?；o酶a:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2抑制劑在抑制肝癌生長中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2抑制劑在抑制肝癌生長中的應(yīng)用。具體地，抑制酰基輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2（即ACAT2）的活性可分別在細胞水平和動物水平有效抑制人肝癌細胞和移植瘤的生長，這種抑制效應(yīng)是通過阻斷ACAT2介導(dǎo)的膽固醇代謝物的分泌外排，而使細胞內(nèi)膽固醇代謝物累積產(chǎn)生的。膽固醇代謝物的累積具有促進肝癌細胞凋亡、抑制肝癌生長的效應(yīng)；膽固醇代謝物的外排則能解除這種抑制效應(yīng)。
【專利說明】?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-2抑制劑在抑制肝癌生長中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)和制藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-2抑制劑在抑制肝癌生長中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肝臟是體內(nèi)膽固醇代謝中心，在維持體內(nèi)膽固醇代謝平衡中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。肝臟可通過從頭合成的方式產(chǎn)生大量的膽固醇；肝外組織必須通過膽固醇逆轉(zhuǎn)運(RCT, Reverse Cholesterol Transportation)途徑將有害的過量膽固醇代謝物及膽固醇轉(zhuǎn)運到肝臟代謝，降解成為膽汁酸、組裝脂蛋白等。肝臟還能將酯化的中性膽固醇酯組裝為脂蛋白，并分泌到血液中，為肝外組織的生命活動提供足量的膽固醇。
[0003]細胞內(nèi)膽固醇的水平對細胞的生長、增殖、分化等生命活動均非常重要；膽固醇的缺乏會引起細胞周期依賴性蛋白激酶I的活性受到抑制，從而導(dǎo)致細胞特異性地停留在G2期。臨床研究表明，肝癌發(fā)生過程肝臟原有的膽固醇合成、降解及脂蛋白組裝分泌的功能都受到了損傷，但肝臟又必須不斷接收并代謝肝外組織來源過量的有害膽固醇代謝物及膽固醇；同時肝癌的發(fā)生與血清總膽固醇水平呈現(xiàn)明顯的負相關(guān)，肝癌組織中的膽固醇水平也高于癌旁組織。
[0004]人體內(nèi)通過RCT途徑運送到肝臟進一步代謝的膽固醇代謝物，包括體內(nèi)不斷產(chǎn)生的27-羥膽固醇(270H)、24-羥膽固醇(240H)等。膽固醇代謝物在體內(nèi)的生理濃度非常低，一般是膽固醇濃度的1/1000或者更低。過量的膽固醇代謝物比過量的膽固醇毒性要大得多，正常肝細胞主要通過酯化、硫酸化和降解三個途徑代謝全身組織細胞來源的過量膽固醇代謝物。
[0005]肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一種高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤，是世界第六大癌癥。肝癌在亞洲和非洲法發(fā)病率高，每年的發(fā)病率約為30/100000 ；而在歐洲和美國，肝癌的發(fā)病率則較低，約為2/100000以下。
[0006]我國肝癌患者占世界肝癌總患者的50%以上，死亡率高達20.4/100000,占惡性腫瘤致死總數(shù)的18.8%。由于肝癌早期難以診斷，因此往往當(dāng)肝癌被診斷出來的時候，大多數(shù)病人已經(jīng)發(fā)展到了肝癌晚期，且經(jīng)常伴隨肝內(nèi)或肝外的轉(zhuǎn)移，這些因素是造成肝癌高死亡率的主要原因。此外，肝癌復(fù)發(fā)率很高，這可能與肝癌細胞容易發(fā)生微小轉(zhuǎn)移有關(guān)。
[0007]基于長期的流行病學(xué)調(diào)查，雖然已經(jīng)比較明確:慢性肝炎感染、超量酒精攝入以及食物來源的黃曲霉素等因素都有可能導(dǎo)致肝癌，但是肝癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機制依然并不清楚，對肝癌的干預(yù)也并不成功。因此，本領(lǐng)域迫切需要進行肝癌抑制的機理研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的就是提供酰基輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2抑制劑在抑制肝癌生長中的應(yīng)用。[0009]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2基因、或?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2的抑制劑的用途，所述用途選自下組的一種或多種:
[0010](a)用于制備治療肝癌的藥物組合物；
[0011](b)用于制備治療肝癌擴散轉(zhuǎn)移的藥物組合物；
[0012](c)用于制備抑制肝癌體外增殖生長的藥物組合物；
[0013](d)用于制備抑制肝癌細胞體外增殖生長的藥物組合物；
[0014](e)用于制備抑制肝癌細胞成癌的藥物組合物；
[0015](f)用于制備促進肝癌細胞凋亡的藥物組合物。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述的肝癌細胞是人或非人哺乳動物的肝癌細胞。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的非人哺乳動物包括靈長目動物、嚙齒動物(如小鼠、大鼠)
坐寸ο
[0018]在本發(fā)明的 第二方面，提供了一種?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2基因、或?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-2的抑制劑的用途，所述用途選自下組的一種或多種:
[0019](a)用于制備治療癌癥的藥物組合物；
[0020](b)用于制備治療癌癥擴散轉(zhuǎn)移的藥物組合物；
[0021](c)用于制備抑制癌癥的體外增殖生長的藥物組合物；
[0022](d)用于制備抑制癌癥細胞體外增殖生長的藥物組合物；
[0023](e)用于制備抑制癌癥細胞成癌的藥物組合物；
[0024](f)用于制備促進癌癥細胞凋亡的藥物組合物。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述的癌癥包括肝癌、肺癌、腸癌、胃癌、腦癌(瘤)、骨癌；更佳地為肝癌。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述的?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2的抑制劑選自下組:Pyripyropene A、或具有相同效應(yīng)的Pyripyropene A衍生物與類似物、或同樣具有抑制?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-2效應(yīng)的化合物等。
[0027]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種體外非治療性的抑制肝癌細胞生長的方法，所述方法包括步驟(1):在添加?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2的抑制劑的條件下，培養(yǎng)肝癌細胞，從而抑制肝癌細胞的生長；或
[0028]所述方法包括步驟(I’):降低?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-2基因的表達或降低?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2的蛋白量或活性。
[0029]在另一優(yōu)選例中，將肝癌細胞與含?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2的抑制劑的溶液進行接觸或混合，然后進行培養(yǎng)。
[0030]在另一優(yōu)選例中，與野生型相比，酰基輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2基因的表達降低10%，較佳地降低20%，更佳地降低30%，更佳地降低40%，更佳地降低50%，更佳地降低60%，更佳地降低70%，更佳地降低80%，更佳地降低90%，最佳地，?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2編碼基因完全不表達。
[0031]在另一優(yōu)選例中，與野生型相比，?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2的活性降低10%，較佳地降低20%，更佳地降低30%，更佳地降低40%，更佳地降低50%，更佳地降低60%，更佳地降低70%，更佳地降低80%，更佳地降低90%，最佳地，完全沒有?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-2的活性。[0032]在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟:在培養(yǎng)體系中添加膽固醇代謝物。
[0033]在另一優(yōu)選例中，所述的膽固醇代謝物包括氧化型膽固醇類、固醇類激素、膽汁酸類等。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述的膽固醇代謝物包括(但并不限于):27-羥基膽固醇、25-羥基膽固醇、24-羥基膽固醇、22-羥基膽固醇、20-羥基膽固醇、7-羥基膽固醇、7-酮基膽固醇、環(huán)氧膽固醇、或其組合。
[0035]在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟:在培養(yǎng)體系中添加額外的抗癌藥物。
[0036]在另一優(yōu)選例中，所述的抗癌藥物包括化療藥、腫瘤抗體等。
[0037]在另一優(yōu)選例中，所述的抗癌藥物包括(但并不限于):阿霉素、長春新堿、紫杉醇、順鉬、卡鉬、5-FU、或其組合。
[0038]在本發(fā)明的第四方面，提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的載體和作為活性成分的?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2的抑制劑。
[0039]在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還包括膽固醇代謝物。
[0040]在另一優(yōu)選例中，所述的膽固醇代謝物包括氧化型膽固醇類、固醇類激素、膽汁酸類等。
[0041]在另一優(yōu)選例中，所述的膽固醇代謝物包括(但并不限于):27-羥基膽固醇、25-羥基膽固醇、24-羥基膽固醇、22-羥基膽固醇、20-羥基膽固醇、7-羥基膽固醇、7-酮基膽固醇、環(huán)氧膽固醇、或其組合。
[0042]在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還包括額外的抗癌藥物。
[0043]在另一優(yōu)選例中，所述的抗癌藥物包括化療藥、腫瘤抗體等。
[0044]在另一優(yōu)選例中，所述的抗癌藥物(但并不限于):阿霉素、長春新堿、紫杉醇、順鉬、卡鉬、5-FU或其組合。
[0045]在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物的給藥方式為局部給藥或癌內(nèi)給藥。
[0046]在本發(fā)明的第五方面，提供了一種用于治療癌癥的藥盒，所述藥盒包括組分:
[0047](a)第一治療劑，所述第一治療劑是含?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-2的抑制劑；和
[0048](b)使用說明書。
[0049]在另一優(yōu)選例中，所述藥盒還包括:
[0050](c)第二治療劑，所述第二治療劑是含膽固醇代謝物的藥物制劑。
[0051]在另一優(yōu)選例中，所述藥盒還包括:(d)第三治療劑，所述第三治療劑是抗癌藥物，所述的抗癌藥物含有不同于第一治療劑和第二治療劑的活性成分。
[0052]在本發(fā)明的第六方面，提供了一種治療癌癥的方法，包括步驟:給需要的對象施用?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-2的抑制劑，或本發(fā)明的第四方面所述的藥物組合物。
[0053]在另一優(yōu)選例中，所述的對象包括哺乳動物，較佳地為人。
[0054]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】[0055]下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
[0056]圖1顯示ACAT2基因表達mRNA和膽固醇代謝物水平的測定結(jié)果:圖1A，運用定量PCR的方法分析19對人肝癌(T)及癌旁組織(NT)中ACAT2基因的mRNA水平，ACAT2基因mRNA水平在癌組織和癌旁組織中的差異采用Ratio t test進行統(tǒng)計分析，點代表每例癌組織或癌旁組織中經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換的ACAT2基因的相對mRNA水平；圖1B,測定6對人肝癌(T)及癌旁組織(NT)中膽固醇代謝物27-和24-羥膽固醇的量，膽固醇代謝物水平在癌組織和癌旁組織中的差異采用Wilcoxon matched paired t test進行統(tǒng)計分析。
[0057]圖2顯示ACAT2在肝癌細胞中介導(dǎo)膽固醇代謝物的分泌外排；利用快速蛋白液相色譜(FPLC)，從經(jīng)過實驗處理后的肝癌細胞株Huh7的培養(yǎng)液中分離得到3種脂蛋白(圖2A)，由氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)測定膽固醇代謝物(27-和24-羥膽固醇)主要在脂蛋白VLDL-1I中，圖2B顯示細胞外膽固醇代謝物量，表明ACAT2抑制劑顯著抑制膽固醇代謝物的分泌外排。
[0058]圖3顯示ACAT2抑制劑顯著提高膽固醇代謝物抑制肝癌細胞的生長；圖3A，ACAT2抑制劑顯著提高膽固醇代謝物對肝癌細胞株Huh7生長的抑制效應(yīng)，以未經(jīng)任何處理的對照組細胞數(shù)作為100% ;圖3B，ACAT2抑制劑抑制膽固醇代謝物的分泌外排、顯著提高細胞內(nèi)膽固醇代謝物(27-和24-羥膽固醇)累積；ACAT2抑制劑顯著提高膽固醇代謝物累積引起肝癌細胞株Huh7發(fā)生細胞凋亡，用流式細胞儀測定subGl期細胞數(shù)目進行定量分析(圖3C)和用DA PI染色方法檢測凋亡形態(tài)細胞進行定量分析(圖3D)。
[0059]圖4顯示肝癌細胞Huh7移植瘤體積(圖4A)與重量(圖4B)分析結(jié)果，表明ACAT2抑制劑與膽固醇代謝物聯(lián)用比膽固醇代謝物單用更顯著抑制肝癌細胞Huh7移植瘤的生長。
【具體實施方式】
[0060]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，降低ACAT2基因的表達或抑制ACAT2蛋白的活性具有抑制肝癌細胞生長的效應(yīng)。具體地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，膽固醇代謝物的累積能抑制肝癌細胞的生長，膽固醇代謝物的外排則能解除這種抑制效應(yīng)；肝癌組織中ACAT2基因的表達與膽固醇代謝物的累積相關(guān);ACAT2在肝癌細胞中參與了膽固醇代謝物的外排，ACAT2活性的抑制可以在細胞水平和動物水平有效地抑制肝癌的生長，這種抑制效應(yīng)是通過阻斷ACAT2介導(dǎo)的膽固醇代謝物外排而使細胞內(nèi)膽固醇代謝物累積，進而促進了細胞凋亡而產(chǎn)生的。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0061]術(shù)語
[0062]ACAT2 基因
[0063]如本文所用，術(shù)語“ACAT2基因”或“?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶_2基因”可以
互換使用。
[0064]本發(fā)明提供了肝癌組織中ACAT2基因的表達與膽固醇代謝物累積的關(guān)系。抑制ACAT2的活性可以在細胞水平和動物水平有效抑制肝癌的生長，這種抑制效應(yīng)是通過阻斷ACAT2介導(dǎo)的膽固醇代謝物外排，使細胞內(nèi)膽固醇代謝物累積而產(chǎn)生的。ACAT2可以作為潛在的治療肝癌(特別是晚期肝癌)的藥物靶標(biāo)。
[0065]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以使用常規(guī)方法對ACAT2基因或蛋白進行調(diào)節(jié)，降低ACAT2基因的表達或?qū)CAT2基因表達進行失活處理(中斷失活，敲除，同源重組，干擾RNA等)。
[0066]較佳地，與野生型相比，ACAT2基因表達降低10%，較佳地降低20%，更佳地降低30%，更佳地降低40%，更佳地降低50%，更佳地降低60%，更佳地降低70%，更佳地降低80%，更佳地降低90%，最佳地ACAT2基因完全沒有表達。
[0067]降低ACAT2蛋白表達量與活性的方法包括(但不限于):添加ACAT2特異性抑制劑。
[0068]ACAT2 抑制劑
[0069]如本文所用，術(shù)語“ACAT2抑制劑”、“ACAT2的抑制劑”、“ACAT2特異性的抑制劑”、“酰基輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2的抑制劑”、“?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2的特異性抑制劑”、或“酰基輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2抑制劑”可以互換使用，都是指對?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2具有抑制效果的化合物,如Pyripyropene A、或具有相同效應(yīng)的Pyripyropene A衍生物與類似物、或同樣具有抑制酰基輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶_2效應(yīng)的化合物等。
[0070]本發(fā)明還提供了 ACAT2抑制劑的用途，它被用于制備治療癌癥的藥物組合物；制備治療癌癥擴散轉(zhuǎn)移的藥物組合物；制備抑制癌癥的體外增殖生長的藥物組合物；制備抑制癌癥細胞體外增殖生長的藥物組合物；制備抑制癌癥細胞成癌的藥物組合物；或制備促進癌癥細胞凋亡的藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的癌癥包括肝癌、肺癌、腸癌、胃癌、腦癌(瘤)、骨癌；更佳地為肝癌。
[0071]膽固醇
[0072]如本文所用，術(shù)語“膽固醇”，“膽甾醇”、或“cholesterol”可以互換使用。膽固醇是環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，由留體部分和一條長的側(cè)鏈組成。膽固醇廣泛存在于動物體內(nèi)，尤以腦及神經(jīng)組織中最為豐富，在腎、脾、皮膚、肝和膽汁中含量也高。膽固醇溶解性與脂肪類似，不溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶劑。膽固醇是動物組織細胞所不可缺少的重要物質(zhì)，它不僅參與形成細胞膜，而且是體內(nèi)代謝合成膽汁酸、維生素D以及留體激素的原料。
[0073]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可使用常規(guī)方法獲得膽固醇，如從血液、組織中分離，或通過常規(guī)商業(yè)途徑獲得，或進行人工化學(xué)合成。
[0074]膽固醇代謝物
[0075]如本文所用，術(shù)語“膽固醇代謝物”、“膽固醇合成代謝物”、“膽固醇代謝合成物”、“膽固醇合成物”、“膽固醇分解代謝物”、“膽固醇代謝分解物”、“膽固醇分解物”、“膽固醇氧化代謝物”、“膽固醇代謝氧化物”、“膽固醇氧化物”、“氧化型膽固醇”、或“cholesterolmetabolites'“cholesterol catabolites”、“oxysterols”、“oxycholeste;rols，，可以互換使用，都是指膽固醇在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。
[0076]所述的膽固醇代謝物可以包括氧化型膽固醇類、固醇類激素、膽汁酸類等。膽固醇代謝物為可以在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的膽固醇前體、膽固醇衍生物等。具體地，膽固醇代謝物包括(但不限于):27-羥基膽固醇、25-羥基膽固醇、24-羥基膽固醇、22-羥基膽固醇、20-羥基膽固醇、7-羥基膽固醇、7-酮基膽固醇、環(huán)氧膽固醇、或其組合。
[0077]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可使用常規(guī)方法獲得各種膽固醇代謝物，如從血液、組織中分離，或通過常規(guī)商業(yè)途徑獲得，或進行人工化學(xué)合成(如以膽固醇為底物，用蛋白酶進行催化合成，或化學(xué)催化合成)。[0078]膽固醇代謝物的用途
[0079]本發(fā)明提供了膽固醇代謝物的用途:它被用于它被用于制備治療癌癥的藥物組合物；制備治療癌癥擴散轉(zhuǎn)移的藥物組合物；制備抑制癌的體外增殖生長的藥物組合物；制備抑制癌細胞體外增殖生長的藥物組合物；制備抑制癌細胞成瘤的藥物組合物；或制備促進癌細胞凋亡的藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的癌癥包括肝癌、肺癌、腸癌、胃癌、腦癌(瘤)、骨癌；更佳地為肝癌。
[0080]在另一優(yōu)選例中，所述的膽固醇代謝物包括(但不限于):27-羥基膽固醇、25-羥基膽固醇、24-羥基膽固醇、22-羥基膽固醇、20-羥基膽固醇、7-羥基膽固醇、7-酮基膽固醇、環(huán)氧膽固醇、或其組合。
[0081]藥物組合物和施用方法
[0082]本發(fā)明提供了一種能抑制肝癌細胞和移植瘤的生長藥物組合物，它包括藥學(xué)上可接受的載體和有效量的作為活性成分的ACAT2抑制劑，較佳地，所述的活性成分還包括膽固醇代謝物。[0083]如本文所用，術(shù)語“有效量”或“有效劑量”或“效應(yīng)量”或“效應(yīng)劑量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。
[0084]“藥學(xué)上可以接受的載體”指的是:一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質(zhì)，它們適合于人或動物使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性?！跋嗳菪浴痹诖酥傅氖墙M合物中各組份能和藥物中的活性成分以及它們之間相互摻和，而不明顯降低藥效。
[0085]藥學(xué)上可以接受的載體部分例子有纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、纖維素乙酸酯等)、明膠、滑石、固體潤滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑(如吐溫?)、潤濕劑(如十二烷基硫酸鈉)、著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、防腐劑、無熱原水等。
[0086]本發(fā)明化合物或藥物組合物的施用方式?jīng)]有特別限制，代表性的施用方式包括(但并不限于):局部給藥、瘤旁、瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)等。
[0087]組合物中活性化合物或化合物的釋放可以延遲的方式在消化道內(nèi)的某一部分中釋放?？刹捎玫陌窠M分的實例是聚合物質(zhì)和蠟類物質(zhì)。必要時，活性化合物也可與上述賦形劑中的一種或多種形成微膠囊形式。
[0088]除了活性化合物外，液體劑型可包含本領(lǐng)域中常規(guī)采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油(特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)或這些物質(zhì)的混合物等。
[0089]除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑和香料。
[0090]除了活性化合物外，懸浮液可包含懸浮劑，例如乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質(zhì)的混合物等。
[0091]一種優(yōu)選的劑型是注射劑。用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無菌含水或無水溶液、分散液、懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水和非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。
[0092]一種優(yōu)選的劑型是緩釋劑型。用于本發(fā)明的緩釋劑沒有特別選擇，可以是本領(lǐng)域采用的各類緩釋劑或材料，尤其是生物可降解材料(如PLA等)。
[0093]藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約I微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，還可與其他治療劑(如抗腫瘤劑)一起使用(包括之前、之中或之后使用)。
[0094]使用藥物組合物時，是將安全有效量的藥物施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約I毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
[0095]所述的藥物組合物還可以包括額外的抗癌藥物。所述的抗癌藥物包括化療藥、腫瘤抗體等。在另一優(yōu)選例中，所述的抗癌藥物包括(但并不限于):阿霉素、長春新堿、紫杉醇、順鉬、卡鉬、5-FU或其組合。
[0096]藥盒及其應(yīng)用
[0097]本發(fā)明提供一種藥盒，所述藥盒包括:第一治療劑，所述第一治療劑是以酰基輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2的抑制劑(即ACAT2抑制劑)作為活性成分的藥物制劑；和使用說明書。
[0098]在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述藥盒還包括第二治療劑，所述第二治療劑是以膽固醇代謝物作為活性成分的藥物制劑。
[0099]所述藥盒還可以包括:第三治療劑，所述的第三治療劑是抗癌藥物。
[0100]所述的以?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-2的抑制劑作為活性成分的藥物制劑為:將ACAT2抑制劑在溶劑中溶解獲得，所述的溶劑包括水、醇類(甲醇和乙醇)、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、二氯甲烷、正己烷或石油醚等有機溶劑。
[0101]所述的抗癌藥物優(yōu)選為含有阿霉素和/或長春新堿的制劑，將阿霉素和/或長春新堿在溶劑中溶解獲得，所述的溶劑包括水、醇類(甲醇和乙醇)、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、二氯甲烷、正己烷或石油醚等有機溶劑，優(yōu)選乙酸乙酯和丙酮等中等極性溶劑。
[0102]所述的以膽固醇代謝物作為活性成分的藥物制劑，選自針劑、片劑、膠囊、或栓劑等，優(yōu)選針劑。將膽固醇代謝物在溶劑中溶解或于運載體中獲得，所述的溶劑包括水、醇類(甲醇和乙醇)、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、二氯甲烷、正己烷或石油醚等有機溶劑，優(yōu)選乙酸乙酯和丙酮等中等極性溶劑；所述的運載體包括蛋白類(高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL)、環(huán)糊精類(⑶乂、HP⑶)，優(yōu)選HDL類等中等體內(nèi)脂蛋白類似物運載體。
[0103]所述的以?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-2的抑制劑作為活性成分的藥物制劑選自針劑、片劑、膠囊、或栓劑等，優(yōu)選針劑。
[0104]所述的以膽固醇代謝物作為活性成分的藥物制劑可以是含有膽固醇代謝物的單元劑型，所述的以?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-2的抑制劑作為活性成分的藥物制劑可以是含有ACAT2抑制劑的單元劑型。
[0105]如本文所用，術(shù)語“單元劑型”是指為了使用方便，將組合物制備成單次使用所需的劑型，包括但不限于各種液體劑、固體劑(如片劑)、膠囊劑、緩釋劑、靶向劑。
[0106]本發(fā)明提供的藥盒通過下述步驟制備得到:將含有ACAT2抑制劑的制劑，以及說明書一起放置，形成藥盒。
[0107]本發(fā)明提供的藥盒用于治療癌癥，所述的癌癥包括肝癌及其轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移的肺癌、腸癌、胃癌、腦癌(瘤)、骨癌；優(yōu)選肝癌。
[0108]本發(fā)明的主要優(yōu)點包括: [0109](I)肝癌組織中ACAT2基因的表達與膽固醇代謝物的累積相關(guān)；ACAT2在肝癌細胞中參與了膽固醇代謝物的外排；
[0110](2)ACAT2活性的抑制可以在細胞水平和動物水平有效地抑制肝癌的生長，這種抑制效應(yīng)是通過阻斷ACAT2介導(dǎo)的膽固醇代謝物外排而使細胞內(nèi)膽固醇代謝物累積、進而促進了細胞凋亡而產(chǎn)生的。
[0111]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0112]材料和方法
[0113]試劑
[0114]細胞培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清購自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶和瓊脂糖購自 Promega 公司(Madison, USA) ;Taq 酶(Hot Start Version)和 dNTPs 購自 TaKaRa 公司；去脂蛋白血清(LPDS)以胎牛血清為原料，通過超速離心方法制備；27_羥膽固醇(270H)購自Medical isotope公司；24_輕膽固醇(240H)購自Enzo life science ;膽固醇代謝物27-與24-羥膽固醇混合物(OSm):2X濃度約為人血漿濃度(0.3 μ g/ml) ；ACAT2特異性抑制劑(Pyripyropene A)購自 Alexis biochemicals 公司。
[0115]細胞株和組織樣本
[0116]人肝癌細胞株Huh7購自中國科學(xué)院細胞庫，用含10%胎牛血清的Dulbecco’ smodified Eagle’s medium(DMEM)培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基都加入100U/ml的氨芐青霉素和100 μ g/ml鏈霉素，細胞均在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)。實驗用培養(yǎng)基A為含5%LPDS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基B為不含血清的DMEM培養(yǎng)基。
[0117]肝癌和癌旁組織由上海市中山醫(yī)院提供，取自進行外科手術(shù)治療的肝癌病人，所有病人都簽署了知情同意聲明，。
[0118]定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-quantitative PCR)
[0119]利用Absolutely RNA Miniprep Kit (Stratagene)抽提細胞中的總 RNA,經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄后得到 cDNA。RT-qPCR 利用 SYBR Green qPCR Master Mix 試劑在 Mx3005PTM 定量PCR儀(Stratagene)上進行，基因特異性引物列于表1?；虻南鄬RNA水平用內(nèi)標(biāo)基因GAPDH的mRNA水平進行校正。
[0120]表1
【權(quán)利要求】
1.一種?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2基因、或酰基輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2的抑制劑的用途，其特征在于，所述用途選自下組的一種或多種: (a)用于制備治療肝癌的藥物組合物； (b)用于制備治療肝癌擴散轉(zhuǎn)移的藥物組合物； (C)用于制備抑制肝癌體外增殖生長的藥物組合物； (d)用于制備抑制肝癌細胞體外增殖生長的藥物組合物； (e)用于制備抑制肝癌細胞成癌的藥物組合物； (f)用于制備促進肝癌細胞凋亡的藥物組合物。
2.一種?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-2基因、或?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-2的抑制劑的用途，其特征在于，所述用途選自下組的一種或多種: (a)用于制備治療癌癥的藥物組合物； (b)用于制備治療癌癥擴散轉(zhuǎn)移的藥物組合物； (C)用于制備抑制癌癥的體外增殖生長的藥物組合物； (d)用于制備抑制癌癥細胞體外增殖生長的藥物組合物； (e)用于制備抑制癌癥細胞成癌的藥物組合物；· (f)用于制備促進癌癥細胞凋亡的藥物組合物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的酰基輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2的抑制劑選自下組: Pyripyropene A、或具有相同效應(yīng)的Pyripyropene A衍生物與類似物、或同樣具有抑制?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2效應(yīng)的化合物。
4.一種體外非治療性的抑制肝癌細胞生長的方法，其特征在于，包括步驟(1):在添加酰基輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2的抑制劑的條件下，培養(yǎng)肝癌細胞，從而抑制肝癌細胞的生長；或 所述方法包括步驟(I’):降低?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2基因的表達或降低?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-2的蛋白量或蛋白活性。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，還包括步驟:在培養(yǎng)體系中添加膽固醇代謝物。
6.一種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的載體和作為活性成分的酰基輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2的抑制劑。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物還包括膽固醇代謝物。
8.一種用于治療癌癥的藥盒，其特征在于，所述藥盒包括組分: (a)第一治療劑，所述第一治療劑是含?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-2的抑制劑；和 (b)使用說明書。
9.如權(quán)利要求8所述的藥盒，其特征在于，所述藥盒還包括: (C)第二治療劑，所述第二治療劑是含膽固醇代謝物的藥物制劑。
10.一種治療癌癥的方法，其特征在于，包括步驟:給需要的對象施用酰基輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2的抑制劑，或權(quán)利要求6或7所述的藥物組合物。
【文檔編號】A61K31/4433GK103536922SQ201210244255
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月13日
【發(fā)明者】李伯良, 魯明, 胡西旵, 李琴, 熊纓, 楊新穎, 宋保亮, 胡光晶, 許佳佳, 趙曉楠 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院