專利名稱：作為?；鵆oA－膽固醇－O－?；D移酶抑制劑、巨噬細胞－脂質復合物在動脈壁上累積 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及橙皮苷和橙皮素在哺乳動物中抑制?；鵆oA-膽固醇-O-?；D移酶(ACAT)的活性、抑制巨噬細胞-脂質復合物在動脈壁上的累積、以及預防或治療肝病的應用。
背景技術：
近些年來，冠狀心血管循環(huán)疾病，例如動脈粥樣硬化和高膽固醇血癥，已逐漸成為主要的致死原因。已有報道稱，血漿膽固醇濃度增高導致脂肪、巨噬細胞和泡沫細胞沉積在血管壁上，此等沉積則導致斑塊形成，并由此引發(fā)動脈粥樣硬化(Ross，R.，Nature，362，801-809(1993))。降低血漿膽固醇濃度的方法之一是飲食料法，以降低膽固醇和脂質的攝入。另一種方法是通過抑制其中所涉及的酶來抑制膽固醇的吸收。
?；鵆oA-膽固醇-O-?；D移酶(ACAT)促進血液中膽固醇的酯化。泡沫細胞是在ACAT的作用下形成的，并包含大量的由低密度脂蛋白攜帶的膽固醇酯。泡沫細胞在動脈壁上的形成隨ACAT的活性而增加，因此ACAT的抑制劑也可以是防止動脈粥樣硬化的藥劑。另外，已有人報道LDL-膽固醇的血濃可通過抑制ACAT的活性來降低(Witiak，D.T.和D.R.Feller(eds.)，Anti-Lipidemic DrugsMedicinal，Chemical and Biochemical Aspects，Elsevier，pp 159-195(1991))。
另一方面，由于過度攝入酒精或具有高脂質含量的食品、或者感染肝炎B或C病毒有可能發(fā)生肝功能的損壞，并有可能發(fā)展為肝炎、肝硬變或肝癌。具體而言，過量攝入含脂肪的食品和酒精導致脂肪肝，其中在肝組織中沉積了大量的脂質類物質，而且血清GOT(谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶)、GPT(谷氨酸-丙酮酸轉氨酶)和γ-GTP(γ-谷氨?；D肽酶)升高(T.Banciu等人，Med.Interne.，20，69-71(1982)；以及A.Par等人，Acta.Med.Acad.Sci.Hung.，33，309-319(1976))。
已進行了許多努力來研制可以抑制ACAT活性的藥物；其結果是已有幾種從各種微生物的培養(yǎng)物中分離出的化合物。此等化合物的例子包括從Aspergillus fumigatus的培養(yǎng)物中分離出的pyripyropenes(S.Omura等人，J.Antibiotics，46，1168-1169(1993)；以及從Pseudomonas sp.中分離出的Acaterin(S.Nagamura等人，J.Antibiotics，45，1216-1221(1992))。
另外，作為高膽固醇血癥的治療劑，Merck Co.，USA已研制并銷售稱為Lovastatin的HMG-CoA還原酶抑制劑。但是，已知該藥物會誘發(fā)肝臟中肌酸激酶增加的副作用。
因此，仍有必要繼續(xù)研制無毒性的ACAT和巨噬細胞-脂質復合物在動脈上皮上累積的抑制劑、以及肝病預防或治療劑。
本發(fā)明的發(fā)明者努力由天然物質研制新型且強效的ACAT抑制劑、巨噬細胞-脂質復合物累積抑制劑以及肝病治療劑，其結果是發(fā)現(xiàn)橙皮苷或橙皮素具有強效ACAT抑制活性、巨噬細胞-脂質復合物累積抑制活性、以及對肝病的預防或治療活性。
橙皮苷(C28H34O15，M.W610.55)和橙皮苷的配基——橙皮素(C16H14O6，M.W302.27)是存在于檸檬、葡萄柚、柑桔、枸櫞和橙(Citrus sinensis)中的生物類黃酮(Horowitz，Gentili，Tetrahedron，19，773(1963))。
已有報道稱，橙皮苷或橙皮素具有增強毛細管、降低滲透性、抗血小板聚集、抗炎、抗病毒以及降低血壓和膽固醇的活性(Meyer，O.C.，Angiology，45，579-584(1994)；Stmckmann，J.R.等人，Angiol.，45，419-428(1994)；Matsubara，Y.等人，Japan Organic Synthesis Chem.AssociationJournal，52，318-327(1994，Mar.)；Galati，E.M.等人，F(xiàn)amaco.，51(3)，219-221(1996，Mar.)；Monforte，M.T.等人，F(xiàn)armaco.，50(9)，595-599(1995，Sep.)；JP 95-86929；JP 95-86930；Chung，M.I.等人，Chin.Pharm.J.(Taipei).，46，429-437(1994，Nov.)；Galati，E.M.等人，F(xiàn)amaco.，40(11)，709-712(1994，Nov.)；以及Emim，J.A.等人，J.Pharm.Pharmacol.，46(2)，118-122(1994))。
另外，橙皮苷已被用于預防和治療腦貧血、視網(wǎng)膜出血和pelioma。
但是，目前尚沒有人報道橙皮苷或橙皮素的ACAT抑制活性、巨噬細胞-脂質復合物累積抑制活性、以及對肝病的預防或治療活性。
發(fā)明簡述因此，本發(fā)明的目的是提供橙皮苷或橙皮素抑制哺乳動物中ACAT活性的新用途。
本發(fā)明的另一個目的是提供橙皮苷或橙皮素抑制哺乳動物中巨噬細胞-脂質復合物在動脈內(nèi)皮壁上累積的新用途。
本發(fā)明的再一個目的是提供橙皮苷或橙皮素預防或治療哺乳動物中肝病的新用途。
附圖簡述參考以下附圖及描述，本發(fā)明的上述和其他目的及優(yōu)點將更為顯而易見，在附圖中

圖1A、1B和1C顯示了分別給藥1％膽固醇、1％膽固醇加1mg/kgLovastatin、以及1％膽固醇加0.1％橙皮苷的兔動脈；以及圖2A、2B和2C代表分別給藥1％膽固醇、1％膽固醇加1mg/kgLovastatin、以及1％膽固醇加0.1％橙皮苷的兔肝臟的顯微特征。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明的一個方面，其提供橙皮苷或橙皮素抑制哺乳動物中?；鵆oA-膽固醇-O-酰基轉移酶(ACAT)活性的新用途。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，其提供橙皮苷或橙皮素抑制哺乳動物中巨噬細胞-脂質復合物在動脈內(nèi)皮壁上累積的新用途。
根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，其提供橙皮苷或橙皮素預防或治療哺乳動物中肝病的新用途。
橙皮苷和橙皮素可從桔屬植物的皮中提取，或者根據(jù)Zemplen，Bognar(Ber.，75，1043(1943))和Seka，Prosche(Monatsh.，69，284(1936))描述的方法來合成。另外，橙皮素可通過水解橙皮苷來制得。
橙皮苷或橙皮素在0.1mg/kg/天或更高的劑量時對ACAT活性和巨噬細胞-脂質復合物在動脈內(nèi)皮壁上的累積具有抑制作用，而且對肝病具有預防和治療作用，所述抑制作用隨劑量而增加。
而且，盡管有強的效力，但橙皮苷或橙皮素在鼠實驗中幾乎沒有表現(xiàn)出毒性或促有絲分裂性。更具體而言，當以100mg/kg的劑量給鼠口服給藥時，橙皮苷或橙皮素沒有產(chǎn)生毒性，對于50kg重的人來說，上述劑量相當于口服給藥3-10g橙皮苷或橙皮素/kg體重。另外，橙皮苷和橙皮素對肝功能沒有副作用。
本發(fā)明還提供用于抑制ACAT活性和巨噬細胞-脂質復合物在動脈內(nèi)皮壁上累積、以及預防或治療肝病的藥物組合物，該組合物包括橙皮苷或橙皮素作為活性成分以及藥物學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
可根據(jù)任何常規(guī)方法來制備藥物制劑。在制備制劑時，活性成分優(yōu)選與載體混合或用載體稀釋，或者包封在膠囊、小藥囊或其他容器之形式的載體中。如果載體為稀釋劑，其可為固體、半固體或液體物質，作為活性成分的載體、賦形劑或介質。因此，制劑可為片劑、丸劑、粉末、小藥囊劑、甘香酒劑、混懸劑、乳劑、溶液、糖漿、氣霧劑、軟和硬明膠膠囊、無菌注射液、無菌包裝的粉末等劑型。
合適的載體、賦形劑和稀釋劑的例子是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。藥物制劑可另外包括填料、抗附聚劑、潤滑劑、潤濕劑、調味劑、乳化劑、防腐劑等。本發(fā)明的組合物可用任何本領域已知的方法配制成在給藥于哺乳動物后快速、持續(xù)或延遲釋放活性成分的制劑。
本發(fā)明的藥物制劑可通過各種途徑給藥，包括口服、透皮、皮下、靜脈和肌肉給藥。對于人，橙皮苷或橙皮素的典型日劑量是約0.1-100mg/kg體重，優(yōu)選為3-10mg/kg，而且該劑量可以單劑量或多份劑量給藥。
但應理解的是，實際給藥的活性成分的量應根據(jù)各種相關因素來確定，所述因素包括待治療的疾病、所選擇的給藥途徑、每個患者的年齡、性別和體重、以及患者癥狀的嚴重程度；因此，上述劑量絕不是用于限制本發(fā)明的范圍。
另外，橙皮苷或橙皮素可摻入在食品或飲料中，作為添加劑或食物增補劑，用于抑制ACAT活性、抑制巨噬細胞-脂質復合物在動脈內(nèi)皮上的累積和/或預防或治療肝病。食品或飲料可包括肉食；汁液如蔬菜汁(例如胡蘿卜汁和番茄汁)和果汁(例如橙汁、葡萄汁、菠蘿汁、蘋果汁和香蕉汁)；巧克力；小吃；糖果；意大利餡餅；由谷粉制成的食品，如面包、蛋糕、蘇打餅干、曲奇餅干、餅干、面條等；口香糖；乳制品，如牛奶、乳酪、酸奶和冰淇淋；湯；肉湯；稀粥、番茄沙司和調味汁；茶；酒精飲料；碳酸飲料如開口可樂和百事可樂；維生素復合物；以及各種保健食品。
在此情況下，食品或飲料中的橙皮苷或橙皮素含量可在0.01-5％重量之間。具體而言，每1000ml根據(jù)本發(fā)明的飲料可包含200-10000mg的橙皮苷或橙皮素。
如上所述，橙皮苷或橙皮素可用作有效抑制ACAT活性、抑制巨噬細胞-脂質復合物在動脈內(nèi)皮上累積、和/或預防或治療肝病的非毒性藥物。
以下實施例用于進一步闡明本發(fā)明，而不是限制其范圍。
另外，以下固體混合物中之固體、液體中之液體、以及液體中之固體的百分比分別是以wt/wt、vol/vol和wt/vol計算，而且所有的反應都是在室溫下進行，除非另有說明。實施例1從桔皮中提取橙皮苷在室溫下干燥柑桔(Cheju Island，Korea)、枸櫞(Jeollanamdo，Korea)以及橙、葡萄柚和檸檬(California，CA，USA)的皮，然后粉碎成粒徑為100-200μm的粉末。在500mg的上述各桔皮粉末中分別加入50ml的甲醇，然后在水浴中于50℃下提取6小時。冷卻所得到的提取物，然后過濾，在濾液中添加甲醇至50ml的體積。
為證實如上制得的提取物中橙皮苷的含量，對0.5μl所述提取物進行高效液相色譜(HPLC)分析，其中使用Lichrosorb RP-8柱(5μm，4×250mm)，所述色譜柱用37％甲醇預平衡并保持在30℃下。提取物用37％甲醇以1.0ml/min的流速洗脫。將橙皮苷(Sigma Chemical Co.，USA)溶解在甲醇中，使得最終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、和0.5mg/ml，由此制備標準溶液，然后在相同的條件下進行HPLC分析。在280nm下用UV-VIS分光光度計檢測洗脫液，并通過比較桔皮提取物和標準溶液的HPLC曲線面積來計算橙皮苷的含量。各種桔皮提取物中的橙皮苷含量(％)見表I所示。
表I
實施例2口服給藥橙皮苷或橙皮素的毒性在22±1℃的溫度、55±5％的濕度和光照周期12L/12D的條件下，飼養(yǎng)7-8周齡、無特定病原的ICR雌鼠(6只)和雄鼠(6只)，雌鼠重量在25-29g，雄鼠重量在34-38g。將飼料(Cheiljedang Co.，鼠飼料)和水消毒，然后喂給小鼠。
將橙皮苷或橙皮素溶解在0.5％Tween 80中，至濃度為100mg/ml，然后將該溶液口服給藥至小鼠，用量為0.2ml/20g小鼠體重。給藥所述溶液后，按以下程序觀察小鼠10天并記錄副作用或死亡現(xiàn)象給藥后1、4、8和12小時，以后則每隔12小時觀察。每天記錄小鼠體重變化，以檢查橙皮苷或橙皮素的作用。另外，在第10天時，將小鼠處死，并肉眼檢查內(nèi)部器官。
在第10天時所有小鼠都存活，而且1000mg/kg劑量的橙皮苷或橙皮素沒有毒性。尸檢結果是，小鼠沒有形成任何病理非正常性，而且在10天的檢查期間沒有觀察到體重減輕。因此，可得出以下結論桔橙皮苷或橙皮素在口服給藥于動物時沒有毒性。實施例3向動物給藥橙皮苷或橙皮素隨機將體重為90-110g的30只4周齡Sprague-Dawley大鼠(Taihanlaboratory animal center，Korea)平均分成3個飲食組。三個組的大鼠分別用三種不同的高膽固醇食物喂養(yǎng)，即包含1％膽固醇的AIN-76實驗室動物飼料(ICN Biochemicals，Cleveland，OH，USA)(對照組)，以及1％膽固醇加0.1％橙皮苷或橙皮素。三個組所用飼料的成分見下表II。
表II
*從TEKLAD Premier Co.(Madison，WI，U.S.A.)購得無限制地用具體飼料和水喂養(yǎng)大鼠共6周，每日記錄攝取量，然后每7天稱重，并分析記錄數(shù)據(jù)。所有大鼠都顯示正常的生長速度，而且三個組之間在食物攝取量和體重增加方面沒有顯著差異。實施例4血漿中總膽固醇、HDL-膽固醇和中性脂質含量的測定以下測定向大鼠給藥橙皮苷或橙皮素對血漿膽固醇和中性脂質含量的影響。
從以上三個組的大鼠中采取血樣，并用包含葡萄糖硫酸酯的HDL-膽固醇試劑(Sigma Chemical Co.，Cat.No.352-3)從中分離血漿HDL成分。用Sigma Diagnostic Kit Cat.No.352-100(Sigma Chemical Co.，USA)測定總膽固醇和HDL-膽固醇濃度(Allain et al.，Clin.Chem.，20，470-475(1974))。用Sigma Diagnostic Kit Cat.No.339-50(SigmaChemical Co.，USA)測定中性脂質濃度(Bucolo，G.和David，H.，Clin.Chem.，19，476-482(1973))。結果見表III，其中，與對照組大鼠相比，橙皮苷和橙皮素飼養(yǎng)組中大鼠的總血漿膽固醇濃度分別下降32％和18％。
表III
TG甘油三酯實施例5橙皮苷和橙皮素在ACAT抑制中的活性(步驟1)制備微粒體為確定用橙皮苷或橙皮素飼養(yǎng)大鼠對ACAT活性的作用，從肝組織中制備微粒體作為酶源。
首先，將實施例3中的三組大鼠斷頭處死，并取出肝臟。分別將1g肝臟在5ml勻漿介質(50mM KH2PO4(pH7.4)，0.1 MEDTA，2mMβ-巰基乙醇)中均化。在4℃、3000×g下離心所述勻漿10分鐘，然后在40℃、15000×g下離心所得到的上清液15分鐘，由此得到上清液。將上清液放入超離心管(Beckman)中，并在100000×g、4℃下離心1小時，以得到微粒體沉淀物，然后將該沉淀物懸浮在3ml的勻漿介質中，并在4℃、100000×g下離心1小時。將由此得到的沉淀物懸浮在1ml勻漿介質中。用Lowry法測定所得懸浮液中蛋白質的含量，然后調節(jié)至4-8mg/ml。將所得懸浮液儲存在深冷凍機(Biofreezer，F(xiàn)orma Scientific Inc.)中。(步驟2)ACAT實驗在丙酮中將6.67μl的1mg/ml膽固醇丙酮溶液與6μl的10％TritonWR-1339(Sigma Co.)混合，然后通過使用氮氣進行蒸發(fā)來除去丙酮。在所得的混合物中添加蒸餾水，其量是將膽固醇的濃度調節(jié)為30mg/ml。
在10μl得到的膽固醇水溶液中添加10μl的1M磷酸二氫鉀(pH7.4)、5μl的0.6mM牛血清白蛋白(BSA)、10μl的步驟1中制得的微粒體溶液和55μl的蒸餾水(總共90μl)。在水浴中于37℃下預溫育該混合物30分鐘。
將10μl(1-14C)油酰-CoA溶液(0.05μCi，最終濃度10μM)添加至經(jīng)預溫育的混合物中，在水浴中于37℃下溫育所得的混合物30分鐘。在該混合物中添加500μl的異丙醇∶庚烷混合物(4∶1v/v)、300μl的庚烷和200μl的0.1 M磷酸二氫鉀(pH 7.4)，然后使用vortex劇烈攪拌混合物，并在室溫下靜置2分鐘。
將200μl所得的上清液放入閃爍瓶中，并在其中添加4ml的閃爍液(Lumac)。用1450 Microbeta液體閃爍計數(shù)器(Wallacoy，F(xiàn)inland)對混合物進行放射活性分析。以每mg蛋白每分鐘合成的膽固醇油酸酯的pmol數(shù)(pmoles/min/mg蛋白)計算ACAT活性。結果見表IV。
表IV
從表IV的結果可以看出，橙皮苷和橙皮素組大鼠中ACAT活性分別低于對照組19.2％和23.5％。實施例6在橙皮苷和橙皮素飼養(yǎng)動物中對由巨噬細胞-脂質復合物導致的斑塊形成的抑制作用(步驟1)向動物給藥橙皮苷和橙皮素在20±2℃的溫度、55±5％的相對濕度和光照周期12L/12D的條件下，飼養(yǎng)24只重量分別為2.5-2.6kg的3月齡新西蘭白兔(YeonamHorticulture and Animal Husbandry College，Korea)。將上述兔子分為4個組，然后向4個組的兔子飼養(yǎng)4種不同的飼料，即分別是包含1％膽固醇的RC4飼料(Oriental Yeast Co.，Japan)(對照組)；1％膽固醇加1mg/kg Lovastatin(Merck，USA)(對比組)；1％膽固醇加0.1％橙皮苷；以及1％膽固醇加0.1％橙皮素。RC4飼料包含7.6％水分、22.8％粗蛋白、2.8％粗脂肪、8.8％粗灰、14.4％粗纖維素和43.6％可溶性無氮物質。兔子飼養(yǎng)6周，并可自由攝取飼料和水。(步驟2)分析動物動脈中的脂肪條紋將步驟1中飼養(yǎng)的兔子殺死，然后切開胸部。由主動脈閥上1cm的部位開始向下切除長度約為5cm的主動脈，然后除去主動脈周圍的脂肪。沿縱軸中間切開主動脈，并釘在板上。對濕的動脈進行照相，然后如下根據(jù)Esper，E.等人的方法(J.Lab.Clin.Med.，121，103-110(1993))對脂肪條紋進行染色。
用無水丙二醇在2分鐘內(nèi)洗滌一部分經(jīng)切可的主動脈3次，然后用Oil Red O(ORO，Sigman Co.)的丙二醇飽和溶液染色30分鐘。之后，用85％丙二醇溶液在3分鐘內(nèi)洗滌主動脈2次，以除去殘留的染色溶液，再用生理鹽水洗滌。對主動脈進行照相，并跟蹤照相。用圖象分析儀(LEICA，Q-600，Germany)測定染色區(qū)域(脂肪條紋區(qū)域)的面積，并計算與總主動脈面積的比例(％)。
另一方面，根據(jù)蘇木精-曙紅(H&E)和Masson′s三色染色法對主動脈的其他部分進行染色，然后在顯微鏡下觀察，以證實巨噬細胞-脂質復合物是否累積在內(nèi)膜、管腔中部、彈性層和中層。
另外，從兔子中采取血樣，并根據(jù)與實施例4相同的方法測定總膽固醇和甘油三酯。
結果見表V所示。
表V
>*M-L復合物巨噬細胞-脂質復合物由表V可以看出，與對照組相比，1mg/ml Lovastatin、0.1％橙皮苷和0.1％橙皮素組中累積在動脈內(nèi)皮上的巨噬細胞-脂質復合物面積顯著降低。因此，證實橙皮苷和橙皮素可抑制巨噬細胞-脂質復合物在動脈內(nèi)皮上的累積。具體而言，明顯可以看出，在高于1100mg/dl的膽固醇血液濃度時橙皮苷和橙皮素對巨噬細胞-脂質復合物的累積具有抑制活性，所述膽固醇濃度大大高于正常兔子的濃度，即、約50mg/dl。該結果提示有新的機制防止動脈粥樣硬化的開始，這與HMG-CoA還原酶抑制劑阻斷膽固醇合成、ACAT抑制劑阻斷膽固醇吸收、或者CETP抑制劑阻斷膽固醇轉移不同。
圖1A、1B和1C顯示了分別給藥1％膽固醇(對照組)；1％膽固醇加1mg/kg Lovastatin(對比組)；和1％膽固醇加0.1％橙皮苷的兔子的動脈。如圖1A、1B和1C所示，在給藥1％膽固醇的兔子的動脈內(nèi)皮上觀察到厚層的巨噬細胞-脂質復合物，而在分別給藥1％膽固醇加1mg/kg Lovastatin、和1％膽固醇加0.1％橙皮苷的兔子的動脈內(nèi)皮上幾乎沒有或者僅觀察到較薄層的巨噬細胞-脂質復合物。
因此，可以得出以下結論橙皮苷和橙皮素可強烈地抑制巨噬細胞-脂質復合物在動脈內(nèi)皮上的累積。實施例7橙皮苷對肝病的預防(步驟1)向鼠給藥橙皮苷隨機將20只重量為約90-110g的Sprague-Dawley大鼠(TaihanLaboratory Animal Center，Korea)平均分為二個飼料組。這2個組的大鼠分別喂以2種不同的高膽固醇飼料，即、包含1％膽固醇的AIN-76實驗室動物飼料(ICN Biochemicals，Clevand，OH，USA)(對照組)；以及1％膽固醇加0.02％橙皮苷。2個組的飼料的組成見表VI所示。
表VI
*購自于TEKLAD Premier Co.(Madison，WI，USA)無限制地用具體飼料和水喂養(yǎng)大鼠共6周，每日記錄攝取量，然后每7天稱重，并分析記錄數(shù)據(jù)。所有大鼠都顯示正常的生長速度，而且二個組之間在食物攝取量和體重增加方面沒有顯著差異。(步驟2)測定血清GOT和GPT濃度如下測定給藥橙皮苷對鼠肝功能的作用。
從2個組的鼠中采取血液，然后根據(jù)Reitman和Frankel的方法(Reitman，S.和J.S.Frankel，Am.J.Clin.Pathol.，28，56(1956))測定血清GOT(谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶)和GPT(谷氨酸-丙酮酸轉氨酶)。GOT和GPT是在肝臟和心臟中合成的，并在這些器官被損壞時釋放在血液中。因此，GOT和GPT是肝功能的代表性指標，而高血清GOT和GPT濃度代表肝臟受到嚴重損傷。
結果顯示，橙皮苷組的GOT和GPT濃度較對照組的分別低約30％和10％。(步驟3)使用兔子的實驗重復步驟1中的相同步驟，但使用30只重量分別為約2.5-2.6kg的3月齡新西蘭白兔(Yeonam Horticulture and Animal Husbandry College，Korea)代替鼠，然后用3種不同的飼料分別喂養(yǎng)所述兔子，即、包含1％膽固醇的RC4飼料(對照組)；1％膽固醇加1mg/kg Lovastatin(對比組)；以及1％膽固醇加0.1％橙皮苷。
之后，從兔子中分離肝臟，并如下所述進行組織病理學觀察。
肌肉注射氯胺酮(75mg/kg)麻醉兔子，然后切開腹部。肉眼觀察肝臟硬化的顏色和程度，并將從兔中分離的肝臟用10％中性緩沖福爾馬林固定24小時以上。用水充分洗滌經(jīng)固定的肝臟，分步用70％、80％、90％和100％乙醇脫水，然后嵌在石蠟中。用切片機將嵌入的肝臟切成4μm的厚度，并用蘇木精和曙紅染色。用二甲苯使經(jīng)染色的肝臟樣品呈透明狀，用permount固定，然后用顯微鏡觀察，以證實損傷的存在。
圖2A、2B和2C分別代表了給藥1％膽固醇(對照組)、1％膽固醇加1mg/kg Lovastatin(對比組)、和1％膽固醇加0.1％橙皮苷的兔子肝臟的顯微特征。如圖2A和2B所示，對照組和對比組的肝細胞為不規(guī)則地排列并增大，而且其中沉積大量的脂肪。相反地，如圖2C所示，橙皮苷組的肝細胞為正常，而且沒有觀察到脂肪的沉積。該結果表明，橙皮苷強烈地抑制脂肪肝的發(fā)生，而且對肝細胞沒有毒副作用。(步驟4)使用人的實驗以10mg/g的劑量向一位55歲的男人給藥橙皮苷共68天，并分別在開始給藥之前(第0天)以及給藥后的45和68天(第45和68天)時測定GOT、GPT和γGTP。其結果是，與第0天時的相比，第45和68天時的血清GOT濃度分別降低17％。與第0天時的相比，第45和68天時的血清GPT濃度分別降低15％和19％。而且，與第0天時的相比，第45和68天時的血清γGTP濃度分別降低25％和51％。令人驚奇的是，與第0天時的相比，血清γGTP濃度在第68天時降低50％以上。該結果表明，橙皮苷或橙皮素對肝病如肝炎、脂肪肝和酒精性脂肪肝具有強效的肝保護活性。
另一方面，以6mg/kg的每日劑量向一位56歲的男性口服給藥橙皮苷共30天，該男性每天習慣性地飲用100cc的酒精飲料，然后在給藥之前(第0天)和給藥之后30天(第30天)測定血清γGTP濃度。其結果是，第0天時的初始血清γGTP濃度為129 IU/1，而第30天時的濃度降低至69 IU/1，達到了正常范圍。該結果證實橙皮苷或橙皮素對預防酒精性脂肪肝和肝硬變具有高活性。實施例9包含橙皮苷或橙皮素的食品如下制造包含橙皮苷或橙皮素的食品。(1)制造番茄沙司和調味汁將橙皮苷或橙皮素添加至番茄沙司或調味汁中，其量為0.01-5wt％，以得到更有益于健康的番茄沙司或調味汁。(2)制造小麥粉食品將橙皮苷或橙皮素添加至小麥粉食品中，其量為0.01-5wt％，并使用該混合物制造面包、蛋糕、曲奇餅干、蘇打餅干、和面條，以得到更有益于健康的食品。(3)制造湯和肉汁將橙皮苷或橙皮素添加至湯和肉汁中，其量為0.01-5wt％，以得到更有益于健康的湯和肉汁。(4)制造牛肉末將橙皮苷或橙皮素添加至牛肉末中，其量為0.01-5wt％，以得到更有益于健康的牛肉末。(5)制造乳制品將橙皮苷或橙皮素添加至牛奶中，其量為0.01-5wt％，然后使用該牛奶制造各種乳制品如黃油和冰淇淋。
但是，在制造乳酪時，將橙皮苷或橙皮素添加至凝聚乳蛋白中；而在制造酸奶時，則將橙皮苷或橙皮素添加至發(fā)酵后得到的凝聚乳蛋白中。實施例10包含橙皮苷或橙皮素的飲料(1)制造蔬菜汁將200-10000mg橙皮苷或橙皮素添加至1000ml番茄或胡蘿卜汁中，以制得更有益于健康的蔬菜汁。(2)制造果汁將200-10000mg橙皮苷或橙皮素添加至1000ml蘋果或葡萄汁中，以制得更有益于健康的果汁。(3)制造碳酸飲料將200-10000mg橙皮苷或橙皮素添加至1000ml可口可樂或百事可樂中，以制得更有益于健康的碳酸飲料。
雖然已參考上述具體實施方案對本發(fā)明進行了描述，但應認識到，本領域技術人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)還可進行各種改進和變化，而本發(fā)明的范圍為以下權利要求書所限定。
權利要求
1.橙皮苷或橙皮素在抑制哺乳動物中?；鵆oA-膽固醇-O-?；D移酶(ACAT)活性中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其中，所述哺乳動物是人。
3.如權利要求1所述應用，其中，所述橙皮苷或橙皮素以包含這些物質的組合物的形式給藥于哺乳動物，所述組合物選自于以下組中藥物組合物、食品組合物和飲料組合物。
4.如權利要求3所述的應用，其中，在藥物組合物中包含的橙皮苷或橙皮素的有效量為0.1-100mg/kg體重/天。
5.如權利要求3所述的應用，其中，在食品組合物中包含的橙皮苷或橙皮素的含量為0.01-5重量％。
6.如權利要求3所述的應用，其中，所述食品組合物是肉食、巧克力、小吃、糖果、意大利餡餅、由谷粉制成的食品、口香糖、乳制品、湯、肉湯、稀粥、番茄沙司、調味汁、維生素復合物、或保健食品。
7.如權利要求6所述的應用，其中，所述由谷粉制成的食品是面包、蛋糕、蘇打餅干、曲奇餅干、餅干、或面條。
8.如權利要求3所述的應用，其中，所述飲料組合物是乳制品、蔬菜汁、果汁、茶、酒精飲料或碳酸飲料
9.如權利要求3所述的應用，其中，在飲料組合物中的橙皮苷或橙皮素含量為每1000ml飲料200-10000mg。
10.桔橙皮苷或橙皮素在抑制哺乳動物中巨噬細胞-脂質復合物累積于動脈內(nèi)皮中的應用。
11.如權利要求10所述的應用，其中，所述哺乳動物是人。
12.如權利要求10所述應用，其中，所述橙皮苷或橙皮素以包含這些物質的組合物的形式給藥于哺乳動物，所述組合物選自于以下組中藥物組合物、食品組合物和飲料組合物。
13.如權利要求12所述的應用，其中，在藥物組合物中包含的橙皮苷或橙皮素的有效量為0.1-100mg/kg體重/天。
14.如權利要求12所述的應用，其中，在食品組合物中包含的橙皮苷或橙皮素的含量為0.01-5重量％。
15.如權利要求12所述的應用，其中，所述食品組合物是肉食、巧克力、小吃、糖果、意大利餡餅、由谷粉制成的食品、口香糖、乳制品、湯、肉湯、稀粥、番茄沙司、調味汁、維生素復合物、或保健食品。
16.如權利要求15所述的應用，其中，所述由谷粉制成的食品是面包、蛋糕、蘇打餅干、曲奇餅干、餅干、或面條。
17.如權利要求12所述的應用，其中，所述飲料組合物是乳制品、蔬菜汁、果汁、茶、酒精飲料或碳酸飲料
18.如權利要求12所述的應用，其中，在飲料組合物中的橙皮苷或橙皮素含量為每1000ml飲料200-10000mg。
19.橙皮苷或橙皮素在預防或治療哺乳動物之肝病中的應用。
20.如權利要求19所述的應用，其中，所述哺乳動物是人。
21.如權利要求19所述應用，其中，所述橙皮苷或橙皮素以包含這些物質的組合物的形式給藥于哺乳動物，所述組合物選自于以下組中藥物組合物、食品組合物和飲料組合物。
22.如權利要求21所述的應用，其中，在藥物組合物中包含的橙皮苷或橙皮素的有效量為0.1-100mg/kg體重/天。
23.如權利要求21所述的應用，其中，在食品組合物中包含的橙皮苷或橙皮素的含量為0.01-5重量％。
24.如權利要求21所述的應用，其中，所述食品組合物是肉食、巧克力、小吃、糖果、意大利餡餅、由谷粉制成的食品、口香糖、乳制品、湯、肉湯、稀粥、番茄沙司、調味汁、維生素復合物、或保健食品。
25.如權利要求24所述的應用，其中，所述由谷粉制成的食品是面包、蛋糕、蘇打餅干、曲奇餅干、餅干、或面條。
26.如權利要求21所述的應用，其中，所述飲料組合物是乳制品、蔬菜汁、果汁、茶、酒精飲料或碳酸飲料
27.如權利要求21所述的應用，其中，在飲料組合物中的橙皮苷或橙皮素含量為每1000ml飲料200-10000mg。
全文摘要
本發(fā)明涉及橙皮苷和橙皮素在哺乳動物中抑制?；鵆oA－膽固醇－O－酰基轉移酶(ACAT)的活性、抑制巨噬細胞—脂質復合物在動脈壁上的累積、以及預防或治療肝病的應用。
文檔編號A21D13/00GK1278170SQ98810701
公開日2000年12月27日 申請日期1998年10月20日 優(yōu)先權日1997年10月28日
發(fā)明者卜成海, 鄭泰淑, 崔明淑, 文錫植, 權容國, 李恩淑, 玄柄和, 崔良圭, 李哲浩, 裴基煥, 樸鏞福, 李準圣, 孫光熙, 權炳穆, 金永國, 崔度一, 金成郁, 黃仁奎, 安貞娥, 樸永培, 金孝洙, 崔盛俊 申請人:韓國科學技術研究院