專利名稱：一種構(gòu)建輔酶氧化酶基因與脫氫酶類基因融合的方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種基因工程、生物催化與生物轉(zhuǎn)化，尤其是涉及ー種構(gòu)建輔酶氧化酶基因與脫氫酶類基因融合的方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
輔酶氧化酶是ー類能催化輔酶氧化，將電子從輔酶?jìng)鹘oH2O2或H2O的酶類，實(shí)現(xiàn)了氧化型輔酶的再生，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)還原型輔酶和氧化性輔酶的水平，從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝流向的控制與能量平衡發(fā)揮著不可替代的作用。迄今為止，已經(jīng)有多種酶被研究用來轉(zhuǎn)化再生NAD+:如，谷氨酸鹽脫氫酶(GluDH)、乳酸脫氫酶(LDH)、こ醇脫氫酶(ADH)、NADH氧化酶(NOX)0而NADH氧化酶由于以O(shè)2為底物，不需要添加新的底物；沒有副產(chǎn)物產(chǎn)生，且終產(chǎn) 物水不會(huì)對(duì)與之偶聯(lián)的酶產(chǎn)生抑制；產(chǎn)物容易分離這些優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，其主要生理能
(I)維持細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+平衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝過程。胞內(nèi)氧化還原水平是維持細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的基本必要條件，而細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平極大地依賴于胞內(nèi)兩種嘧啶核苷酸系統(tǒng)，即NADH/NAD+和NADPH/NADP+濃度的比率。(2)作為細(xì)胞內(nèi)氧代謝酶，清除細(xì)胞內(nèi)氧毒性。研究表明氧氣本身不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響，然而在細(xì)胞代謝過程中形成的含氧中間物(如02、0Η_、Η202 等)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧毒性(Fridovich I, et al. Biology, 1998，201:1203-1209)。細(xì)菌中NOX的存在使這些具有氧毒害作用的中間體維持在低水平狀態(tài),從而起到了保護(hù)細(xì)胞免遭氧毒害的作用。(3)發(fā)揮氧傳感器作用。脫氫酶是ー類催化物質(zhì)氧化還原反應(yīng)的酶，天然受體是NAD+或NADP+，脫氫酶的底物經(jīng)這類脫氫酶的催化使NAD (P) +還原生成NAD (P)H0甘油脫氫酶(⑶H)作為其中一種常見的依賴輔酶的氧化還原酶。GDH主要分為三種類型，其中有ー種是依賴NAD+的⑶H (EC1. I. I. 6)，能將甘油轉(zhuǎn)化為DHA，DHA進(jìn)ー步磷酸化，進(jìn)入糖酵解途徑，作為碳源為微生物生長(zhǎng)提供ATP和NADH，在這個(gè)過程中伴隨著NAD+還原生成NADH，這種GDH主要存在于各種細(xì)囷中，如 Bacillus substilis, Aerobacter areogenes, Eschericnia coli 和cellulomonassp.等;另ー種為依賴 NADP+ 的 GDH (EC1. I. I. 72 和 ECl. I. I. 56)，它將甘油氧化為DHA或甘油醛，期間也伴隨著NADP+還原成NADPH，這種⑶H主要存在于霉菌和動(dòng)物組織中。輔酶是一類可以輔助酶蛋白催化反應(yīng)的有機(jī)小分子(Wagner, et al. ISBN, 1975,0-88275-258-8)，能與酶蛋白特異性結(jié)合，它是特定酶活性發(fā)揮所必要的。由于輔酶在酶催化反應(yīng)中其化學(xué)組分發(fā)生了變化，因此可以認(rèn)為輔酶是ー種特殊的底物或者稱為“第二底物”。其中的輔酶I[NAD(H)]和輔酶II [NADP(H)]是氧化還原酶的最主要輔酶。輔酶I即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,簡(jiǎn)稱為NAD或NAD+,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸由一分子煙酰胺核苷酸(NMN)和一分子腺嘌呤二核苷酸聯(lián)結(jié)而成，是氧化還原酶的輔酶，在生物氧化還原系統(tǒng)中起著氫和電子傳遞作用，還原形式NADH，它出現(xiàn)在細(xì)胞很多新陳代謝反應(yīng)中。NAD+在氧化途徑中是電子受體，而NADH在還原途徑是電子供體。煙酰胺核苷酸(NMN)上吡啶環(huán)的C-4位置是輔酶I的反應(yīng)中心，能接受或給出氫負(fù)離子，而分子中的腺嘌呤部分不直接參與氧化還原過程(黎高翔，生物工程學(xué)報(bào)，1985，I (4) :1)氫負(fù)離子含兩個(gè)電子，輔酶在脫氫酶反應(yīng)起著轉(zhuǎn)移氫負(fù)離子(即兩個(gè)電子)的作用。NAD+輔助脫氫酶蛋白作用，它在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)和呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用。中間產(chǎn)物會(huì)將脫下的氫遞給NAD+，使之成為NADH。大部分氧化還原酶發(fā)揮催化作用的時(shí)候需要煙酰型輔酶[NAD(P)+，NAD(P)H]的參與，它在酶促反應(yīng)中與酶蛋白結(jié)合，并作為氧化劑或還原劑直接參與反應(yīng)。而NAD(P) +和NAD(P)H的價(jià)格昂貴，通常比酶促反應(yīng)所得產(chǎn)物要貴得多。因此，從技術(shù)經(jīng)濟(jì)性的角度來看，很有必要對(duì)輔酶進(jìn)行再生并循環(huán)使用。此外，輔酶再生能夠使產(chǎn)物的分離簡(jiǎn)化，并有利于酶促反應(yīng)向正反應(yīng)方向移動(dòng)。由于輔酶的再生對(duì)于維持酶反應(yīng)體系的穩(wěn)定是必要的，因此，輔酶的保留和再生成為酶工程研究中的ー個(gè)重要課題。近些年來，為了解決輔酶NAD+和 NADH再生這ー問題，提出了一系列包括化學(xué)法、電化學(xué)法、光化學(xué)、酶法等的方法，其中尤以酶法再生系統(tǒng)受到廣泛重視。原因主要是(1)化學(xué)法缺乏特異性，鈍化輔酶，化學(xué)試劑污染產(chǎn)物導(dǎo)致分離困難，酶的穩(wěn)定性也受到反應(yīng)介質(zhì)影響，已少有研究；(2)電化學(xué)法再生效率低，有時(shí)還需要一些電子介體參與，其選擇性差(呂陳秋，姜忠義，王姣等，有機(jī)化學(xué)，2004,24(11): 1366-1379)，輔因子易聚合，電極遠(yuǎn)處的酶無(wú)法發(fā)揮催化作用；(3)光化學(xué)法雖然廉價(jià)且潔凈，可是需要光敏劑、電子媒介物、電子供體，至今效率低，體系復(fù)雜；由于酶法再生選擇性好，再生效率高，所以受到廣泛關(guān)注。不同的酶或細(xì)胞參與的各個(gè)再生體系都有其優(yōu)缺點(diǎn)，基于酶或細(xì)胞的穩(wěn)定性及活性、底物和產(chǎn)物對(duì)酶或細(xì)胞的影響程度作為選擇的標(biāo)準(zhǔn)。迄今為止，fomate/FDH再生NADH，已達(dá)到エ業(yè)技術(shù)水平，變異的FDH也能夠有效地再生NADPH。同時(shí)，利用NADH氧化酶再生NAD+由于操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)物容易分離也具有廣闊應(yīng)用前景。融合酶因?yàn)槿诤狭藘煞N酶，而這兩種酶同時(shí)能達(dá)到NAD+和NADH的再生，這使得兩種酶在物理距離上縮短了，同時(shí)促進(jìn)了轉(zhuǎn)移反應(yīng)的反應(yīng)速率。有科學(xué)研究證明融合酶確實(shí)能提高產(chǎn)率。目前有將葡聚糖蔗糖酶和葡聚糖酶融合一起在大腸桿菌中表達(dá)來生產(chǎn)異麥芽寡糖，和単一的酶相比，其葡聚糖蔗糖酶的酶活和葡聚糖酶的酶活分別增長(zhǎng)了
I.5倍和I倍，并且產(chǎn)率也比原來提高了 30倍(Seo, H. S.，Y. J. Koo, et al. Applied andenvironmental microbiology,2000,66(6):2484-2490)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)由于脫氫酶類催化底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物時(shí)輔因子的不斷消耗而導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)率下降等問題，提供ー種構(gòu)建輔酶氧化酶基因與脫氫酶類基因融合的方法和應(yīng)用。所述構(gòu)建輔酶氧化酶基因與脫氫酶類基因融合的方法包括以下步驟I)產(chǎn)融合酶，具體方法為將構(gòu)建好原核表達(dá)菌株BL21-pET32a-gdh-nox接種于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行37°C活化12h，按1%接種量轉(zhuǎn)接至新的200mL培養(yǎng)基中，當(dāng)0D600達(dá)0. 6 0. 8時(shí)，加入終濃度為ImM IPTG進(jìn)行30°C誘導(dǎo)4h，用pH 7. O磷酸鉀緩沖液洗滌菌體2次，離心收集菌體，并測(cè)定各自酶活性；NADH氧化酶(NOX)與甘油脫氫酶(GDH)測(cè)定方法如下超聲破碎將洗滌后的菌體懸浮在緩沖液中，超聲破碎功能300W，超聲時(shí)間4min，隨后在4°C下12000rpm離心lOmin，去除細(xì)胞碎片，所得上清即得粗酶液；NADH氧化酶(NOX)反應(yīng)體系90 μ L pH 7. O磷酸鉀緩沖液，IOyL粗酶液，終濃度為O. 2mM NADH，在340nm每隔6s讀取一點(diǎn)，時(shí)間為Imin ;所述NADH氧化酶來源于短乳桿菌(Lactocbacillus brevisATCC 367,來源于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)；甘油脫氫酶(GDH)反應(yīng)體系30.0mmol/L(NH4) 2S04、0. 2mol/LL 甘油、2. Ommol/LNAD+、I. O μ mo I/L Fe (NH4) 2 (SO4) 2、0. lmol/L 碳酸鉀緩沖溶液(pH 12. O)，反應(yīng)液的總體積為200 μし在340nm每隔6s讀取一點(diǎn)，時(shí)間為Imin ;所述甘油脫氫酶(⑶H)來源于克雷柏菌(Klebsiella pneumoniae DSM 2026)；所述NADH氧化酶基因與脫氫酶類基因融合；

2)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化將離心收集到的重組表達(dá)菌體，重懸在100 200g/L的甘油溶液中，于三角瓶中轉(zhuǎn)化，溫度25°C，轉(zhuǎn)速200rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間為8 10h，用ニ苯胺顯色法測(cè)定目的產(chǎn)物ニ羥基丙
酮得率。所述輔酶氧化酶(即NADH氧化酶，簡(jiǎn)稱Ν0Χ)來源于短乳桿菌(LactocbacillusbrevisATCC 367，來源于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)基因與脫氫酶類基因融合，在制備由脫氫酶類催化合成目的產(chǎn)物中的應(yīng)用。本發(fā)明運(yùn)用重疊延伸PCR技木，將輔酶氧化酶基因與甘油脫氫酶基因融合在一起，形成ー個(gè)開放閱讀框，并構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)BL21-pET32a-gdh-noX。利用全細(xì)胞催化技術(shù)，合成目的產(chǎn)物。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明利用基因融合技術(shù)，克服了脫氫酶類在催化反應(yīng)時(shí)由于輔因子的不斷消耗而帶來目的產(chǎn)物得率下降的難點(diǎn)，從而大大提高目的產(chǎn)物得率，而且同時(shí)利用全細(xì)胞催化技木，穩(wěn)定性好，也可使目的產(chǎn)物易于分離純化，降低エ業(yè)生產(chǎn)成本。


圖I為輔酶再生酶(NOX)基因與脫氫酶(⑶H)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。SI為NOX基因PCR產(chǎn)物，S2、S3為⑶H基因PCR產(chǎn)物，M為DNA標(biāo)準(zhǔn)。圖2為表達(dá)菌株中融合酶基因的BamH I、Xho I雙酶切鑒定結(jié)果。SOI、S02均為pET32a-gdh-nox雙酶切電泳結(jié)果，較小帶為gdh-nox在2000-3000bp,較大帶為pET32a酶切后載體，M為DNA標(biāo)準(zhǔn)。圖3為脫氫酶類催化反應(yīng)時(shí)輔酶自我再生示意圖。融合酶在催化底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的同時(shí)，氧化型輔酶NAD+也在不斷消耗。由于融合酶同時(shí)具有NADH氧化酶功能，能夠?qū)崿F(xiàn)NAD+的再生，從而使得由融合酶催化的反應(yīng)得以持續(xù)進(jìn)行。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I基因組采用東盛生物科技有限公司基因組提取試劑盒。取I. 2mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，置于1.5mL離心管中，12000rpm離心Imin ;向收集到菌體中加入180yL緩沖液(pH8. 020mMTris 2mM EDTA, I. 2%Ttrton 100)和終濃度為 20mg/mL 的溶菌酶，37°C振蕩混勻30min ;加入20 μ L蛋白酶K溶液，55°C水浴30min ;加入裂解液MS，65°C水浴lOmin。加入220 μ L無(wú)水こ醇混勻，顛倒混勻，轉(zhuǎn)移至純化柱中，12000rpm離心Imin ;分別用蛋白液和漂洗液洗滌純化柱；加60 μ L去離子水洗脫，即得Lactobacillus brevisATCC 367基因組DNA。用同樣方法可得Klebsiellapneumoniae DSM 2026 基因組 DNA。
實(shí)施例2引物設(shè)計(jì)為擴(kuò)增上述兩種酶基因，分別設(shè)計(jì)如下兩對(duì)引物Pl CGGGATCCATGCTAAAAGTTATTCAATCTCC,劃線部分為 BamHI 酶切位點(diǎn)；P2 :CCAACAACTGTGACTTTCATACGCGCCAGCCACTGCTGG。P3 CCAGCAGTGGCTGGCGCGTATGAAAGTCACAGTTGTTGG ；P4 :CCGCTCGAGAGCGTTAACTGATTGGG,劃線部分為 Xho I 酶切位點(diǎn)。實(shí)施例3⑶H與NOX基因PCR擴(kuò)增弓丨物P1、P2于擴(kuò)增⑶H基因，P3、P4用于擴(kuò)增NOX基因，擴(kuò)增反應(yīng)體系如表I:表I
權(quán)利要求
1.ー種構(gòu)建輔酶氧化酶基因與脫氫酶類基因融合的方法，其特征在于包括以下步驟 1)產(chǎn)融合酶，具體方法為將構(gòu)建好原核表達(dá)菌株BL21-pET32a-gdh-nOX接種于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行37°C活化12h，按1%接種量轉(zhuǎn)接至新的200mL培養(yǎng)基中，當(dāng)0D600達(dá)O. 6 O. 8時(shí)，加入終濃度為ImM IPTG進(jìn)行30°C誘導(dǎo)4h，用pH 7. O磷酸鉀緩沖液洗滌菌體2次，離心收集菌體，并測(cè)定各自酶活性；NADH氧化酶與甘油脫氫酶測(cè)定方法如下 超聲破碎將洗滌后的菌體懸浮在緩沖液中，超聲破碎功能300W，超聲時(shí)間4min，隨后在4°C下12000rpm離心lOmin，去除細(xì)胞碎片，所得上清即得粗酶液； NADH氧化酶反應(yīng)體系90 μ L pH 7. O磷酸鉀緩沖液，10 μ L粗酶液，終濃度為O. 2mMNADH,在340nm每隔6s讀取一點(diǎn)，時(shí)間為Imin ;所述NADH氧化酶來源于短乳桿菌(Lactocbacillus brevis ATCC 367); 甘油脫氫酶反應(yīng)體系30. Ommol/L (NH4) 2S04、0. 2mol/LL 甘油、2. Ommo I/L NAD+、1.0ymol/L Fe (NH4)2(SO4)2、0· lmol/L碳酸鉀緩沖溶液，反應(yīng)液的總體積為200 μ L0在340nm姆隔6s讀取一點(diǎn)，時(shí)間為Imin ;所述甘油脫氫酶來源于克雷柏菌(Klebsiellapneumoniae DSM2026)； 所述NADH氧化酶基因與脫氫酶類基因融合； 2)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化 將離心收集到的重組表達(dá)菌體，重懸在100 200g/L的甘油溶液中，于三角瓶中轉(zhuǎn)化，溫度25°C，轉(zhuǎn)速200rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間為8 10h，用ニ苯胺顯色法測(cè)定目的產(chǎn)物ニ羥基丙酮得率。
2.輔酶氧化酶基因與脫氫酶類基因融合，在制備由脫氫酶類催化合成目的產(chǎn)物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種構(gòu)建輔酶氧化酶基因與脫氫酶類基因融合的方法和應(yīng)用，涉及一種基因工程、生物催化與生物轉(zhuǎn)化。運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)，將輔酶氧化酶基因與甘油脫氫酶基因融合在一起，形成一個(gè)開放閱讀框，并構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)BL21-pET32a-gdh-nox。利用全細(xì)胞催化技術(shù)，合成目的產(chǎn)物。所述輔酶氧化酶基因與脫氫酶類基因融合，在制備由脫氫酶類催化合成目的產(chǎn)物中的應(yīng)用。利用基因融合技術(shù)，克服了脫氫酶類在催化反應(yīng)時(shí)由于輔因子的不斷消耗而帶來目的產(chǎn)物得率下降的難點(diǎn)，從而大大提高目的產(chǎn)物得率，而且同時(shí)利用全細(xì)胞催化技術(shù)，穩(wěn)定性好，也可使目的產(chǎn)物易于分離純化，降低工業(yè)生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12N9/04GK102732488SQ20121022069
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者周強(qiáng), 方柏山, 王靜 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)