乙酰輔酶a增強(qiáng)模塊在增強(qiáng)7-脫氫膽甾醇在微生物中合成的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及己酷輔酶A增強(qiáng)模塊在增強(qiáng)7-脫氨膽醬 醇在微生物中合成的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 維生素D是一種脂溶性維生素，也被看作是一種作用于巧、磯代謝的激素前體，是 人體必需的維生素之一。據(jù)報(bào)道，目前已知的維生素D至少有十種，但最重要的是維生素化 和維生素〇3。其中，維生素是維生素D中生物代謝率最高的一種活性形式。維生素D3主 要是由人體自身合成的；人體皮膚中的7-脫氨膽醬醇吸收太陽(yáng)光中的UVB可W轉(zhuǎn)化為前維 生素進(jìn)而通過分子內(nèi)重排生成熱力學(xué)更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)一一維生素〇3。所W，7-脫氨膽醬 醇是合成維生素D3的重要前體，合成7-脫氨膽醬醇是生產(chǎn)維生素的關(guān)鍵步驟。
[000引 目前，7-脫氨膽醬醇可W通過化學(xué)方法或生物轉(zhuǎn)化的方法合成。但是，化學(xué)合成方 法步驟較多、污染嚴(yán)重、副產(chǎn)物所占比例大；生物轉(zhuǎn)化則多通過動(dòng)物組織催化底物，所得產(chǎn) 物與轉(zhuǎn)化體系難于分離，該些都成為了限制工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。合成生物學(xué)是生產(chǎn)大 規(guī)模且性能穩(wěn)定的天然化合物的新學(xué)科，該種方式主要是通過基因工程手段將天然化合物 合成途徑相關(guān)酶基因?qū)氲浇湍?、大腸桿菌或者植物等一些常用的模式底盤細(xì)胞中，在底 盤細(xì)胞中重新構(gòu)建可W生產(chǎn)天然化合物的途徑，進(jìn)而表達(dá)天然化合物?，F(xiàn)已有利用釀酒酵 母該一生產(chǎn)平臺(tái)從廉價(jià)的碳源出發(fā)合成7-脫氨膽醬醇的報(bào)道。
[0004] 通過采用合成生物學(xué)技術(shù)，荷蘭的化hmannHans-Peter等人通過過表達(dá)截?cái)嗟?HMG1基因、敲除ERG5和ERG6基因、引入脊椎動(dòng)物來源的固醇C-24還原酶基因，實(shí)現(xiàn)了在酵 母中生產(chǎn)7-脫氨膽醬醇。德國(guó)的化ristineLang等人在敲除ERG5和ERG6基因的釀酒酵 母菌株中過表達(dá)ERG1基因、ERG11基因、tHMGR基因和A-24還原酶值24R)基因，構(gòu)建了一 株生產(chǎn)7-脫氨膽醬醇的酵母菌株。但是，現(xiàn)有的重組釀酒酵母菌株7-脫氨膽醬醇的產(chǎn)量 較低，還需要繼續(xù)研發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種己酷輔酶A增強(qiáng)模塊在增強(qiáng)7-脫氨膽 醬醇在微生物中合成的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)當(dāng)在酵母菌中導(dǎo)入己酷輔酶A增強(qiáng)模塊之后，次 級(jí)代謝產(chǎn)物7-脫氨膽醬醇的產(chǎn)量得到顯著提高，說明在微生物中導(dǎo)入己酷輔酶A增強(qiáng)模塊 能夠增強(qiáng)7-脫氨膽醬醇在微生物中的合成量，更有利于7-脫氨膽醬醇的大量生產(chǎn)。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種己酷輔酶A增強(qiáng)模塊在增強(qiáng)7-脫氨膽醬醇在微生物中合成的 應(yīng)用；
[0008] 其中，己酷輔酶A增強(qiáng)模塊包括表達(dá)己醇脫氨酶的基因、表達(dá)己醒脫氨酶的基因、 表達(dá)己酷輔酶A合酶的基因和表達(dá)ATP-巧樣酸裂解酶的基因。
[0009] 在本發(fā)明中，表達(dá)己醇脫氨酶的基因是指該基因的表達(dá)產(chǎn)物具有己醇脫氨酶的活 性，能夠催化己醇轉(zhuǎn)化為己醒。
[0010] 在本發(fā)明中，表達(dá)己醒脫氨酶的基因是指該基因的表達(dá)產(chǎn)物具有己醒脫氨酶的活 性，能夠催化己醒轉(zhuǎn)化為己酸。
[0011] 在本發(fā)明中，表達(dá)己酷輔酶A合酶的基因是指該基因的表達(dá)產(chǎn)物具有己酷輔酶A 合酶的活性，能夠己酸轉(zhuǎn)化為己酷輔酶A。
[0012] 在本發(fā)明中，表達(dá)ATP-巧樣酸裂解酶的基因是指該基因的表達(dá)產(chǎn)物具有ATP-巧 樣酸裂解酶的活性，能夠巧樣酸分解為己酷輔酶A。
[0013] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的應(yīng)用中所用的表達(dá)己酷輔酶A合酶的基 因具有如I、II或III所示的核巧酸序列；
[0014]I具有如SEQIDNO: 1所示的核巧酸序列；
[00巧]II具有如SEQIDNO: 1所示的核巧酸序列30%同源性的序列；
[0016]III具有如SEQIDNO: 1所示的核巧酸序列經(jīng)缺失、取代或添加一個(gè)或多個(gè)核巧酸 獲得的核巧酸序列。
[0017] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的應(yīng)用中所用的表達(dá)ATP-巧樣酸裂 解酶的基因具有如（I)、（II)或（III)所示的核巧酸序列：
[001引 （I)具有如SEQIDNO:2所示的核巧酸序列；
[0019] (II)具有如SEQIDNO: 2所示的核巧酸序列30%同源性的序列；
[0020] (III)具有如SEQIDNO:2所示的核巧酸序列經(jīng)缺失、取代或添加一個(gè)或多個(gè)核巧 酸獲得的核巧酸序列。
[0021] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的應(yīng)用中所用到的表達(dá)己酷輔酶A合 酶的基因具有如SEQIDNO: 1所示的核巧酸序列，標(biāo)記為acs。
[0022] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的應(yīng)用中所用到的表達(dá)ATP-巧樣酸 裂解酶的基因具有如SEQIDN0:2所示的核巧酸序列，標(biāo)記為acl。
[0023] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的應(yīng)用中所用的表達(dá)己醇脫氨酶的基 因具有如SEQIDN0:3所示的核巧酸序列，標(biāo)記為a化2。
[0024] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的應(yīng)用中所用的表達(dá)己醒脫氨酶的基 因具有如SEQIDN0:4所示的核巧酸序列，標(biāo)記為aide。
[00巧]本發(fā)明還提供了一種己酷輔酶A增強(qiáng)模塊，其包括表達(dá)己醇脫氨酶的基因、表達(dá) 己醒脫氨酶的基因、表達(dá)己酷輔酶A合酶的基因和表達(dá)ATP-巧樣酸裂解酶的基因；
[0026] 其中，表達(dá)己酷輔酶A合酶的基因具有如I、II或III所示的核巧酸序列：
[0027]I具有如SEQIDNO: 1所示的核巧酸序列；
[002引II具有如SEQIDNO: 1所示的核巧酸序列30%同源性的序列；
[0029]III具有如SEQIDNO: 1所示的核巧酸序列經(jīng)缺失、取代或添加一個(gè)或多個(gè)核巧酸 獲得的核巧酸序列；
[0030] 表達(dá)ATP-巧樣酸裂解酶的基因具有如（I)、（II)或QII)所示的核巧酸序列： [00引](I)具有如SEQIDNO:2所示的核巧酸序列；
[003引（II)具有如SEQIDNO: 2所示的核巧酸序列30%同源性的序列；
[003引（III)具有如SEQIDNO:2所示的核巧酸序列經(jīng)缺失、取代或添加一個(gè)或多個(gè)核巧 酸獲得的核巧酸序列。
[0034] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的己酷輔酶A增強(qiáng)模塊中的表達(dá)己酷輔酶 A合酶的基因具有如SEQIDNO: 1所示的核巧酸序列，標(biāo)記為acs。
[0035] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的己酷輔酶A增強(qiáng)模塊中的表達(dá) ATP-巧樣酸裂解酶的基因具有如SEQIDN0:2所示的核巧酸序列，標(biāo)記為acl。
[0036] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的己酷輔酶A增強(qiáng)模塊中的表達(dá)己醇脫氨 酶的基因具有如SEQIDN0:3所示的核巧酸序列，標(biāo)記為a化2。
[0037] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的己酷輔酶A增強(qiáng)模塊中的表達(dá)己醒 脫氨酶的基因具有如SEQIDN0:4所示的核巧酸序列，標(biāo)記為aide。
[003引在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的己酷輔酶A增強(qiáng)模塊中表達(dá)己醇脫 氨酶的基因、表達(dá)己醒脫氨酶的基因、表達(dá)己酷輔酶A合酶的基因和表達(dá)ATP-巧樣酸裂解 酶的基因中至少一個(gè)W基因表達(dá)盒的形式存在于該己酷輔酶A增強(qiáng)模塊中。
[0039] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的己酷輔酶A增強(qiáng)模塊中表達(dá)己醇脫 氨酶的基因W基因表達(dá)盒的形式存在于該己酷輔酶A增強(qiáng)模塊，該表達(dá)己醇脫氨酶的基因 表達(dá)盒包括啟動(dòng)子、表達(dá)己醇脫氨酶的基因和終止子。在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，表達(dá) 己醇脫氨酶的基因表達(dá)盒中的啟動(dòng)子為PGI1。在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，表達(dá)己醇脫 氨酶的基因表達(dá)盒中的終止子為GPM1。
[0040] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的己酷輔酶A增強(qiáng)模塊中表達(dá)己醒脫 氨酶的基因W基因表達(dá)盒的形式存在于該己酷輔酶A增強(qiáng)模塊，該表達(dá)己醒脫氨酶的基因 表達(dá)盒包括啟動(dòng)子、表達(dá)己醒脫氨酶的基因和終止子。在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，表達(dá) 己醒脫氨酶的基因表達(dá)盒中的啟動(dòng)子為PGK1。在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，表達(dá)己醒脫 氨酶的基因表達(dá)盒中的終止子為GPD。
[0041] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的己酷輔酶A增強(qiáng)模塊中表達(dá)己酷輔 酶A合酶的基因W基因表達(dá)盒的形式存在于該己酷輔酶A增強(qiáng)模塊，該表達(dá)己酷輔酶A合 酶的基因表達(dá)盒包括啟動(dòng)子、表達(dá)己酷輔酶A合酶的基因和終止子。在本發(fā)明的另外一些 實(shí)施例中，表達(dá)己酷輔酶A合酶的基因表達(dá)盒中的啟動(dòng)子為PDC1。在本發(fā)明的另外一些實(shí) 施例中，表達(dá)己酷輔酶A合酶的基因表達(dá)盒中的終止子為FBA1。
[0042] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的己酷輔酶A增強(qiáng)模塊中表達(dá)ATP-巧 樣酸裂解酶的基因W基因表達(dá)盒的形式存在于該己酷輔酶A增強(qiáng)模塊，該表達(dá)ATP-巧樣酸 裂解酶的基因表達(dá)盒包括啟動(dòng)子、表達(dá)ATP-巧樣酸裂解酶的基因和終止子。在本發(fā)明的另 外一些實(shí)施例中，表達(dá)ATP-巧樣酸裂解酶的基因表達(dá)盒中的啟動(dòng)子為TPI1。在本發(fā)明的另 外一些實(shí)施例中，表