本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于制備雙降醇的微生物菌株及其選育方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

甾體藥物是品種多和應(yīng)用廣泛的一大類藥物，臨床上需求量僅次于抗生素，主要用于治療風(fēng)濕病、心血管、膠原性病癥、淋巴白血病、腫瘤、細菌性腦炎、皮膚病、內(nèi)分泌失調(diào)、老年性疾病等疾病。我國在甾體藥物研究開發(fā)與世界先進國家相比還有一定的差距，主要表現(xiàn)為甾體藥物合成步驟多，反應(yīng)復(fù)雜，基團的遠程效應(yīng)十分明顯，收率低，特別是分離純化困難。圖1為植物甾醇轉(zhuǎn)化雙降醇的途徑及關(guān)鍵酶系。

雙降醇(21-hydroxy-20-methylpregn-4-en-3-one)分子式為c22h34o2，分子量為330.5，是甾體激素類藥物的一種重要中間體，可以用作甾體藥物黃體酮和氫化可的松的合成，具有重要的商業(yè)價值。微生物降解植物甾醇的的工作開始于20世紀60年代，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多微生物可以降解植物甾醇，包括arthrobacter，brevibacterium，pseudomonas，nocardia，bacii/us，streptomyces，microbacterium，achromobacter，protaminobacter，comamonas，mycobacterium；fijrhodococcus等菌種，微生物通過體內(nèi)酶系高效降解植物甾醇側(cè)鏈以及氧化母核環(huán)。研究表明，9-羥化酶ksha與kshb共同催化形成9-羥基雄烯二酮，從而進一步催化最終降解為二氧化碳和水。研究表明，c22脫氫酶是植物甾醇生成4-雄烯二酮與雙降醇的關(guān)鍵酶系，脫氫活力較高時主要向4-雄烯二酮轉(zhuǎn)化，而相對較弱時主要向雙降醇途徑轉(zhuǎn)化。此外也有研究表明，3-甾酮-δ¹-脫氫酶(3-ketosteroiddelta1-dehydrogenase)可以促使4-雄烯二酮與雙降醇分別轉(zhuǎn)化為1，4-雄烯二酮與1，4-雙降醇。湖北共同生物科技有限公司通過誘變方法(專利號cn103382445a)成功獲得9-羥化酶缺陷菌株，保藏在武漢大學(xué)中國典型微生物保藏中心，編號為cctccno:m2012522。本發(fā)明在前期的誘變株基礎(chǔ)之上進一步采用紫外線-licl以及亞硝基胍復(fù)合誘變方法得到c1，2脫氫酶以及c22脫氫酶雙重缺陷菌株，從而富集轉(zhuǎn)化生產(chǎn)雙降醇。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目在于提供一種用于制備雙降醇的微生物菌株及其選育方法和應(yīng)用，得到遺傳性狀穩(wěn)定的雙降醇生產(chǎn)菌株，同時優(yōu)化提取工藝，獲得高純度的雙降醇精制產(chǎn)品。

為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種微生物菌株，為分枝桿菌屬分支桿菌種，拉丁文為mycobacteriumsp.hbcba-1，保藏單位為中國典型菌種保藏中心，保藏地址中國武漢大學(xué)，保藏日期為2017年6月19日，保藏號為cctccno：m2017349，主要特征為細胞為桿狀，革蘭氏染色為陽性g+，過氧化氫酶陽性，v.p.反應(yīng)、甲基紅試驗以及吲哚試驗均為陰性。

一種上述菌株的選育方法，包括以下步驟：

1、菌株及活化：屬于放線菌中的分枝桿菌屬分枝桿菌種，拉丁名為mycobacteriumsp，名稱為mycobacteriumsp.gtf-69，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址在中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期2012年12月11日，保藏號cctccn0:m2012522。將保藏于冷凍甘油管中的分支桿菌采用固體活化培養(yǎng)基接種于斜面或者平板劃線活化，28～30℃，2～4天。固體活化培養(yǎng)基配方為(質(zhì)量百分比)：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，瓊脂2％，ph6.8～7.0。

2、紫外-licl復(fù)合誘變：將上述活化好的分支桿菌挑取單菌落轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，28～30℃，180～220rpm，2～4d。液體培養(yǎng)基配方為(質(zhì)量百分比)：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，ph6.8～7.0。制成第一菌懸液，濃度為10⁷～10⁸個/ml，對第一菌懸液采用紫外誘變，誘變條件為：紫外燈功率15w，距離為30cm，照射時間為2～8min，將誘變后的第一菌懸液避光進行梯度稀釋，然后涂布在lic1質(zhì)量濃度分別為0.02％～0.1％的固體活化培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基上，28～30℃，3～5d。分離單菌落采用活化培養(yǎng)基活化，28～30℃，180～220rpm，2～3d，取活化后的菌液按2％的接種量接種于種子培養(yǎng)基中，28～32℃，200～250rpm，24～36h。種子培養(yǎng)基配方為(質(zhì)量百分比)：葡萄糖2％，硝酸鈉0.5％，磷酸二氫鉀0.05％，硫酸鎂0.05％，玉米漿5％，ph7.0～7.2。然后按10～15％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28～32℃，200～250rpm，4～8d，通過tlc定性分析篩選獲得突變株。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(質(zhì)量百分比)：植物甾醇3％，硝酸鈉0.5％，磷酸二氫鉀0.05％，硫酸鎂0.05％，玉米漿5％，豆餅油14～18％，ph7.0～7.2。

3、亞硝基胍誘變：將紫外-licl復(fù)合誘變篩選的突變株采用液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，28～30℃，180～220rpm，2～4d，制成第二菌懸液，濃度為10⁷～10⁸個/ml。對第二菌懸液采用亞硝基胍誘變處理，亞硝基胍濃度為40～100μg/ml，誘變時間為20～60min，誘變后將第二菌懸液稀釋1000倍，終止誘變，涂布固體活化培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)，28～30℃，3～5d。分離單菌落采用活化培養(yǎng)基活化，28～30℃，180～220rpm，2～3d，取活化后的菌液按2％的接種量接種于種子培養(yǎng)基中，28～32℃，200～250rpm，24～36h。通過tlc定性分析篩選獲得本發(fā)明所述的微生物菌株。

一種上述微生物菌株的應(yīng)用，將其用于雙降醇的提取與精制：將上述菌株按10～15％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28～32℃，200～250rpm，4～8d，將3l發(fā)酵液注入到一個5～8l玻璃瓶，攪拌，水浴加熱至70～80℃，用稀硫酸中和至ph3～3.5，加3～6％珍珠巖助濾劑，攪拌1～2h，加20～30ml聚合氯化鋁和0.5～2g聚丙烯酰胺，持續(xù)攪拌2～3h，停止加熱，排出熱水，用冷水浴降至45～50℃，過濾油相盡可能抽干，得到黃色粉狀濾餅。將黃色粉狀濾餅加至5～10l玻璃瓶，攪拌，加入備好的3～5l甲醇溶液(體積比80％)，室溫攪拌2～3h，過濾抽干，重復(fù)提取2～4次，合并濾液，常壓蒸餾掉甲醇，降至室溫，過濾得到濾餅，抽干，烘干，得到粗品。將400～600ml甲醇水溶液(體積比80％)注入1～2l三角瓶，加入以上粗品并攪拌，用水浴加熱至50～60℃，直至完全溶解，再加入2～3.5g活性炭，保持2～3h，壓濾，將濾液常壓蒸餾至原體積的一半，常溫放置分出結(jié)晶，過濾，抽干，烘干得到成品。

附圖說明

圖1植物甾醇轉(zhuǎn)化雙降醇的途徑及關(guān)鍵酶系；

圖2雙降醇成品hplc分析圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1復(fù)合誘變獲得雙降醇生產(chǎn)菌株

1、出發(fā)菌株：屬于放線菌中的分枝桿菌屬分枝桿菌種，拉丁名為mycobacteriumsp，名稱為mycobacteriumsp.gtf-69，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址在中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期2012年12月11日，保藏號cctccn0:m2012522。

2、菌株活化：將保藏于冷凍甘油管中的分支桿菌采用固體活化培養(yǎng)基接種于斜面或者平板劃線活化，30℃，4d。固體活化培養(yǎng)基配方為(質(zhì)量百分比)：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，瓊脂2％，ph7.0。

3、紫外-licl復(fù)合誘變：將上述活化好的分支桿菌挑取單菌落轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm，3d。液體培養(yǎng)基配方為(質(zhì)量百分比)：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，ph7.0。制成第一菌懸液，濃度為10⁷個/ml，對第一菌懸液采用紫外誘變。誘變條件為：紫外燈功率15w，距離為30cm，照射時間為6min，將誘變后的第一菌懸液避光進行梯度稀釋，然后涂布在lic1質(zhì)量濃度為0.06％的固體活化培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基上，30℃，5d。分離單菌落采用活化培養(yǎng)基活化，30℃，200rpm，2d，取活化后的菌液按2％的接種量接種于種子培養(yǎng)基中，32℃，220rpm，24h。種子培養(yǎng)基配方為(質(zhì)量百分比)：葡萄糖2％，硝酸鈉0.5％，磷酸二氫鉀0.05％，硫酸鎂0.05％，玉米漿5％，ph7.0。然后按12％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，32℃，220rpm，5d，通過tlc定性分析篩選獲得突變株。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(質(zhì)量百分比)：植物甾醇3％，硝酸鈉0.5％，磷酸二氫鉀0.05％，硫酸鎂0.05％，玉米漿5％，豆餅油16％，ph7.0。

3、亞硝基胍誘變：將紫外-licl復(fù)合誘變篩選的突變株采用液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，30℃，200rpm，2d，制成第二菌懸液，濃度為10⁸個/ml。對第二菌懸液采用亞硝基胍誘變處理，亞硝基胍濃度為60μg/ml，誘變時間為40min，誘變后將第二菌懸液稀釋1000倍，終止誘變，涂布固體活化培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)，30℃，5d。分離單菌落采用活化培養(yǎng)基活化，30℃，200rpm，3d，取活化后的菌液按2％的接種量接種于種子培養(yǎng)基中，32℃，220rpm，24h。通過tlc定性分析篩選獲得本發(fā)明的微生物菌株。

本發(fā)明篩選得到的微生物菌株遺傳性狀穩(wěn)定，經(jīng)過傳代20代后生理生化特性都一致。

實施例2雙降醇分離純化與精制

1、粗提：將所述菌株按12％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，32℃，220rpm，5d，將3l發(fā)酵液注入到一個5l玻璃瓶，攪拌，水浴加熱至80℃，用稀硫酸中和至ph3.5，加3％珍珠巖助濾劑，攪拌1h，加20ml聚合氯化鋁和1g聚丙烯酰胺，持續(xù)攪拌2h，停止加熱，排出熱水，用冷水浴降至50℃，過濾油相盡可能抽干，得到黃色粉狀濾餅。

2、采用甲醇溶液提取粗品：將黃色粉狀濾餅加至10l玻璃瓶，攪拌，加入備好的3l甲醇溶液(體積比80％)，室溫攪拌2.5h，過濾抽干，重復(fù)提取3次，合并3次濾液，常壓蒸餾掉甲醇，降至室溫，過濾得到濾餅，抽干，烘干，得到粗品。

3、精制：將400ml甲醇水溶液(體積比80％)注入1l三角瓶，加入以上粗品并攪拌，用水浴加熱至60℃，直至完全溶解，再加入3.5g活性炭，保持2h，壓濾，將濾液常壓蒸餾至原體積的一半，常溫放置分出結(jié)晶，過濾，抽干，烘干得到成品，通過hplc分析得純度為98.29％。