一株3-羥基丙醛高產(chǎn)菌株及其在防治哺乳動(dòng)物陰道感染中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物及其組合物，特別是涉及一種用于防治哺乳動(dòng)物陰道感染 的微生物及其組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 益生菌素3-羥基丙醛（3-HPA)，CAS:2134-29-4,分子式C3H6O2，可溶于乙醇、乙 醚、丙酮，極易溶于水，易聚合，屬于羥醛類化合物，性質(zhì)比較活潑，無(wú)異味。益生菌素3-羥 基丙醛在水溶液中主要呈現(xiàn)3-羥基丙醛單體、水合物和環(huán)化二聚體三種狀態(tài)。3-羥基丙醛 具有醛基和羥基，易發(fā)生羥基和醛基相關(guān)的反應(yīng)，容易縮合。
[0003] 益生菌素3-羥基丙醛可由定殖于人及動(dòng)物腸道內(nèi)的細(xì)菌代謝甘油產(chǎn)生，其在生 物滅菌劑、抗感染治療劑、生物交聯(lián)劑、新型生物材料的前體等方面有著廣泛的潛在用途。
[0004] 羅伊氏素的主要成分是3-羥基丙醛的單體、水合物和環(huán)化二聚體。研究表明， 15-30yg/ml的羅伊氏素就能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、酵母、真菌和病原蟲(chóng)等的 生長(zhǎng)。由于羅伊氏素既具廣譜抗菌特性，又對(duì)人和動(dòng)物無(wú)害，其用途正逐步被廣泛開(kāi)發(fā)，如 作為生物防腐劑，用于延長(zhǎng)香腸、冷凍食品等的貨價(jià)期；作為生物滅菌劑，用于不能高溫滅 菌的食品牛奶、生物材料的滅菌；作為口香糖添加劑，用于殺死口腔病原菌預(yù)防齲齒；作為 抗感染治療劑，替代抗生素用于動(dòng)物病原蟲(chóng)引發(fā)疾病的治療。
[0005] 益生菌素3-羥基丙醛單體是一個(gè)三碳的醇醛類化合物，可以和蛋白質(zhì)中的胺基 反應(yīng)形成交聯(lián)。在酸性條件下，三個(gè)益生菌素3-羥基丙醛單體形成乙縮醛，可與自由胺基 進(jìn)行雙醛基交聯(lián)反應(yīng)；而在堿性條件下，可能發(fā)生類似于甲醛的單醛基交聯(lián)反應(yīng)。因此可以 作為新型交聯(lián)劑，交聯(lián)后生物組織的變性溫度、交聯(lián)指數(shù)、抗酶解能力和機(jī)械性能等與戊二 醛（glutaraldehyde)交聯(lián)的生物組織相當(dāng)，但其細(xì)胞毒性更低。因此可以取代化學(xué)合成的 戊二醛和環(huán)氧化合物作為新型的生物交聯(lián)劑，從而克服化學(xué)交聯(lián)劑處理生物組織所遇到的 組織硬化、鈣化、細(xì)胞毒性過(guò)高及免疫反應(yīng)過(guò)強(qiáng)等問(wèn)題。
[0006] 此外，益生菌素3-羥基丙醛還可作為多種新興化學(xué)品如丙烯醛、丙烯酸、1，3-丙 二醇等的前體，用于制備新型聚合物材料。
[0007] 婦科外陰和陰道感染疾病是女性的常見(jiàn)病和多發(fā)病，其發(fā)病率逐年上升，醋酸氯 己定和甲硝唑復(fù)方制劑是治療這類疾病的常用藥物。這些制劑有復(fù)方洗必泰、雙唑泰栓劑 等，其中醋酸氯己定含量為Smg/粒，甲硝唑的含量為200mg/粒，用于治療各種細(xì)菌、厭氧 菌、霉菌、滴蟲(chóng)等病原體引起的各種陰道炎。但醋酸氯己定/甲硝唑復(fù)方制劑只是在治療早 期的感染疾病時(shí)效果明顯，而在治療較重的感染疾病效果不是很理想，且醋酸氯己定/甲 硝唑復(fù)方制劑在治療陰道炎的同時(shí)，顯示出較大的不良反應(yīng)，表現(xiàn)為對(duì)陰道的局部刺激較 大，產(chǎn)生局部紅腫現(xiàn)象；并且這些藥物的使用還會(huì)抑制陰道內(nèi)正常菌群活性，從而破壞陰道 內(nèi)正常的生態(tài)平衡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種生長(zhǎng)周期短、益生菌素產(chǎn)量高的羅伊氏乳桿 菌，及其在防治哺乳動(dòng)物陰道感染中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明一株3-羥基丙醛（益生菌素）高產(chǎn)菌株，其特征在于：其為羅伊氏乳桿 菌（Lactobacillusreuteri)RS01，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為CGMCC No. 9971，保藏日期為2014年11月14日。
[0010] 進(jìn)一步，本發(fā)明的3-羥基丙醛高產(chǎn)菌株，所述羅伊氏乳桿菌RSOl的細(xì)胞壁染色呈 革蘭氏陽(yáng)性，無(wú)芽孢，菌體呈現(xiàn)短棒狀，分布為單個(gè)或呈連接狀。
[0011] 進(jìn)一步，本發(fā)明的3-羥基丙醛高產(chǎn)菌株，所述羅伊氏乳桿菌RSOl菌體長(zhǎng)I. 5-3um、 寬 0. 6-0. 9um。
[0012] 進(jìn)一步，本發(fā)明的3-羥基丙醛高產(chǎn)菌株，所述羅伊氏乳桿菌RSOl的菌落光滑細(xì) 膩，邊緣整齊，菌落大小均勻一致，乳白色、濕潤(rùn)、不透明。
[0013] 本發(fā)明一種利用羅伊氏乳桿菌RSOl生產(chǎn)3-羥基丙醛的方法，包括以下步驟：
[0014] -、制備培養(yǎng)基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、酵母浸膏5g、吐溫801ml、磷 酸氫二鉀2g、檸檬酸三銨2g、乙酸鈉5g、硫酸鎂0. 5g、硫酸錳0. 2g、L-半胱氨酸0. 5g、硫乙 醇酸鈉〇? 05g、VB120. 005g、甘油3. 68g加水定容至1L，調(diào)節(jié)pH值為6. 8 ;
[0015] 二、將上述羅伊氏乳桿菌RSOl接入步驟一中制備的培養(yǎng)基中，37°C、溶氧量為0的 條件下，厭氧發(fā)酵5h;
[0016] 三、分離：第一次分離采用板框分離，收集菌體快速而且不易造成菌體死亡；然后 將分離的菌體接入新的培養(yǎng)基中，在37°C、溶氧量為0的條件下，培養(yǎng)4h;第二次分離采用 高速管式離心機(jī)，可以使目的產(chǎn)物與菌體有效分離；
[0017] 四、合并兩次分離得到的發(fā)酵液。
[0018] 本發(fā)明中對(duì)上述菌種采用了同一菌種兩次發(fā)酵的方法，得到高濃度的3-HPA。
[0019] 本發(fā)明一種3-羥基丙醛高產(chǎn)菌株在防治哺乳動(dòng)物陰道感染中的應(yīng)用，其特征在 于：用于制備各種治療陰道炎或者預(yù)防泌尿生殖道感染的藥物。
[0020] 本發(fā)明一株益生菌素高產(chǎn)菌株及其在防治哺乳動(dòng)物陰道感染中的應(yīng)用與現(xiàn)有技 術(shù)不同之處在于：
[0021] 1、易于培養(yǎng)：本發(fā)明采用了厭氧發(fā)酵，控制發(fā)酵過(guò)程中的氧氣濃度；即可通過(guò)兩 次發(fā)酵轉(zhuǎn)化3-HPA，到高濃度的3-HPA。
[0022] 2、產(chǎn)量高：本發(fā)明中的羅伊氏乳桿菌RSOl經(jīng)過(guò)誘變篩選后，菌種生長(zhǎng)周期縮短一 半，目標(biāo)產(chǎn)物（3-HPA)產(chǎn)量由原本幾乎為0提升至2. 5-2. 8g/L。
[0023] 3、節(jié)能：本發(fā)明中的羅伊氏乳桿菌RSOl經(jīng)過(guò)誘變篩選后，由于生長(zhǎng)周期的縮短一 半以上，從而大大降低了生產(chǎn)成本，節(jié)約了水、電、汽等能源。
[0024] 4、安全、無(wú)毒副作用：采用本發(fā)明的羅伊氏乳桿菌RSOl的發(fā)酵液對(duì)SD系大鼠進(jìn)行 灌胃和陰道注射，均驗(yàn)證無(wú)毒副作用。
[0025] 5、抗菌譜廣：本發(fā)明的益生菌素高產(chǎn)菌株代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)引起的陰道 炎均有很好的治療效果，證明其具有廣譜的抗菌作用，可用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物的陰道 感染。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為本發(fā)明羅伊氏乳桿菌RSOl的鏡檢圖；
[0027] 圖2為本發(fā)明羅伊氏乳桿菌RSOl的菌落圖；
[0028] 圖3為本發(fā)明羅伊氏乳桿菌RSOl的抑白色念珠菌圖；
[0029] 圖4為本發(fā)明羅伊氏乳桿菌RSOl的抑金黃色葡萄球菌圖；
[0030] 圖5為本發(fā)明羅伊氏乳桿菌RSOl的抑大腸桿菌圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 結(jié)合以下實(shí)施例與驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的一株益生菌素高產(chǎn)菌株及其在防治哺乳 動(dòng)物陰道感染中的應(yīng)用作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0032] 本發(fā)明的羅伊氏乳桿菌RSOl為太空誘變篩選出的正向突變菌株。在高能粒子 輻射、微重力、交變磁場(chǎng)的條件下，羅伊氏乳桿菌發(fā)生多種具有不同程度代謝產(chǎn)生3-羥基 丙醛能力的菌株，通過(guò)對(duì)致病菌群進(jìn)行不同梯度的殺菌試驗(yàn)，篩選獲得60min內(nèi)殺菌率在 90%以上的菌株，即本發(fā)明中的益生菌素（3-羥基丙醛）高產(chǎn)菌株。
[0033] 圖1為本發(fā)明羅伊氏乳桿菌RSOl的鏡檢圖；圖2為本發(fā)明羅伊氏乳桿菌RSOl的 菌落圖。
[0034] 實(shí)施例1
[0035] 本發(fā)明中益生菌素高產(chǎn)菌株的生產(chǎn)3-羥基丙醛的方法，按以下步驟進(jìn)行：
[0036] -、制備培養(yǎng)基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、酵母浸膏5g、吐溫801ml、磷 酸氫二鉀2g、檸檬酸三銨2g、乙酸鈉5g、硫酸鎂0. 5g、硫酸錳0. 2g、L-半胱氨酸0. 5g、硫乙 醇酸鈉〇? 05g、VB120. 005g、甘油3. 68g加水定容至1L，調(diào)節(jié)pH值為6. 8 ;
[0037] 二、將本發(fā)明的羅伊氏乳桿菌RSOl接入步驟一中制備的培養(yǎng)基中，37°C厭氧發(fā)酵 5h；
[0038] 三、分離：第一次分離采用板框分離，收集菌體快速而且不易造成菌體死亡；然后 將分離的菌體接入新的培養(yǎng)基中，在37°C、溶氧量為0的條件下，培養(yǎng)4h;第二次分離采用 高速管式離心機(jī)，可以使目的產(chǎn)物與菌體有效分離；
[0039] 四、合并兩次分離得到的發(fā)酵液。
[0040] 根據(jù)3-羥基丙醛在強(qiáng)酸條件下加熱脫水形成丙烯醛，而色氨酸在濃鹽酸的存在 下，與丙烯醛反應(yīng)生成紫色物質(zhì)，在560nm下有吸收峰。因此，通過(guò)顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)所得 3-羥基丙醛的產(chǎn)量。經(jīng)測(cè)定，突變前的羅伊氏乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)3-羥基丙醛的量幾乎為0,采 用本申請(qǐng)中的羅伊氏乳桿菌RSOl結(jié)合上述發(fā)酵方法，所得3-羥基丙醛的產(chǎn)量為2. 5-2.Sg/ L;而菌種的生長(zhǎng)周期由原來(lái)的12-20h縮短至現(xiàn)在的5h，大大降低了生產(chǎn)成本，節(jié)約了水、 電、汽等能源。
[0041] 抑菌試驗(yàn)
[0042] 將實(shí)施例1中分離得到的發(fā)酵液稀釋到四倍體積，按照以下步驟對(duì)發(fā)酵液的抑/ 殺菌（白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌）能力進(jìn)行測(cè)定：
[0043] -、配制培養(yǎng)基：配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；
[0044] 二、滅菌：將步驟一配制的培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、牛津杯、移液槍槍頭等放入滅菌鍋中滅 菌；
[0045] 三、取適量活化好的致病菌接入冷卻至40°C的培養(yǎng)基中，制得菌懸液；
[0046] 四、將步驟三中的菌懸液倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固；
[0047] 五、在培養(yǎng)皿中放入牛津杯（每個(gè)平皿放3個(gè)），再于牛津杯中加入0.24ml待測(cè)樣 品；
[0048] 六、將步驟五中的培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h;
[0049] 七、觀察抑菌圈大小。
[0050] 抑菌效果根據(jù)抑菌圈大小來(lái)判斷，標(biāo)準(zhǔn)如表1所示，所得結(jié)果見(jiàn)圖3-5。
[0051] 表1抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)
[0052]
[0053] 抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明的發(fā)酵液抑制白色念珠菌所形成的抑菌圈直徑為 26. 3_、抑制金黃色葡萄球菌所形成的抑菌圈直徑為27. 8_、抑制大腸桿菌所形成的抑菌 圈直徑為31. 2mm，結(jié)果均顯著高于高度敏感的標(biāo)準(zhǔn)，采用以上方法驗(yàn)證稀釋80倍體積的發(fā) 酵液的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液稀釋至80倍仍有抑菌效果，說(shuō)明本發(fā)明的益生菌素高產(chǎn)菌株 的發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有很強(qiáng)的殺滅作用。
[0054] 安全性試驗(yàn)
[0055] 為驗(yàn)證本發(fā)明益生菌素高產(chǎn)菌株的安全性，采用本發(fā)明的發(fā)酵液對(duì)SD系大鼠進(jìn) 行灌胃和陰道注射，來(lái)研究本發(fā)明的益生菌素高產(chǎn)菌株代謝生產(chǎn)物對(duì)其血生化指標(biāo)和陰道 組織的影響。
[0056] 取體重