一株高產糖化酶的黑曲霉突變菌株及其工業(yè)發(fā)酵技術的制作方法
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術領域，特別設及一株高產糖化酶的黑曲霉突變菌株及工 業(yè)發(fā)酵技術。
【背景技術】：
[000引糖化酶（GlucoamylaseEC3. 2. 1. 3)是葡萄糖淀粉酶的簡稱（縮寫為GA或G)，是 由微生物分泌產生的，具有外切酶活性的胞外酶，催化淀粉從非還原端水解α-1，4糖巧鍵 逐個釋放出單個β-D-葡萄糖。此外，還能水解α-1，6糖巧鍵和α-1，3糖巧鍵，能將支鏈 淀粉徹底水解為葡萄糖，是水解淀粉的主要酶類，現(xiàn)已被廣泛的應用于白酒、酒精、食醋、氨 基酸、有機酸和抗生素等發(fā)酵工業(yè)。
[0003] 糖化酶在微生物中的分布很廣，在工業(yè)中應用的糖化酶主要是從黑曲霉、米曲霉、 根霉等絲狀真菌和酵母中獲得，從細菌中也分離到穩(wěn)定的糖化酶，人的唾液、動物的膜腺中 也含有糖化酶。不同來源的糖化酶其結構和功能有一定的差異，對生淀粉的水解作為的活 力也不同，真菌產生糖化酶對生淀粉具有較好的水解作用。
[0004] 幾十年來我國科研工作者為提高糖化酶的酶活進行了不懈努力，如中國專 利CN104357335A公布了一株W黑曲霉為原始菌株，通過誘變與篩選獲得的產糖化 酶的菌株-黑曲霉CGMCC8641，該菌株發(fā)酵產酶酶活最高可達4219U/mL;專利號為 化200610102056. 3的發(fā)明專利公開了一株高產糖化酶的黑曲美突變株IN7-31，保藏號 為CGMCC1818,該突變株糖化酶活力是出發(fā)菌株的3. 5倍，其制得的教曲糖化酶活力可達 7000-12000U/g，液態(tài)糖化酶制劑酶活力可達2200-4200U/mU同時該菌株還具有產酶速度 快，無霉腐味等特點。
[0005] 盡管運些研究也已經達到了很高的水平，但是利用誘變、DNA重組技術或其他方法 獲得優(yōu)良菌株，提高糖化酶基因在受體菌中的表達水平，進一步優(yōu)化糖化酶的發(fā)酵和提取 工藝W及保存條件，仍然是糖化酶在各行業(yè)領域進行大規(guī)模應用的重要前提。

【發(fā)明內容】
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[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一株高產糖化酶的黑曲霉突變株及其工業(yè)發(fā)酵方法。
[0007] 本發(fā)明中所述的高產糖化酶的黑曲霉菌株具體為黑曲霉（Aspergillusniger) GA-179,該菌株已于2015年5月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 屯、，保藏編號為CGMCC10788。
[0008] 本發(fā)明所述黑曲霉突變菌株CGMCC10788是通過黑曲霉G131和黑曲霉G285進 行多輪原生質體電融合育種選育獲得。黑曲霉G131在實驗室條件下液體發(fā)酵最高酶活為 61250u/mU黑曲霉G285在同等條件下發(fā)酵最高活力為43820u/mU突變株CGMCC10788液 體發(fā)酵酶活達到80130u/mU經發(fā)酵條件優(yōu)化后，液體發(fā)酵平均產酶活力在87000-90000U/ 血，本菌種所產糖化酶的使用溫度范圍為58°C-60°C，酶的使用抑范圍為4. 0-4. 2。
[0009] 黑曲霉G131是經紫外誘變篩選到的高產糖化酶菌株，其發(fā)酵酶活較原始菌提高 了 39. 8%，黑曲霉G285是原始菌在傳代過程中分離純化得到的，其生長表型為菌絲型，不 產抱子，液體培養(yǎng)其菌絲短細，發(fā)酵液混合均勻，物料、溶氧傳遞效果良好，為了得到一株適 合液體發(fā)酵的高產糖化酶菌株，對兩株菌先進行紫外滅活后再進行多輪電融合選育，直到 選育出一株不產抱子、高產糖化酶的菌株CGMCC10788,本菌種的最適生長溫度為34°C，生 長所需的PH范圍為4. 5-5.0。
[0010] 所述黑曲霉菌株CGMCC10788所產糖化酶活力達到87000-90000u/mL。
[0011] 所述黑曲霉突變菌株CGMCC10788工業(yè)發(fā)酵糖化酶的方法主要包括如下步驟：
[0012] 1)種瓶制備：刮取試管斜面的菌苔接入察氏種瓶中，34°C，200rpm，發(fā)酵5山發(fā)酵 結束后將種子液收集到化的無菌瓶中，得到種子罐的種瓶；
[001引。種子罐培養(yǎng)：將種瓶接種到察氏種子罐中，34。180-300rpm，發(fā)酵4她；
[0014] 3)發(fā)酵罐培養(yǎng)：在無菌條件下，按照8%的接種量，將種子罐發(fā)酵液壓入發(fā)酵罐， 進行發(fā)酵罐培養(yǎng)。34°C，180-300巧m，發(fā)酵至6化后控制溶氧20 % -30 %，7化開始補料，發(fā) 酵至菌體自溶嚴重，酶活無明顯提高時放罐；
[0015] 4)提取與精制：發(fā)酵液加入10化pm聚丙締酷胺和3%珍珠巖進行絮凝和板框壓 濾，然后進行超濾濃縮，最后加入防腐劑和保護劑配兌并用娃藻±過濾除菌，得到糖化酶成 品酶制劑；
[0016] 發(fā)酵培養(yǎng)基質量體積百分百組成如下：玉米粉10% -12%，豆餅粉2. 5% -3%，教 皮 1% -2%，氯化巧 0.03%，硫酸錠 1% -1.5%，玉米漿 2% -3%，pH4. 5 ;
[0017]補料培養(yǎng)基質量體積百分百組成如下：玉米淀粉20 %，玉米漿2 %，硫酸錠0. 5 %， 抑4. 5。
[0018] 有益效果：
[0019] 1、本發(fā)明通過對原始菌株進行誘變提高酶活后，對兩株不同表型的黑曲霉進行原 生質體融合篩選，再經過培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，建立了液體發(fā)酵糖化酶的方法， 發(fā)酵活力在87000-9000011/1111，比原始菌株提高了99.3%左右；本菌種所產糖化酶的使用 溫度范圍為58°C-60°C，酶的使用抑范圍為4. 0-4. 2,與本技術領域的其他菌株所產糖化酶 相比，本酶的比活力提高了120%左右，由于比活力的提高，也可相應的降低酒精、淀粉糖、 釀造等行業(yè)的應用成本。
[0020] 2、本菌種的最適生長溫度為34°C，生長所需的抑范圍為4. 5-5. 0,發(fā)酵中期階段 的PMV-直維持在60%左右；與其他同類菌株相比，對數期由原先的9化左右，縮短至50h 左右，且整個發(fā)酵期間，發(fā)酵液的酶活水平和增長速度明顯高于較其他菌株，在相同的發(fā)酵 時間內，生產更多的酶，大大降低了生產成本。
【附圖說明】：
[0021] 圖1不同菌株的發(fā)酵水平
[0022] 圖2標準曲線
[0023] 圖3發(fā)酵過程生物量變化曲線
[0024] 圖4發(fā)酵過程酶活力變化曲線
【具體實施方式】：
[0025] W下通過具體實施例對本發(fā)明做更詳細的說明，具體實施案例僅為舉例說明，不 作為對本發(fā)明實施范圍的限定。
[0026] 實施例1菌株的誘變選育
[0027] 1)原生質體的制備
[0028] 取兩株出發(fā)菌株的新鮮斜面，用無菌水洗脫菌體，轉移至裝有玻璃珠的Ξ角瓶中， 置于搖床振蕩30min使菌體分散，離屯、收集菌體，用0. 6M山梨醇滲透壓穩(wěn)定劑化1M巧樣 酸緩沖+0. 6M山梨醇+0. 01M邸TA)懸浮，離屯、洗涂后收集用滲透壓穩(wěn)定劑懸浮，置冰中備 用。然后加入溶菌酶1. 2%、蝸牛酶0. 8%、纖維素酶0. 8%，在30°C進行酶解6小時，制得 原生質體備用，其中原生質體制備率和再生率的計算方法如下：在普通培養(yǎng)基培養(yǎng)并計菌 落數為A;將原生質體懸浮液稀釋一定倍數，在普通培養(yǎng)基培養(yǎng)并計菌落數為B;在高滲再 生培養(yǎng)基培養(yǎng)并計菌落數為C。
[0029] 原生質體制備率=(A-B)/A*100%= 89%
[0030] 原生質體再生率=(C-B)/(A-B)*100%= 33%
[0031] 普通培養(yǎng)基：薦糖30g，蛋白腺lOg，牛肉膏5g，淀粉lOg，瓊脂20g，水lOOOmL;
[0032] 再生培養(yǎng)基：薦糖30g，蛋白腺lOg，牛肉膏5g，淀粉lOg，氯化鋼35g，瓊脂20g，水 1000血。
[003引。原生質體電融合
[0034] 將制得的兩株菌的原生質體稀釋到濃度為1〇6個/mU各取5mL分別置于2個平板 上，在超凈工作臺中，于1抓紫外燈30cm處照射15min，將紫外滅活的兩親本菌株的原生質 體懸液用0.6mol/L的山梨醇溶液洗涂2次后分別懸于電擊液中，然后將兩親本菌株的原生 質體混合均勻，進行電融合操作，選用方波脈沖，條件為低壓：120v;脈沖寬度：100ms;脈沖 個數：1〇 ;脈沖間隔時間：8s;高壓：3000v;脈沖寬度：0. 5ms:脈沖個數：3 ;脈沖間隔時間： 6s，電融合結束后，將融合液經稀釋后接種在再生培養(yǎng)基上，34°C培養(yǎng)5天，計算肥值。重 復多次實驗后從中選出5株不產抱子且HC(HC=水解圈直徑/菌落直徑）值高的新菌株， 分別是GA-13、GA-45、GA-108、GA-179、GA-205。
[00對如搖瓶發(fā)酵篩選
[0036] 將選出的5株菌進行搖瓶發(fā)酵，淀粉5 %，大豆蛋白4 %，教皮0. 5 %，硝酸鋼 0. 3%，憐酸二氨鐘0. 4%，玉米漿1. 2%。培養(yǎng)溫度34°C，培養(yǎng)時間5山培養(yǎng)結束后測發(fā)酵 液中糖化酶活力，5株菌搖瓶實驗結果如下：
[0037]
[0038] 4)生產菌株的表型^
[0039] 根據搖瓶實驗結果，選GA-179為生產菌株，進行發(fā)酵工藝優(yōu)化。GA-179表型特征 為：平板菌落致密呈灰白色，無抱子，鏡檢為中間有隔膜的菌絲片段。
[0040] 實施例2GA-179液體發(fā)酵生產糖化酶及其提取
[0041] 1)種瓶制備：刮取試管斜面的菌苔接入察氏種瓶中，34°C，200rpm，發(fā)酵5d，發(fā)酵 結束后將種子液收集到化的無菌瓶中，得到種子罐的種瓶；
[004引。種子罐培養(yǎng)：將種瓶接種到種子罐中，34°C，250巧m，發(fā)酵4她，種子培養(yǎng)基為察 氏培養(yǎng)基；
[0043] 3)發(fā)酵產糖化酶
[0044] 發(fā)酵罐培