一株高產(chǎn)中性蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株高產(chǎn)中性蛋白酶的解淀粉芽孢桿 菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白酶是催化肽鍵水解的一類酶，可將大分子的蛋白質(zhì)水解為氨基酸、小肽等產(chǎn) 物。中性蛋白酶是指最適作用PH為6. 0-7. 5的一類蛋白酶，作為一種生物催化劑，它具有 催化反應(yīng)速度快，無工業(yè)污染，催化反應(yīng)條件適應(yīng)性寬等的性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)。微生物由于具有生 長速度快、所需生長空間小、廣泛的生化多樣性及其遺傳可操作性等特點(diǎn)，因而備受人們的 青睞。據(jù)統(tǒng)計(jì)，微生物蛋白酶占據(jù)了世界整個(gè)酶銷售市場約40%左右的份額，已成為市場上 蛋白酶生產(chǎn)的主要來源。大多數(shù)市售中性蛋白酶大都產(chǎn)自芽孢桿菌屬。
[0003] 中性蛋白酶是最早為人類所發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶制劑之一。目前中 性蛋白酶已被廣泛的應(yīng)用于食品、皮革、毛皮、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)。其中，在畜禽飼料配方 中添加中性蛋白酶，可有效提高蛋白質(zhì)的利用率和降低飼養(yǎng)成本；另外，中性蛋白酶具有較 強(qiáng)的脫毛能力，能夠避免傳統(tǒng)的皮革加工使用硫酸鈉進(jìn)行處理造成的環(huán)境污染；中性蛋白 酶應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)中，可排除蛋白質(zhì)產(chǎn)生的"冷渾濁"現(xiàn)象；在洗滌劑用品中加入中性蛋白 酶可大大提高洗滌效果；在醫(yī)藥行業(yè)中，中性蛋白酶還可作為消化、消炎、化痰止咳等藥物， 以及用于治療跌打傷、水腫血腫，消除壞死組織等。
[0004] 中性蛋白酶的研究開發(fā)工作自上世紀(jì)七十年代就已開始，國內(nèi)外都于上世紀(jì)八十 年代初實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，但中性蛋白酶發(fā)酵單位一直很低，發(fā)酵不穩(wěn)定，易受噬菌體和酵母的污 染。因此國內(nèi)外科技工作者一直致力于加速開發(fā)新型中性蛋白酶高產(chǎn)菌株，提高生產(chǎn)菌株 的產(chǎn)酶能力，從而降低中性蛋白酶的生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)中性蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌 awjioJi識(shí)/e/acieas)及其應(yīng)用。本發(fā)明通過紫外誘變的方法篩選出一株中性蛋白酶高產(chǎn)菌 株，該菌株能高效分泌表達(dá)中性蛋白酶，為中性蛋白酶的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明一方面涉及一種解淀粉芽孢桿菌突變株，為解淀粉芽孢桿菌FN61 a野ioJit/i/e/'acieas1FN61)，已于2015年9月14日保藏于中國武漢武漢大學(xué) 的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2015527。
[0007] 本發(fā)明另一方面涉及一種中性蛋白酶，是由上述解淀粉芽孢桿菌突變株FN61發(fā) 酵得到的。
[0008] 所述中性蛋白酶在飼料和食品加工領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明通過紫外誘變的方法獲得的突變菌株解淀粉芽孢桿菌FN61能顯著提高中 性蛋白酶的產(chǎn)量，20L罐發(fā)酵酶活高達(dá)14135U/ml，較出發(fā)菌提高了 42%。該突變菌所產(chǎn)中 性蛋白酶的最適作用pH為7. 5,與出發(fā)菌株一致，但突變菌產(chǎn)的蛋白酶在pH6. 5-8. 5范圍內(nèi) 的相對酶活普遍高于出發(fā)菌，從而說明突變菌產(chǎn)的蛋白酶比出發(fā)菌更適合在中性條件下發(fā) 揮作用；該突變菌產(chǎn)的蛋白酶最適作用溫度為40°C，較出發(fā)菌沒有發(fā)生改變，取得了意料 不到的技術(shù)效果。本發(fā)明所述突變菌株FN61產(chǎn)中性蛋白酶可廣泛應(yīng)用于飼料和食品加工 領(lǐng)域，前景廣闊。
【附圖說明】
[0010] 圖1為突變菌FN61和出發(fā)菌FN產(chǎn)蛋白酶的作用pH-相對酶活曲線圖； 圖2為突變菌FN61和出發(fā)菌FN產(chǎn)蛋白酶的作用溫度-相對酶活曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說明，實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，可按常規(guī)條件，如J.薩姆布魯克（Sambrook)等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條 件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。本領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)人員可以借助實(shí)施例更好地理解 和掌握本發(fā)明。但是，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法不應(yīng)限于本發(fā)明實(shí)施例所記載的具體方法步驟。
[0012] 對于本發(fā)明所涉及的術(shù)語及相關(guān)測定方法解釋如下： 1、 蛋白酶酶活測定方法：采用中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶制劑測定方法（GB/ T25327-2009). 2、 酶活單位的定義：Ig固體酶粉(或ImL液體酶)，在一定溫度和pH條件下，Imin水 解酪蛋白產(chǎn)生Iyg酪氨酸，即為1個(gè)酶活力單位，以U/g(U/mL)表示。
[0013] 3、運(yùn)用福林法進(jìn)行蛋白酶活力測定，使用到的溶液包括：福林使用溶液(一份市售 福林溶液與兩份水混合，搖勻)，碳酸鈉溶液（42.4g/L)，三氯乙酸（65.4g/L)，梯度pH值緩 沖液，酪蛋白溶液（10. 0g/L)。反應(yīng)過程如下：試管中加入ImL酶液，40°C溫浴2min，加 入酪蛋白溶液ImL，搖勻后40°C溫浴10min，加入2mL三氯乙酸溶液，搖勻（空白對照先 加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液)。取出靜止10min，慢性定性濾紙過濾。取ImL濾液， 加碳酸鈉溶液5mL，加福林試劑使用溶液ImL，40°C顯色20min，于680nm波長，用10mm 比色皿測定吸光度。
[0014] 實(shí)施例1出發(fā)菌解淀粉芽孢桿菌FN的紫外誘變與篩選 出發(fā)菌：解淀粉芽孢桿菌FNa野ioJi識(shí)/efacieasFN)，該菌株由發(fā)明人付 娟于2014年5月分離自山東省青島市嶗山區(qū)林場土壤中，能發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶。
[0015] 菌懸液制備 將出發(fā)菌解淀粉芽孢桿菌FN在LB斜面(酵母粉0. 5%，蛋白胨1%，NaCl1%，瓊脂2%)上 劃線接種，37°C培養(yǎng)24h;加入5mL0.85%的無菌生理鹽水，將斜面上的菌體全部沖洗下 來，轉(zhuǎn)入無菌的含有玻璃珠的試管中，渦旋震蕩10min，完全打成單細(xì)胞菌體；將菌懸液全 部轉(zhuǎn)入15mL離心管，6000rpm離心3min收集菌體，取上清，用10mL生理鹽水懸浮菌體； 洗滌細(xì)胞兩次，最后調(diào)整細(xì)胞濃度至IO8個(gè)/mL. 1. 2紫外誘變處理及誘變劑量確定 打開9W紫外燈開關(guān)，預(yù)熱約30min;取直徑9cm無菌平皿，加入上述細(xì)胞濃度為IO8 個(gè)/mL的菌懸液10mL，加入一根無菌磁力攪拌轉(zhuǎn)子，打開磁力攪拌器，打開皿蓋，在垂直距 離為15cm處，分別攪拌照射Imin，2min，3min，4min，5min;蓋上平皿蓋，關(guān)閉紫外燈， 黑暗中孵育30min。
[0016] 將照射后的菌懸液用0. 85%生理鹽水梯度稀釋至10^lO6;取10 4、10 5、10 6三個(gè) 稀釋度的菌懸液各100yL，涂布LB平板，每個(gè)稀