘氨酸緩沖液、N-甘氨酰甘氨酸(N-glycylglycine)緩沖液等。用于腸胃外施用的其他藥學 上可接受的載體可包括乙醇、甘油、丙二醇、環(huán)糊精和環(huán)糊精衍生物、植物油等。
[0144] 在一些實施方案中，藥物組合物注射液和/或輸注液包含以有效防止或減少微生 物污染或降解的量存在的防腐劑。多種試劑，例如，苯酚、間甲酚、芐醇、對羥基苯甲酸酯、氯 丁醇、甲氨蝶呤、山梨酸、硫柳汞（thimerosol)、羥苯乙酯、三溴酚鉍、羥苯甲酯、桿菌肽、羥 苯丙酯、紅霉素、5-氟尿嘧啶、阿霉素、米托蒽醌、利福霉素、氯甲酚、苯扎氯銨可以用來防止 或減少污染。
[0145] 在一些實施方案中，通過將所需量的式I和/或II化合物引入具有如本文所述的各 種其他成分的合適溶劑中，然后根據(jù)需要過濾除菌來制備無菌溶液。通常，通過將各種無菌 活性成分引入含有基本分散介質(zhì)和來自以上列舉的那些的所需其他成分的無菌載體中來 制備分散體。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，某些制備方法包括但不限 于真空干燥和冷凍干燥技術，該技術由活性成分以及任何附加所需成分的先前無菌過濾的 溶液產(chǎn)生活性成分加任何附加所需成分的粉末。
[0146] 其他藥物組合物。
[0147] 本發(fā)明采用的藥物組合物可配制用于眼內(nèi)、局部、直腸或鼻內(nèi)施用。適合于眼內(nèi)施 用的制劑包括滴眼劑，其中活性成分溶解或懸浮于合適的載體中，尤其是用于活性成分的 水性溶劑中。該活性成分優(yōu)選以〇. 5 %至20 %、有利地0.5 %至10 %、特別是約1.5 % w/w的濃 度存在于這樣的制劑中。適合于局部施用例如在口中施用的制劑包括在調(diào)味基質(zhì)一通常是 蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠一中包含活性成分的錠劑;在惰性基質(zhì)如明膠和甘油，或蔗糖和 阿拉伯膠中包含活性成分的軟錠劑；以及在合適的液體載體中包含活性成分的漱口藥。用 于直腸施用的制劑可以呈現(xiàn)為具有合適的基質(zhì)的栓劑，該基質(zhì)包含例如可可脂或水楊酸 鹽。適合于肺內(nèi)或經(jīng)鼻施用的制劑可具有例如在0.1至500微米范圍內(nèi)的顆粒大小(包括以 微米增量如〇.5、1、30微米、35微米等處于0.1至500微米范圍內(nèi)的顆粒大?。撝苿┩ㄟ^經(jīng) 由鼻腔通道快速吸入或通過經(jīng)由口腔吸入以到達肺泡囊而施用。合適的制劑包括活性成分 的水性或油性溶液。適合于氣霧劑或干燥粉末施用的制劑可根據(jù)常規(guī)方法制備，并可與其 他治療劑如此前在以下所述癌性感染的治療或預防中使用的化合物一起遞送。這樣的藥物 組合物的制備例如在Anderson,Philip 0.;Knoben,James E.;Troutman,William G編著， Handbook of Clinical Drug Data,第十版，McGraw-Hill, 2002;Pratt 和Taylor 編著， Principles of Drug Action,第三版，Churchill Livingston,New York, 1990；KatzungH) 著，Basic and Clinical Pharmacology,第九版，McGraw Hill, 20037ybg;Goodman 和 Gilman 編著，The Pharmacological Basis of Therapeutics，第十版，McGraw Hill，2001; Remingtons Pharmaceutical Sciences,第20版，Lippincott ffilliams&ffilkins.,2000； Martindale，The Extra Pharmacopoeia，第三十二版（The Pharmaceutical Press , London，1999)中描述;所有這些文獻均通過引用以其全文并入本文。
[0148] 示例性的治療方案和施用途徑
[0149] 本發(fā)明的各種化合物或藥物組合物的施用可通過能夠?qū)⒃摶衔镞f送至作用部 位的任何方法進行?？煽诜?、腹膜內(nèi)、腸胃外、眼內(nèi)、局部、直腸或鼻內(nèi)施用該組合物。在一些 實施方案中，口服施用該組合物。在一些情況下，口服施用可包括施用如本文所述的任何口 服劑型。施用的式I或式II化合物的有效量將依賴于正在治療的受試者，病癥或病況的嚴重 程度，施用速率，該化合物的性質(zhì)(disposition)和處方醫(yī)生的判斷。受試者可施用日劑量 的來他替尼。該日劑量可以為每天約〇.〇lmg/kg至約100mg/kg體重。該日劑量可以為每天約 0.0111^/1^至1011^/1^體重。成人的日劑量可以為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、 20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、200、300、400、 500、600、700、800、900或100011^。來他替尼可以以一個或多個單位劑型施用，并且還可每天 施用一至十次、一至八次、一至六次、一至四次、一至兩次或每天一次。單位劑型可包含約 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、200、300、400、500、600、 700、800、900或lOOOrng的來他替尼。
[0150 ] 來他替尼的劑量還可以為濃度為15至2 5mg/mL、16mg/mL或2 5mg/mL的液體或懸浮 液的形式。來他替尼的液體或懸浮液劑型可包括上述劑量(mg)的等效劑量。例如，來他替尼 的劑量可包括 1至 5mL 的25mg/mL 溶液，或1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、 3.4、3.6、3.8或4mL的25mg/mL溶液，其中60mg劑量的來他替尼可提供于2.4mL的溶液中， 80mg劑量的來他替尼可提供于3.2mL的溶液中，并且100mg劑量的來他替尼可提供于4mL的 溶液中。此外，20mg劑量的來他替尼可以由1.25mL的16mg/mL溶液提供。
[0151] 在一些實施方案中，施用可包括輸注。在一些情況下，輸注可包括長期穩(wěn)定的給 藥。用于長期穩(wěn)定（即，通過控制栗）給藥的裝置是本領域已知的（實例可在US 7341577、 US7351239、US8058251中描述，這些文獻通過引用并入本文）。
[0152] 只要需要，即可持續(xù)施用本發(fā)明的化合物。在一些實施方案中，施用本發(fā)明的化合 物多于1、2、3、4、5、6、7、14或28天。在一些實施方案中，施用本發(fā)明的化合物多于1個月、多 于2個月、多于4個月、多于6個月、多于1年、多于2年或多于5年。在一些實施方案中，施用本 發(fā)明的化合物少于1個月、少于2個月、少于4個月、少于6個月、少于1年、少于2年或少于5年。 在一些實施方案中，施用本發(fā)明的化合物少于28、14、7、6、5、4、3、2或1天。在一些實施方案 中，不間斷地長期施用本發(fā)明的藥劑，例如，用于治療或預防與升高的SP0P底物水平或其途 徑活性相關的疾病。
[0153] 本領域已知，由于化合物藥代動力學的受試者間差異，給藥方案的個性化和/或調(diào) 整對于最優(yōu)療法可能是必要的。在一些實施方案中，選擇劑量以在受試者中達到約0.05至 20iig/mL或約1至20iig/mL來他替尼的血清水平。
[0154] 示例性的聯(lián)合療法
[0155] 在一些實施方案中，所述方法包括共同施用其他藥劑和包含來他替尼的藥物組合 物。其他藥劑可以是:小分子、營養(yǎng)物、維生素例如維生素D、藥物、前藥、生物制劑、肽、肽模 擬物、抗體、抗體片段、細胞或組織移植物、疫苗、多核苷酸、DNA分子、RNA分子（即，s iRNA、 miRNA)、與藥物綴合的抗體、毒素、融合蛋白。可通過載體遞送藥劑，該載體包括但不限于質(zhì) 粒載體、病毒載體、非病毒載體、脂質(zhì)體制劑、納米顆粒制劑、毒素、治療性放射性同位素等。
[0156] 在一些實施方案中，所述其他藥劑是抗腫瘤劑?？鼓[瘤劑的非限制性實例包括微 管蛋白相互作用劑、拓撲異構酶抑制劑和藥劑、阿曲汀(acitretin)、雞骨常山堿、氨萘非 特、amphethinile、安吖啶、ankinomycin、抗腫瘤物質(zhì)、阿非迪霉素甘氨酸鹽、天冬酰胺酶、 燕茜素、batracylin、苯氟隆(benf luoron)、氯苯酰色氨酸、溴硫磷酰胺(bromofosfamide)、 卡醋胺、鹽酸卡美噻唑（carmethizole hydrochloride)、氯硫喹喔酮 (chlorsulfaquinoxalone)、克蘭氟脲、claviridenone、克立那托、curaderm、阿糖胞苷、 cytocytin、達卡巴嗪、達替氯銨（datelliptinium)、二血B卜啉醚、二氫侖哌隆 (dihydrolenperone)、地那林、偏端霉素、多西紫杉醇、elliprabin、依利醋銨、埃博霉素、麥 角胺、依托泊苷、依曲替酯、維甲酰酚胺、硝酸鎵、芫花瑞香寧、十六烷膽堿磷酸、HDAC抑制 劑、高三尖杉酯堿、羥基脲、伊莫福新、異谷酰胺、異維甲酸、白細胞調(diào)節(jié)素（leukoregulin)、 氯尼達明、美巴龍（merbarone)、部花青（merocyanlne)衍生物、甲基苯胺B丫啶 (methylanilinoacridine)、滅活素(minactivin)、米托萘胺、米托喹酮、米托蒽醌、莫哌達 醇、莫維A胺、N-(視黃?；?氨基酸、N-?；?脫氫丙氨酸、那法扎瓊、諾考達唑衍生物、奧曲 肽、oquizanocine、紫杉醇、水鬼蕉堿(pancratistatin)、帕折普汀、吡羅蒽醌、聚血卟啉、 po 1 ypreic acid、嗎丙嗪、甲基節(jié)肼、丙谷胺、丙亞胺、瑞替普汀、spato 1、螺環(huán)丙烷衍生物、 螺鍺（spirogermanium)、strypoldinone、超氧化物歧化酶、替尼泊苷、菌體胚素、生育三稀 酸、拓撲替康、ukrain、硫酸長春堿、長春新堿、長春地辛、vinestramide、長春瑞濱、長春曲 醇、長春利定和睡前交酯。
[0157] 在一些實施方案中，所述其他藥劑是抗癌劑。抗癌劑的非限制性實例包括醋孟南、 阿柔比星、阿地白介素、阿侖珠單抗、阿利維甲酸、六甲蜜胺、氨磷汀、安吖啶、阿那格雷、阿 那曲唑、安西司亭、貝沙羅汀、溴尿苷、卡培他濱、西莫白介素、西曲瑞克、克拉屈濱、克霉唑、 達珠單抗、右雷佐生、地拉卓、二十二醇、去氧氟尿苷、溴麥角環(huán)肽、卡莫司汀、阿糖胞苷、雙 氯芬酸、依地福新、依決洛單抗、依氟鳥氨酸、乙嘧替氟、依西美坦、依昔舒林、法倔唑、紅細 胞生成素、非格司亭、非那雄胺、磷酸氟達拉濱、福美坦、福莫司汀、硝酸鎵、吉西他濱、 glycopine、庚鉬(heptaplatin)、伊班膦酸、咪喹莫特、碘節(jié)胍、伊立替康、伊索拉定、蘭瑞 肽、來氟米特、來格司亭、香菇多糖硫酸酯、來曲唑、利阿唑、洛鉑、氯尼達明、馬索羅酚、美拉 胂醇、甲氧氯普胺、米非司酮、米替福新、米立司亭、米托胍腙、二溴衛(wèi)矛醇、莫拉司亭、那法 瑞林、那托司亭、奈達鉑、尼魯米特、那可丁、奧普瑞白介素、奧沙特隆、奧沙利鉑、帕米膦酸、 培門冬酶、木聚硫鈉、噴司他丁、畢西巴尼(picibanil)、吡柔比星、n卜吩姆鈉、雷洛昔芬、雷 替曲塞、拉布立酶、利妥昔單抗、羅莫肽、沙格司亭、西佐喃(sizofuran)、索布佐生、索納明、 舒拉明、他索納明、他扎羅汀、替加氟、替莫泊芬、替莫唑胺、替尼泊苷、四氯十烷氧化物 (tetrachlorodecaoxide)、沙利度胺、血小板生成素、胸腺法新、促甲狀腺激素a、拓撲替康、 托瑞米芬、曲妥珠單抗、曲奧舒凡、維甲酸、曲洛司坦、三甲曲沙、烏苯美司、戊柔比星、維替 泊芬和長春瑞濱。
[0158] 在一些實施方案中，所述其他藥劑是抗雄激素。示例性的抗雄激素包括比卡魯胺、 氟他胺、螺內(nèi)酯、醋酸環(huán)丙孕酮、非那雄胺、度他雄胺、恩雜魯胺(enzalutamide)、酮康唑、阿 比特龍、galeterone和尼魯米特。
[0159] 在一些實施方案中，所述其他藥劑是促進自噬的藥劑。該自噬促進劑可以是mTOR 或mTOR途徑抑制劑。示例性的mTOR和/或mTOR途徑抑制劑包括但不限于雷帕霉素、坦西莫 司、umirolimus、佐他莫司、TOR 激酶抑制劑如 0SI-027、INK-128、AZD-8055、AZD-2014、 Palomid 529^Pp-242^BEZ235^AZD-8055^BGT226^XL765^GDC-0980^GSK2126458^PF-04691502、PF-05212384類似物或其衍生物。
[0160] 在一些實施方案中，所述其他藥劑是PI3K抑制劑。示例性的PI3K抑制劑包括但不 限于3卩1126、5卩1101、8￡2235、8碰120、8丫1719、861'-226、父1-147、60(：-0941、251'1(-474、？父-866、60〇0980、？1(1-587、？卩-04691502、8訂33597、？1-103、0八1-101、6陬-477或其任意衍生 物。
[0161] 其他藥劑和來他替尼的劑量可根據(jù)采用的附加治療劑的類型，根據(jù)正在治療的疾 病或病況等而不同?？梢允褂脕喼委熈康钠渌巹┖蛠硭婺嶂械囊环N或兩種?？梢允褂?治療有效量的其他藥劑和來他替尼中的一種或兩種。可以同時或依序施用來他替尼和其他 藥劑。如果依序施用，則主治醫(yī)生或照護者可以決定施用該化合物和該附加治療劑的適當 順序。
[0162] 藥劑盒
[0163] 本發(fā)明還提供了藥劑盒。本發(fā)明的藥劑盒可以包含在合適的包裝中的至少一個或 多個單位劑量的本文所述藥物組合物，以及關于在實施一種或多種本發(fā)明方法中使用的說 明。這樣的藥劑盒還可以包含諸如科學參考文獻、包裝插頁材料、臨床試驗結果和/或這些 的概要等信息，該信息指示或表明了該組合物的活性和/或優(yōu)勢，和/或描述了給藥、施用、 副作用、藥物相互作用或?qū)︶t(yī)療保健提供者有用的其他信息。這些信息可以基于各種研究 的結果，例如使用涉及體內(nèi)模型的實驗動物的研究和基于人臨床試驗的研究。該藥劑盒可 以進一步含有另一種藥劑。在一些實施方案中，本發(fā)明的化合物和所述藥劑作為單獨的組 成物在藥劑盒內(nèi)的單獨容器中提供。在一些實施方案中，本發(fā)明的化合物和所述藥劑作為 單一組合物在藥劑盒中的容器內(nèi)提供。合適的包裝的實例包括但不限于密封的箱、塑料等， 單位劑量容器，泡罩包裝和條帶包裝。
[0164] 實施例
[0165] 實施例1:材料與方法
[0166] 材料和細胞系:前列腺癌、乳腺癌和胃癌細胞系和它們的來源示于下表中。各個腫 瘤細胞系的生長條件按照ATCC的建議在后續(xù)表格中示出。將星形孢菌素(來自Sigma，目錄 號S4400-lmg，批號017k4059)和來他替尼（來自 Sigma，目錄號C7869-lmg，批號072M4750V) 溶解在DMS0( Sigma)中。

[0167]細胞增殖試驗:使用MTT試驗測定來他替尼對前列腺癌細胞的生長抑制。將細胞以 60%的匯合度接種在96孔板中，并在奶'1'試驗之前與0.1%01^0(對照）、10、30、100、300、 1000、3000nM來他替尼一起溫育48小時。來他替尼的每個濃度重復至少3次以使變異最小 化。將MTT試劑（Promega?的CellTiter96?Aqueous One Solution Reagent)與DMEM培養(yǎng)基 混合，并用吸液管將i〇〇yl的該混合物移入每個孔中。培養(yǎng)基的顏色從黃色/棕色變?yōu)樯钭?色，這指示MTS四唑鐵轉化為甲.騰。隨后通過酶標儀(plate reader)SpectraMax M5對甲勝 定量。還獲得了僅含有MTT混合物的空白孔以用于背景減除。
[0168]細胞裂解物的蛋白質(zhì)分析:使用BioRad蛋白質(zhì)分析試劑通過比色法測定蛋白質(zhì)濃 度。簡而言之，將2yL細胞裂解物與lmL 1:5稀釋的試劑混合，并通過SmartSpec 3000?分光 光度計（Bio Rad)測量0D595。使用4-20%Criterion? TGX?預制凝膠，通過SDS-PAGE(十二 烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析等量的蛋白質(zhì)。添加預染色的蛋白質(zhì)標準物以供與 樣品共迀移，以估算分子量。一旦電泳完成，將蛋白質(zhì)從凝膠轉移至硝酸纖維素膜，以供 Western印跡分析。使用麗春紅S(Ponceau S)將蛋白質(zhì)染色。首先將膜與在TBST(Tris緩沖 鹽水-吐溫20)中的5%牛奶一起溫育以阻斷非特異性結合1小時，然后與一抗（1:1000稀釋） 一起溫育過夜。在用TBST將膜洗滌3次各30分鐘之后，添加辣根過氧化物酶綴合的抗兔二抗 以另外溫育60min。使用化學發(fā)光和X射線膠片檢測條帶。針對SRC-3的兔多克隆抗體(5E11) 購自 Cell Signaling Technology (Boston，MA)。針對 PRK1 (07-557)的兔多克隆抗體來自 Upstate/Millipore(Billerica，MA)〇
[0169] 亞細胞分級分離:進行亞細胞分級分離以從細胞中分離細胞核和細胞質(zhì)。將PC3、 DU145和LNCaP細胞與0.1%DMS0(對照）或lyM來他替尼一起溫育6小時，之后收獲用于亞細 胞分級分離。將含有ImM EDTA(乙二胺四乙酸）、0. lx PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)和一系列蛋白 酶體抑制劑的低滲裂解緩沖液添加至細胞5min。通過用結核菌素注射器的27G針剪切25次， 將細胞刮掉并打碎。首先通過在4 °C下以3，OOOrpm離心10分鐘使細胞核沉淀，隨后將上清液 在4°C下以15,000rpm離心10分鐘，并使用該上清液作為細胞質(zhì)。全細胞裂解物、細胞核級分 和細胞質(zhì)級分用于蛋白質(zhì)分析和Western印跡分析。針對微管蛋白、肌動蛋白和組蛋白的抗 體用于加樣和定位對照。
[0170] 實施例2:搜索SP0P底物
[0171] SP0P依賴性蛋白質(zhì)降解的PubMed搜索揭示了 SRC_3、Daxx和Gli是SP0P的已知底物 (J Biol Chem.2006；281:12664-72,Oncogene 2011；30:435〇-64,Dev Cell.2006；10:719-29)。我們搜索了NCBI數(shù)據(jù)庫，嘗試鑒定參與雄激素受體信號傳導的其他SP0P底物。NCBI中 的結構數(shù)據(jù)庫揭示了三種肽序列可以與SP0P相互作用。這些序列包括：
[0172] KAASADSTTEGTPAD ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=77512)
[0173] NTLFPDVSSSTH ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=77549)
[0174] DEVTSTTSSS ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=77550)
[0175] 所有三種肽序列與先前報道(Proc Natl Acad Sci USA.2009; 106:21191-6)的多 個Ser/Thr繼以酸性殘基的共有序列一致。我們使用該共有序列進行了BLAST搜索，以便鑒 定具有該共有序列的其他蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可能是過去未曾認識到的潛在的SP0P底物。采 用DSTSS的BLAST搜索導致了許多匹配。以下列出了四個示例性的匹配。

通過序列DSSTT進行的另一個BLAST搜索鑒定了 DEK(NCBI參考序列:NP_003463.1) >gi | 4503249 | ref | NP_003463 ? 11 蛋白質(zhì)DEK同種型 1 [智人]
[0176] 實施例3:前列腺癌、乳腺癌和胃癌細胞對來他替尼的敏感性
[0177] 為了考查使用來他替尼治療前列腺癌、乳腺癌、胃癌和其他癌癥的可行性，研究了 具有不同程度的雄激素敏感性的三種前列腺癌細胞系對來他替尼的敏感性:PC3 (雄激素不 敏感的）、DU145(雄激素不敏感的）和LNCaP(雄激素敏感的）（圖2)。還測試了三種乳腺癌細 胞系:MCF7、BT-474和ZR-75-1 (圖 3)，和四種胃癌細胞系:AGS、MKN-45、Hs746T和NCI-N87 (圖 4)，以測定它們對來他替尼的IC5Q，并將其與一種具有更寬的激酶抑制活性的來他替尼類 似--星形孢菌素進行比較。用DMS0(對照)或10、30、100、300、1000或300011]\1來他替尼或星 形孢菌素處理所有腫瘤細胞48小時。隨后進行MTT試驗以測定藥物處理對腫瘤細胞活力的 影響。IC 5Q被確定為達到細胞活力最大減少量的一半時來他替尼的濃度。如圖2至圖4所示， 來他替尼對降低前列腺癌和胃癌細胞的活力是有效的，而乳腺癌細胞對來他替尼更具抗 性，其IC5Q更高。每種腫瘤細胞系的IC5Q匯總在表1中。
[0178] 實施例4: SRC-3和PRK1蛋白在前列腺癌細胞中的表達水平
[0179] 使用Western印跡法，考查在來他替尼處理前后在三種前列腺癌細胞系中SRC-3蛋 白表達的水平。用lyM來他替尼處理LNCaP、DU145和PC3細胞6小時，并收獲用于亞細胞分級 分離。使用不同的抗體，采用Western印跡法分析全細胞裂解物、細胞核級分和胞質(zhì)溶膠級 分。肌動蛋白、微管蛋白和組蛋白-H3用作加樣和定位對照。
[0180] 未處理的LNCaP、PC3和DU145細胞展現(xiàn)了類似的SRC-3蛋白表達水平（圖5,上圖）。 然而，來他替尼處理的LNCaP細胞展現(xiàn)了 SRC-3的極大降低，而在來他替尼處理的PC3和 DU145細胞中的SRC-3蛋白水平?jīng)]有顯著改變（圖5,上圖）。相反，在任何測試的細胞系中來 他替尼處理均沒有顯著改變PRK1蛋白表達水平。
[0181] 實施例5:在細胞核和細胞質(zhì)中SRC-3和PRK1蛋白的變化
[0182] 使用亞細胞分級分離研究考查在三種前列腺癌細胞系中來他替尼處理對SRC-3和 PRK的細胞內(nèi)定位的影響。用lOOOnM來他替尼或?qū)φ蛰d體處理LNCaP、PC3和DU145細胞系6小 時。獲得細胞核和胞質(zhì)溶膠級分并通過Western印跡法對其進行分析。使用的抗體包括SRC- 3、PRK、微管蛋白、組蛋白-H3和肌動蛋白。Western印跡分析揭示，來他替尼處理減少了所有 三種細胞系的細胞質(zhì)中的SRC-3蛋白。相比于來他替尼處理的PC3或DU145細胞，在來他替尼 處理的LNCaP細胞中細胞質(zhì)SRC-3的減少更加顯著（圖5,下圖）。來他替尼處理沒有引起 LNCaP、DU145或PC3細胞中細胞核SRC-3蛋白水平的降低（圖5，下圖）。相反，在所有三種細胞 系中來他替尼處理均增加了細胞核PRK-1蛋白水平，但來他替尼處理沒有改變細胞質(zhì)PRK-1 水平（圖5，下圖）。
[0183] 基于以上數(shù)據(jù)，提出了一種模型（圖6)。在具有正常水平的SP0P活性的細胞中， SP0P底物如Gli、SRC-3和AWP1可通過SP0P依賴性蛋白質(zhì)降解而降解，這調(diào)節(jié)AR活性（左圖， 圖6)。然而，在具有降低的SP0P活性的前列腺癌細胞(例如，具有突變的SP0P的前列腺癌細 胞）中，SP0P對SP0P底物如SRC-3、Gli、AWP1的降解受到損害，導致SP0P底物的積累和增強的 AR和/或促存活途徑活性。發(fā)現(xiàn)來他替尼介導的雄激素依賴性前列腺癌細胞的細胞死亡與 SRC3水平的顯著降低有關，SRC3是一種充當雄激素受體輔激活物的SP0P底物。該數(shù)據(jù)表明， 來他替尼可用來有效治療具有異常高水平的SP0P底物或底物途徑活性的受試者如具有 SP0P突變和/或高SRC3水平的受試者的疾病。這一機理提供了通過阻止該過程來中斷雄激 素受體激活的基于基本原理的方法。
[0184] 實施例6:前列腺癌、乳腺癌和胃癌細胞中的SRC3和DEK蛋白水平的變化 基于它們對來他替尼的敏感性，選擇LNCaP和PC3前列腺癌細胞、MCF7和ZR75-1乳腺癌 細胞以及MKN-45和NCI-N87胃癌細胞來測試在用兩種不同劑量的來他替尼處理前和處理后 24小時的表達水平。選擇實現(xiàn)約40%和70%生長抑制的劑量進行處理并針對Western印跡 法進行檢查。對于圖7顯示的前列腺癌，在較高劑量處理的細胞中SRC3蛋白水平降低，但DEK 蛋白水平?jīng)]有看出明顯變化。對于圖8顯示的乳腺癌，MCF7具有在基線的最高水平的SRC3， 并在來他替尼處理后顯示出最大的劑量依賴性降低。ZR75-1具有低得多的SRC3水平，但在 處理后沒有明顯變化。然而MCF7和ZR75-1細胞在處理后均具有降低的DEK蛋白水平。在圖9 顯示的胃癌中，在采用較高劑量的來他替尼處理后，SRC3表達水平在MKN-45細胞中顯示降 低，但在NCI-N87中沒有降低。如圖9所示，在來他替尼處理后DEK水平?jīng)]有變化。
[0185] 盡管本文中已經(jīng)示出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但對于本領域技術人員顯 而易見的是，這些實施方案僅以示例的方式提供。本領域技術人員在不脫離本發(fā)明的情況 下現(xiàn)將想到多種變化、改變和替代。應當理解，本文中所述的本發(fā)明實施方案的各種替代方 案可用于實施本發(fā)明。目的在于以下述權利要求限定本發(fā)明的范圍，并由此涵蓋這些權利 要求范圍內(nèi)的方法和結構及其等同項。
【主權項】
1. 一種下調(diào)有需要的受試者中的斑點型ΡΟΖ蛋白（SPOP)底物信號傳導的方法，其包括 向該受試者施用包含治療有效量的來他替尼或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物，由此下 調(diào)該受試者中的SP0P底物信號傳導。2. 如權利要求1所述的方法，其中所述底物選自SRCl、SRC2、SRC3、Daxx、Gli、AWP-ldf 蛋白-4B和滯蛋白-7。3. 如權利要求2所述的方法，其中所述底物是SRC1、SRC2或SRC3。4. 如權利要求3所述的方法，其中所述底物是SRC3。5. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述下調(diào)包括降低所述SP0P底物或所述 底物的下游靶標的水平和/或活性。6. 如權利要求5所述的方法，其中所述下游靶標是PRK-1。7. 如權利要求5所述的方法，其中所述下調(diào)包括降低所述SP0P底物的水平和/或活性。8. 如權利要求5所述的方法，其中所述下調(diào)通過來源于所述受試者的細胞中所述下游 靶標活性的降低來呈現(xiàn)。9. 如權利要求5所述的方法，其中所述下調(diào)通過來源于所述受試者的細胞中所述底物 水平的降低來呈現(xiàn)。10. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述水平包括表達水平。11. 如權利要求10所述的方法，其中所述表達水平是蛋白質(zhì)表達水平。12. 如權利要求10所述的方法，其中所述表達水平通過所述SP0P底物的轉錄物的水平 來呈現(xiàn)。13. 如權利要求1所述的方法，其中所述下調(diào)通過所述細胞的胞質(zhì)部分中所述底物水平 的降低來呈現(xiàn)。14. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述受試者呈現(xiàn)出疾病的癥狀。15. 如權利要求14所述的方法，其中所述疾病是前列腺疾病。16. 如權利要求14所述的方法，其中所述疾病是前列腺腫瘤。17. -種治療有需要的受試者的前列腺腫瘤的方法，其包括： (a) 向所述受試者施用第一劑量的藥物組合物，該藥物組合物包含治療有效量的來他 替尼或其藥學上可接受的鹽； (b) 確定來源于所述受試者的生物樣品中的SP0P底物水平或其活性；以及 (c) 如果與未施用包含治療有效量的來他替尼或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物的 對照受試者相比，所述底物水平或其活性降低，則施用額外劑量的所述藥物組合物。18. -種治療受試者的前列腺腫瘤的方法，其包括向所述受試者施用包含治療有效量 的來他替尼或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物，其中與對照受試者相比，所述受試者展 現(xiàn)出異常高的SP0P底物水平或其活性。19. 如權利要求18所述的方法，其中所述異常高的水平通過所述腫瘤中SP0P突變的存 在來呈現(xiàn)。20. 如權利要求19所述的方法，其中所述突變導致所述SP0P氨基酸序列的位置31-161 之間的氨基酸序列改變。21. 如權利要求19所述的方法，其中所述氨基酸序列改變包括氨基酸置換。22. 如權利要求19所述的方法，其中所述突變導致在所述SP0P氨基酸序列的Y87、F102、 5119小125、1(129、1131、？133和/或1(134處的置換。23. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述受試者是人。24. 如權利要求16或18所述的方法，其中所述前列腺腫瘤是雄激素敏感的。25. 如權利要求16或18所述的方法，其中所述前列腺腫瘤是雄激素不敏感的。26. -種下調(diào)前列腺細胞中的SPOP底物水平或其活性的方法，其包括： (a) 向所述細胞施用有效量的來他替尼，由此下調(diào)所述細胞中的SPOP底物或其活性；以 及 (b) 評價所述前列腺細胞中的SPOP底物水平或其活性的下調(diào)。27. 如權利要求26所述的方法，其中所述前列腺細胞是前列腺癌細胞。28. 如權利要求26所述的方法，其中所述前列腺細胞是培養(yǎng)的細胞。29. 如權利要求26所述的方法，其中所述前列腺細胞是雄激素敏感的細胞。30. 如權利要求26所述的方法，其中所述前列腺細胞是LNCaP細胞。31. 如權利要求26所述的方法，其中所述底物選自SRCl、SRC2、SRC3、Daxx、Gli、AWP-l、 滯蛋白-4B和滯蛋白-7。32. 如權利要求31所述的方法，其中所述底物是SRC蛋白。33. 如權利要求32所述的方法，其中所述SRC蛋白是SRC3蛋白。34. 如權利要求26-33中任一項所述的方法，其中所述下調(diào)通過所述細胞中的所述底物 水平的降低來呈現(xiàn)。35. 如權利要求34所述的方法，其中所述表達水平包括蛋白質(zhì)表達水平。36. 如權利要求26-33中任一項所述的方法，其中所述下調(diào)通過所述細胞的胞質(zhì)部分中 所述底物的表達水平的降低來呈現(xiàn)。37. -種藥劑盒，其包含： (a) 藥物組合物的至少一個單位劑型，該藥物組合物包含治療有效量的來他替尼或其 藥學上有效的鹽；以及 (b) 關于實施前述權利要求中任一項所述的方法的說明。38. 如權利要求1所述的方法，其中所述底物是DEK。39. 如權利要求38所述的方法，其中所述下調(diào)包括降低所述SPOP底物或所述底物的下 游靶標的水平和/或活性。40. 如權利要求39所述的方法，其中所述下游靶標是PRK-1。41. 如權利要求39所述的方法，其中所述下調(diào)包括降低所述SPOP底物的水平和/或活 性。42. 如權利要求39所述的方法，其中所述下調(diào)通過來源于所述受試者的細胞中所述下 游靶標活性的降低來呈現(xiàn)。43. 如權利要求39所述的方法，其中所述下調(diào)通過來源于所述受試者的細胞中所述底 物水平的降低來呈現(xiàn)。44. 如權利要求38-43中任一項所述的方法，其中所述水平包括表達水平。45. 如權利要求44所述的方法，其中所述表達水平是蛋白質(zhì)表達水平。46. 如權利要求44所述的方法，其中所述表達水平通過所述SPOP底物的轉錄物的水平 來呈現(xiàn)。47. 如權利要求38-46中任一項所述的方法，其中所述受試者呈現(xiàn)出疾病的癥狀。48. 如權利要求47所述的方法，其中所述疾病是前列腺疾病、乳房疾病或胃病。49. 如權利要求47所述的方法，其中所述疾病是前列腺腫瘤、乳房腫瘤或胃腫瘤。50. 如權利要求14所述的方法，其中所述疾病是乳房疾病或胃病。51. 如權利要求14所述的方法，其中所述疾病是乳房腫瘤或胃腫瘤。52. -種治療有需要的受試者的乳房腫瘤或胃腫瘤的方法，其包括： (a) 向所述受試者施用第一劑量的藥物組合物，該藥物組合物包含治療有效量的來他 替尼或其藥學上可接受的鹽； (b) 確定來源于所述受試者的生物樣品中的SPOP底物水平或其活性；以及 (c) 如果與未施用包含治療有效量的來他替尼或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物的 對照受試者相比，所述底物水平或其活性降低，則施用額外劑量的所述藥物組合物。53. -種治療受試者的乳房腫瘤或胃腫瘤的方法，其包括向所述受試者施用包含治療 有效量的來他替尼或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物，其中與對照受試者相比，所述受 試者展現(xiàn)出異常高的SPOP底物水平或其活性。54. 如權利要求53所述的方法，其中所述異常高的水平通過所述腫瘤中SPOP突變的存 在來呈現(xiàn)。55. 如權利要求54所述的方法，其中所述突變導致所述SPOP氨基酸序列的位置31-161 之間的氨基酸序列改變。56. 如權利要求54所述的方法，其中所述氨基酸序列改變包括氨基酸置換。57. 如權利要求54所述的方法，其中所述突變導致在所述SPOP氨基酸序列的Y87、F102、 5119小125、1(129、1131、？133和/或1(134處的置換。58. 如權利要求38-57中任一項所述的方法，其中所述受試者是人。59. 如權利要求17或49或51或52或53所述的方法，其中所述腫瘤是雄激素敏感的。60. 如權利要求17或49或51或52或53所述的方法，其中所述腫瘤是雄激素不敏感的。61. 如權利要求16或17或18或49或51或52或53所述的方法，其中所述腫瘤是雌激素敏 感的。62. 如權利要求16或17或18或49或51或52或53所述的方法，其中所述腫瘤是雌激素不 敏感的。63. -種下調(diào)乳房細胞或胃細胞中的SPOP底物水平或其活性的方法，其包括： (a) 向所述細胞施用有效量的來他替尼，由此下調(diào)所述細胞中的SPOP底物或其活性；以 及 (b) 評價所述乳房細胞或胃細胞中的SPOP底物水平或其活性的下調(diào)。64. 如權利要求63所述的方法，其中所述乳房細胞或胃細胞是乳腺癌細胞或胃癌細胞。65. 如權利要求63所述的方法，其中所述乳房細胞或胃細胞是培養(yǎng)的細胞。66. 如權利要求63所述的方法，其中所述乳房細胞或胃細胞是雄激素敏感的細胞。67. 如權利要求26或63所述的方法，其中所述細胞是雌激素敏感的細胞。68. 如權利要求63所述的方法，其中所述乳房細胞是MCF7細胞。69. 如權利要求26或63所述的方法，其中所述底物是DEK。70. 如權利要求63-69中任一項所述的方法，其中所述下調(diào)通過所述細胞中的所述底物 水平的降低來呈現(xiàn)。71. 如權利要求70所述的方法，其中所述表達水平包括蛋白質(zhì)表達水平。72. 如權利要求63-69中任一項所述的方法，其中所述下調(diào)通過所述細胞的胞質(zhì)部分中 所述底物的表達水平的降低來呈現(xiàn)。73. -種藥劑盒，其包含： (a) 藥物組合物的至少一個單位劑型，該藥物組合物包含治療有效量的來他替尼或其 藥學上有效的鹽；以及 (b) 關于實施權利要求38-72中任一項所述的方法的說明。
【文檔編號】A61K31/00GK106029905SQ201480074107
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2014年12月3日
【發(fā)明人】艾倫·J·李, 詹森·J·李, 戴維·M·盧, 瑞民·李
【申請人】塞雷斯特拉生命科學有限責任公司