專利名稱：一種解淀粉芽孢桿菌及其菌劑和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)用與環(huán)保境微生物菌劑領(lǐng)域，具體地說涉及一種解淀粉芽孢桿菌，以及利用該解淀粉芽孢桿菌生產(chǎn)的微生物菌劑、制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
天然湖泊和人工養(yǎng)殖水體的富營(yíng)養(yǎng)化已成為我國(guó)目前及今后相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)期內(nèi)的重大水環(huán)境問題。我國(guó)除了滇池、太湖和巢湖三大淡水湖泊已發(fā)生嚴(yán)重的藍(lán)藻水華危害外，長(zhǎng)江中下游的許多湖泊和水庫也都相繼發(fā)生藍(lán)藻水華污染現(xiàn)象并檢測(cè)到藻毒素的存在。由于片面追求水庫和魚塘漁業(yè)的產(chǎn)量，大量施肥和投餌所帶來的過量外源氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素已導(dǎo)致水體的嚴(yán)重富營(yíng)養(yǎng)化，許多水庫有害藍(lán)藻頻發(fā)，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。微囊藻屬M(fèi)icrocystis是藍(lán)藻(藍(lán)細(xì)菌)中一個(gè)很重要的類群，因其在世界各地產(chǎn)生嚴(yán)重的水華并形成藻毒素，直接影響水生態(tài)環(huán)境的安全，該屬的銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)是許多湖泊和水庫發(fā)生富營(yíng)養(yǎng)化時(shí)的優(yōu)勢(shì)藻種和主要產(chǎn)毒株。(Sivonen，K.Cyanobacterial toxins and toxin production. Phycologia, 1996，35 :12 - 24 ;聞海，潘綱，張明明.微囊藻毒素研究進(jìn)展，生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，22 (11) :1968-1975.)目前，藻類的控制及治理技術(shù)主要分為物理法、化學(xué)法和生物法三種。傳統(tǒng)的物理除藻方法雖然有一定效果且無污染，但需要投入大量的人力物力，且治標(biāo)不治本。采用化學(xué)藥劑除藻，硫酸銅是治理藍(lán)藻水華和赤潮中常用的化學(xué)藥品，但是硫酸銅容易造成局部濃度過高而對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不利的影響，且不可避免地造成二次環(huán)境污染，濫用化學(xué)除藻劑等已對(duì)水產(chǎn)品的安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。與傳統(tǒng)的機(jī)械除藻和施用化學(xué)除藻劑等方法相比，微生物控藻技術(shù)因具有成本低和環(huán)境安全性好等方面突出優(yōu)勢(shì)而受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種溶藻細(xì)菌、藍(lán)藻嗜菌體和真菌能裂解藻類營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞或破壞細(xì)胞。有人從水華銅綠微囊藻中分離出一種類似噬菌體的藻類病毒，該病毒能夠感染銅綠微囊藻的細(xì)胞并使藻細(xì)胞溶角軍(Manage P M, Kawabata Z, Akano S N. Dynamics of cyanophage-1 ike particlesand algicidal bacteria causing Microcystis aeruginosa mortality. Limnology,2001,2(2) :73-78.)。馬宏瑞等分離出具有溶藻作用的芽孢桿菌Z5，其無菌濾液對(duì)處于穩(wěn)定期的銅綠微囊藻的去除效果達(dá)到91. 36% (馬宏瑞，章欣，王曉蓉等.芽孢桿菌Z5溶銅綠微囊藻特性研究。中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2011，31 (5) :828 833.)李雪梅等將EM應(yīng)用于藻型富營(yíng)養(yǎng)化的湖泊水體中，結(jié)果表明有效微生物群對(duì)水體的透明度、葉綠素a含量的改善有明顯的效果，水中的溶解氧含量和水體的透明度上升(李雪梅，楊中藝，簡(jiǎn)曙光等.有效微生物群控制富營(yíng)養(yǎng)化湖泊藍(lán)藻的效應(yīng).中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2000，39 (I) 81-85.)；王平等考察了有效微生物群(EM)對(duì)3種常見“水華”藻類生長(zhǎng)的抑制作用及適宜條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EM能顯著抑制衣藻、四尾柵裂藻和盤星藻的生長(zhǎng)，3種藻類生物量平均降低率分別46. 80%,99. 07%和97. 17% (王平，吳曉芙，李科林等.有效微生物群(EM)抑藻效應(yīng)研究·環(huán)境科學(xué)研究，2004, 17 (3) 34-38)。芽孢桿菌被認(rèn)為兼有改善水生動(dòng)物消化道和改良水環(huán)境的雙重功效而受重視(吳希陽等，芽胞桿菌益生菌在水產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用，漁業(yè)現(xiàn)代化，2007，4)。呂樂等對(duì)投加由芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌、放線菌和沼澤紅假單胞菌組成的環(huán)境有效微生物菌劑(EM菌劑)治理藍(lán)藻水華污染的效果進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照相比，投加千分之一比例的EM菌劑不僅可以快速降低藍(lán)藻數(shù)量，使藍(lán)藻生物量減少55%以上，而且能夠迅速降低水體中的氨氮、亞硝酸氮、總氮和磷酸鹽濃度并維持在較低水平波動(dòng)，從而降低了形成藍(lán)藻水華所需要的氮和磷營(yíng)養(yǎng)元素(呂樂等，環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2010，8)。解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細(xì)菌,近年對(duì)解淀粉芽孢桿菌的研究與探索越來越多，由于其自身具有廣泛地抑制真菌與細(xì)菌的能力，因而成為具有生物農(nóng)藥開發(fā)潛力的微生物。王英國(guó)等從堆肥中分離到I株解淀粉芽孢桿菌，其對(duì)于尖孢鐮刀菌、草莓蛇病菌等植物病原真菌均有很強(qiáng)的抑制作用(王英國(guó)等，中國(guó)生物工程雜志，2007，12)ο Chen L等報(bào)道了從深海沉積物中分離獲得B. amyloliquefaciens SH-B10菌株能夠產(chǎn)生2種抗真菌的脂肽化合物,對(duì)5種植物病原真菌具有顯著抑制作用(Chen L等,BioresourTechnol. 2010)。利用溶藻細(xì)菌控制藍(lán)藻水化的研究，最早由日本研究者報(bào)道分離到具有溶藻作用的臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus) (Nakamura N, et al·，Water Sci Technol. 2002 ；Nobuyukinakamura, et al. , J. Bioscience and Bioengineering, 2003),但該菌株存在安全性問題，在我國(guó)微生物肥料生物安全分級(jí)目錄中屬于第三級(jí)的需要做致病性試驗(yàn)的菌種，不宜作為微生態(tài)菌劑的生產(chǎn)菌株(微生物肥料生物安全通用技術(shù)準(zhǔn)則NY1109-2006)。AhnCY等報(bào)道B. subtilis Cl在肉湯培養(yǎng)基上能產(chǎn)生一種生物表面活性物質(zhì)，對(duì)水華藻銅綠微囊藻的去除率達(dá)85%(Ahn CY等Biotechnol Lett. 2003)。盧蘭蘭等分離獲得一株溶藻細(xì)菌DC-L5，通過形態(tài)及16S rDNA測(cè)序分析鑒定為短小芽孢桿(盧蘭蘭等，水生生物學(xué)報(bào)，2009)。解淀粉芽孢桿菌在自然界廣泛分布，可通過分泌抗生素、抗菌蛋白或多肽類物質(zhì)起到生物防治作用。李超等報(bào)道了一株解淀粉芽孢桿菌DC1，對(duì)水華魚腥藻具有高效抑藻效果(李超等，環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2011, 31(8))。中國(guó)專利ZL200910070709. 8公開了一株解淀粉芽孢桿菌及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用，菌株CGMCC3261使養(yǎng)殖水體中的硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、COD等含量降低，可規(guī)?；a(chǎn)用于改善水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境，但未見該菌種具溶藻效果的報(bào)道。中國(guó)專利ZL201010614948. 8也公開了一種解淀粉芽孢桿菌，菌株CGMCC4516對(duì)水華魚腥藻的抑制率最高僅達(dá)95. 54%，溶藻效果一般且未見該菌種有使水體中的硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、COD下降報(bào)道。水華魚腥藻(Anabaena flosaquae)為一種多細(xì)胞絲狀藍(lán)藻，而銅綠微囊藻為一種單細(xì)胞球狀藍(lán)藻，它們?yōu)椴煌瑢俚乃{(lán)藻。更重要的是，目前尚未見解淀粉芽孢桿菌既對(duì)銅綠微囊藻等有害藻類有抑制作用，同時(shí)又對(duì)有益藻種小球藻具有促進(jìn)作用的報(bào)道。發(fā)明技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種既可抑制有害藻，又可促有益藻生長(zhǎng)并可降低水體中的氨氮和亞硝酸鹽等含量的解淀粉芽孢桿菌菌株。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有解淀粉芽孢桿菌菌株的微生物菌劑及其制備方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種解淀粉芽孢桿菌及其微生物菌劑在防治微囊藻水華上的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種解淀粉芽孢桿菌及其微生物菌劑在發(fā)酵生產(chǎn)水、產(chǎn)動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種解淀粉芽孢桿菌及其微生物菌劑在養(yǎng)殖水體生態(tài)修復(fù)上的應(yīng)用。本發(fā)明公開了一株新的解淀粉芽孢桿菌，其特征在于，該菌株為解淀粉芽孢桿菌Tl (Bacillus amyloliquefaciens Tl),保藏于國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏機(jī)構(gòu)-中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2012184，保藏日期是2012年5月28日。中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心簡(jiǎn)稱CCTCC，位于湖北省武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)，郵編430072，電話027-68752319, Email c ctcciwhu. edu. cn。解淀粉芽孢桿菌Tl株是從武漢市東西湖區(qū)農(nóng)田土壤中分離經(jīng)篩選獲得。該菌株有如下特征解淀粉芽孢桿菌Tl可產(chǎn)抑制銅綠微囊藻的活性物質(zhì)，其發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻的抑制率達(dá)98. 8%，無菌過濾液對(duì)銅綠微囊藻的抑制率達(dá)100%,同時(shí)Tl菌株發(fā)酵液對(duì)小球藻具有明顯的促生作用，促生率達(dá)78. 1%。由Tl菌株經(jīng)發(fā)酵制備的液體菌劑對(duì)水體中氨氮和亞硝酸鹽的去除率分別達(dá)到53. 7%和65. 6%。即解淀粉芽孢桿菌Tl株具有較強(qiáng)的抑制有害藍(lán)藻銅綠微囊藻的生長(zhǎng)并促進(jìn)有益藻種小球藻的生長(zhǎng)的能力，對(duì)水體中有害物質(zhì)氨氮和亞硝酸鹽的去除效果較好。解淀粉芽孢桿菌Tl株形態(tài)特征是菌落淡黃色、形狀為規(guī)則圓形、表面隆起、干燥。細(xì)胞為桿狀，產(chǎn)芽孢。解淀粉芽孢桿菌Tl株生化特征是可利用葡萄糖，蔗糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、淀粉、乳糖、檸檬酸三鈉；不能利用甘油。能在含7%NaCl的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。解淀粉芽孢桿菌Tl株生長(zhǎng)特征是牛肉膏蛋白胨平板上劃線接種，分別在37°C至45°C下培養(yǎng)均生長(zhǎng)良好，在50°C下能夠生長(zhǎng)。解淀粉芽孢桿菌Tl株16S rDNA基因序列分析顯示解淀粉芽孢桿菌Tl株與Bacillus amyloliquefaciens DSM7 菌株的同源性大于 99%。本發(fā)明還公開了一種含解淀粉芽孢桿菌Tl的菌劑，該菌劑組合物主要成份是解淀粉芽孢桿菌Tl株及其胞外產(chǎn)物和發(fā)酵基質(zhì)。本發(fā)明的還公開了解淀粉芽孢桿菌Tl及其微生物菌劑在防治微囊藻水華上的應(yīng)用。本發(fā)明的還公開了解淀粉芽孢桿菌Tl及其微生物菌劑在發(fā)酵生產(chǎn)水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。本發(fā)明的還公開了解淀粉芽孢桿菌Tl及其微生物菌劑在養(yǎng)殖水體生態(tài)修復(fù)上的應(yīng)用。在本發(fā)明中采用的參比菌株均為普通微生物菌種，其中解淀粉芽孢桿菌ACCC10225，枯草芽孢桿菌CICC10071分別登載于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心和中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心目錄中，處于公開狀態(tài)，科學(xué)工作者可向該菌種保藏中心索取。銅綠微囊藻為FACHB905和蛋白核小球藻405均來源于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所藻種保藏中心(FACHB)，可公開索取。本發(fā)明公開的益生菌劑為液態(tài)或固態(tài)。優(yōu)先的，本發(fā)明公開的Tl芽孢桿菌菌劑為固態(tài)。本發(fā)明還公開了制備固態(tài)菌劑的方法，包括如下步驟(I)Tl菌種活化用接種環(huán)挑取一環(huán)Tl菌種接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基中，置37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20-24h。(2)種子液的制備挑取一環(huán)經(jīng)活化的Tl菌株接入裝有IOOmL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 0C、180r/min搖床培養(yǎng)24h備用。(3)固體發(fā)酵培養(yǎng)基制備按玉米粉20%，麩皮20%，米糠40%，菜籽柏20%，料水=1 :1，PH自然，混合均勻，配制成固體發(fā)酵培養(yǎng)基，并分裝于耐高溫的塑料方盒中，120°C滅菌30min后冷卻待用。(4)固體菌劑培養(yǎng)按5-10%接種量接入預(yù)先培養(yǎng)好的Tl種子液至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混合均勻后置37°C，濕度為85%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，每12h攪拌一次。(5)干燥及粉碎將上述發(fā)酵完畢的Tl固體培養(yǎng)物置于55°C烘箱中烘至含水率低于10%，用萬能粉碎機(jī)將干燥的培養(yǎng)物粉碎、過100目篩后，制備成固體粉末狀菌劑并裝入密封的塑料袋中，放置干燥、陰涼處或冰箱保鮮層中保藏。 (6)采用稀釋平板測(cè)數(shù)法檢測(cè)樣品中Tl芽孢桿菌的活菌數(shù)達(dá)100-200億cfu/克。本發(fā)明還公開了制備液態(tài)菌劑的方法，包括如下步驟(I)Tl菌種活化用接種環(huán)挑取一環(huán)Tl菌株接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)20h。(2)種子液的制備挑取一環(huán)經(jīng)活化的Tl菌株接入裝有IOOmL的牛肉膏蛋白胨三角瓶液體培養(yǎng)基中，37°C 180r/min搖床培養(yǎng)24h備用。(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基制備按蔗糖4%，酵母膏2%，蛋白胨1%, KH2PO4O. 05%, MgSO4O. 02%, pH6. 5 7. O 配制成液體培養(yǎng)基，120°C滅菌 20min 備用。(4)液體菌劑培養(yǎng)按5-10%接種量接入預(yù)先培養(yǎng)好的Tl種子液至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、180r/min 搖床培養(yǎng) 18_24h。(5)包裝及保存將培養(yǎng)好的Tl菌液裝入密封的塑料瓶中制備成液體菌劑，置冰箱保鮮層中保藏。(6)活菌數(shù)的測(cè)定采用稀釋平板測(cè)數(shù)法測(cè)定樣品中Tl芽孢桿菌的活菌數(shù)達(dá)10-20 億 cfu/mL。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)I、相同培養(yǎng)條件下，解淀粉芽孢桿菌Tl菌株對(duì)銅綠微囊藻的溶藻活性很高，其牛肉膏蛋白胨發(fā)酵液對(duì)藻細(xì)胞的抑制率達(dá)98. 8%，分別比參比菌株解淀粉芽孢桿菌ACCC10225和枯草芽孢桿菌CICC10071抑藻率高35. 1%和29. 3%。Tl菌株發(fā)酵的無菌過濾液對(duì)銅綠微囊藻的抑制率達(dá)100%，分別比參比菌株ACCC10225和CICC10071高37. 7%和40. 3%。遠(yuǎn)高于目前所報(bào)道的其他溶藻菌株的抑藻活性(中國(guó)專利ZL201010614948. 8中菌株CGMCC4516對(duì)水華魚腥藻的抑制率最高僅達(dá)95. 54%)。同時(shí)，Tl芽孢桿菌產(chǎn)生的抑藻活性物質(zhì)具有較好的耐高溫能力。添加O. 1%和O. 05%劑量的Tl固體菌劑對(duì)微囊藻的抑制率分別達(dá)到100%和88. 9%ο2、生物安全性好，解淀粉芽孢桿菌為我國(guó)微生物肥料菌種目錄中第一級(jí)免作毒理學(xué)試驗(yàn)的菌種。3,Tl菌株發(fā)酵液可明顯促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)，促生率78. 1%。添加O. 01%的Tl固體菌劑對(duì)銅綠微囊藻有一定抑制作用的同時(shí)，可明顯增加水體中其他類型有益藻的種類和數(shù)量，具有調(diào)控和優(yōu)化水體浮游生物結(jié)構(gòu)的能力。
4,Tl液體菌劑對(duì)水體中氨氮和亞硝酸鹽的去除率分別達(dá)到53. 7%和65. 6%。具有明顯改善養(yǎng)殖水體生態(tài)環(huán)境的功能。


圖I是解淀粉芽孢桿菌Tl菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹圖
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例實(shí)施例I解淀粉芽孢桿菌Tl菌株的分離與鑒定I. I解淀粉芽孢桿菌Tl菌株的分離從武漢市東西湖農(nóng)場(chǎng)采集農(nóng)田土壤樣品，稱 取土樣10g，加入90ml無菌水的三角燒瓶中，振蕩，使土樣與水充分混合，置80°C水浴鍋中處理30分鐘。用微量取液器從中吸取Iml 土壤懸液加入9ml試管無菌水中充分混勻，進(jìn)行系列稀釋，取O. ImL適當(dāng)稀釋度的菌懸液涂布牛肉膏蛋白胨平板，37°C恒溫培養(yǎng)2d，挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落，經(jīng)簡(jiǎn)單染色用顯微鏡觀察到芽孢后，分別接種到牛肉膏蛋白胨平板上，37°C恒溫培養(yǎng)2d，進(jìn)行菌株編號(hào)，然后分別接種各芽孢桿菌菌株于牛肉膏蛋白胨液體三角瓶培養(yǎng)基中，置37°C，180r/min搖床上培養(yǎng)30h，取Iml菌液用用細(xì)菌過濾器過濾除去菌體，取O. 2ml無菌濾液加至含IOml銅綠微囊藻905藻液的培養(yǎng)瓶中，空白對(duì)照用O. 2ml無菌水代替無菌濾液。25°C光照培養(yǎng)5d，觀察比較各芽孢桿菌菌株無菌濾液的溶藻效果。采用此方法經(jīng)篩選后獲得I株具有明顯溶藻效果的芽孢桿菌，菌株編號(hào)為Tl，其用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)的菌液的溶藻率達(dá)98. 8% (表2)，其牛肉膏蛋白胨發(fā)酵液的無菌濾液抑藻率高達(dá)100% (表 3)。本發(fā)明人將分離的一株新的解淀粉芽孢桿菌Tl株(Bacillus amyloliquefaciensTl)保藏于國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏機(jī)構(gòu)-中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCM2012184，保藏日期是2012年5月28日。中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心簡(jiǎn)稱CCTCC，位于湖北省武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)，郵編 430072，電話:027-68752319,Email cctcciwhu. edu. cn。I. 2解淀粉芽孢桿菌Tl株的鑒定通過形態(tài)特征觀察、生理生化測(cè)定及16SrDNA基因序列分析結(jié)果對(duì)Tl進(jìn)行鑒定。在鑒定中，本實(shí)驗(yàn)選擇枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis CICC10071、和解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensACCC10225菌株作為對(duì)照菌株?？莶菅挎邨U菌和解淀粉芽孢桿菌為常用普通微生物菌種，分別登載于中國(guó)工業(yè)菌種保藏中心和中國(guó)農(nóng)業(yè)菌種保藏中心目錄，處于公開狀態(tài)，科學(xué)工作者可向保藏中心索取。I. 2. I解淀粉芽孢桿菌Tl株形態(tài)特征觀察菌落淡黃色、形狀為規(guī)則圓形、表面隆起、干燥。細(xì)胞為桿狀，產(chǎn)橢圓形芽孢。I. 2. 2通過16S rDNA序列分析進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育地位鑒定以基因組DNA為模板作PCR擴(kuò)增16S rDNA,擴(kuò)增引物采用通用引物16S-27F(5，-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ )和 16S-1492R (5，-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’ )。PCR 反應(yīng)體系(25 μ L) : 10XPCR 緩沖液(含 20mmol/L 的 Mg2+) 2. 5 μ L,引物16S-27F/16S-1492RC10 μ mol/L)各 I μ L,模板 DNA(約 50ng/mL)l. 8/2. 8 μ L, dNTP( IOmmol/L each) O. 5 μ L，Taq 酶(5U/μ L) 0· 2 μ L，雙蒸水 18/17 μ L。PCR 擴(kuò)增條件94 °C 預(yù)變性5min, 94°C變性40s，53°C退火40s，72°C延伸60s，30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸5min。所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，用校正后的分離菌株的16S rDNA序列，在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索(BLAST search)，以比較分離菌株與已知細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株相應(yīng)序列的相似程度。根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，下載相關(guān)細(xì)菌菌種的16S rDNA序列，與分離菌株的序列放在一起，用ClustalXl. 8軟進(jìn)行多序列匹配排列，通過Neighbor-Joining分析方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并進(jìn)行1000次bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)得到1042bp的基因序列，在Genbank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索，Tl 與 Bacillus amyloliquefaciens DSM7 的同源性超過 99%,符合 Kuttzman&Robnett 所定的同種內(nèi)不同菌株見差異不超過1%的標(biāo)準(zhǔn)。圖I是根據(jù)16S rDNA序列所做的系統(tǒng)發(fā)育樹。I. 2. 3 :解淀粉芽孢桿菌Tl株的生理生化實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見表I。根據(jù)16S rDNA序列分析結(jié)果和生理生化實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，參照文獻(xiàn)報(bào)道(東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè).北京科學(xué)出版社，2001，267-295.)，可判斷Tl菌為解淀粉芽孢桿菌。 表I解淀粉芽孢桿菌Tl株的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一株解淀粉芽孢桿菌，其特征在于，該菌株為解淀粉芽孢桿菌Tl ( Bacillusamyloliquefaciens Tl),保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2012184。
2.一種含權(quán)利要求I中所述的解淀粉芽孢桿菌Tl的微生物菌劑，其特征在于其活性成分為解淀粉芽孢桿菌Tl菌體及其代謝產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的微生物菌劑，其特征在于所述的菌劑為固態(tài)菌劑和液態(tài)菌劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的微生物菌劑，其特征在于所述的菌劑為固態(tài)菌劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的微生物菌劑，其特征在于所述的菌劑為液態(tài)菌劑。
6.制備權(quán)利要求4中所述的固體菌劑的制備方法，該方法包括如下步驟 (O菌種活化用接種環(huán)挑取一環(huán)Tl菌種接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基中，置37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20-24h ； (2)種子液的制備挑取一環(huán)經(jīng)活化的Tl菌株接入裝有IOOmL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37°C、180r/min搖床培養(yǎng)24h備用； (3)固體發(fā)酵培養(yǎng)基制備按玉米粉20%，麩皮20%，米糠40%，菜籽柏20%，料水=1:1，PH自然，混合均勻，配制成固體發(fā)酵培養(yǎng)基，并分裝于耐高溫的塑料方盒中，120°C滅菌30min后冷卻待用； (4)固體菌劑培養(yǎng)按5-10%接種量接入預(yù)先培養(yǎng)好的Tl種子液至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混合均勻后置37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，每12h攪拌一次； (5)干燥、粉碎及包裝將上述發(fā)酵完畢的固體培養(yǎng)物置于55°C烘箱中烘至含水率低于10%，用萬能粉碎機(jī)將干燥的培養(yǎng)物粉碎、過100目篩后，制備成固體粉末狀菌劑并裝入密封的塑料袋中，放置干燥、陰涼處或冰箱保鮮層中保藏。
7.制備權(quán)利要求5中所述的液體菌劑的制備方法，該方法包括如下步驟 (O Tl菌種活化及液體培養(yǎng)挑取一接種環(huán)Tl菌株接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基中，置恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)20h ;挑取經(jīng)活化的Tl菌株接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 0C、180r/min搖床培養(yǎng)24h備用； (2)液體發(fā)酵培養(yǎng)基制備按蔗糖4%，酵母膏2%，蛋白胨1%，KH2PO4O. 05%, MgSO4O. 02%，pH6. 5 7. O配制成液體培養(yǎng)基，120°C滅菌20min備用； (3)液體菌劑培養(yǎng)按5-10%接種量接入預(yù)先培養(yǎng)好的Tl種子液至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、180r/min 搖床培養(yǎng) 18_24h ； (4)包裝及保存將培養(yǎng)好的Tl菌液裝入密封的塑料瓶中制備成液體菌劑，置冰箱保鮮層中保減。
8.權(quán)利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌Tl在水體中防治有害水華藍(lán)藻上的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌菌劑在防治微囊藻水華上的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌Tl在發(fā)酵生產(chǎn)水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌菌劑在發(fā)酵生產(chǎn)水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌Tl在養(yǎng)殖水體生態(tài)修復(fù)上的應(yīng)用。
13.權(quán)利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌菌劑在養(yǎng)殖水體生態(tài)修復(fù)上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種既可抑制有害藻，又可促有益藻生長(zhǎng)的解淀粉芽孢桿菌菌株，該菌株還可降低水體中的氨氮和亞硝酸鹽等有害物含量。本發(fā)明還提供了制備解淀粉芽孢桿菌菌劑的方法。本發(fā)明提供的淀粉芽孢桿菌及其微生物菌劑可防治微囊藻水華、修復(fù)養(yǎng)殖水體生態(tài)，并可應(yīng)用在發(fā)酵生產(chǎn)水產(chǎn)動(dòng)物飼料中。
文檔編號(hào)C12R1/07GK102719383SQ201210219470
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月29日
發(fā)明者于靚, 曾馳, 繆禮鴻, 許波, 高素芹 申請(qǐng)人:武漢工業(yè)學(xué)院