一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖的菌株及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)N-乙酰-D-氨基葡萄糖 和D-氨基葡萄糖的菌株及其方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] N-乙酰-D-氨基葡萄糖是單糖，是真菌(擔(dān)子菌、霉菌或酵母）菌體細(xì)胞壁幾丁 質(zhì)，或甲殼類動(dòng)物如蟹、蝦類殼的組成成份，也可作為食品內(nèi)含量極少的營養(yǎng)成份。N-乙 酰-D-氨基葡萄糖具有與氨基葡萄糖相似的效果，攝取一定量的N-乙酰-D-氨基葡萄糖可 以誘導(dǎo)新軟骨的產(chǎn)生，并抑制骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)作，而在一些病例中，N-乙酰-D-氨基葡萄糖也 可用來治療骨關(guān)節(jié)炎。由于氨基葡萄糖有苦味，而N-乙酰-D-氨基葡萄糖有蔗糖50%的甜 味并且很容易攝取，因此，N-乙酰-D-氨基葡萄糖作為氨基葡萄糖的替代物質(zhì)已經(jīng)收到了 廣泛的關(guān)注。
[0004] 傳統(tǒng)的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的生產(chǎn)是以甲殼類動(dòng)物殼作為原料。其生產(chǎn)方法 包括：壓碎甲殼類動(dòng)物的殼；采用稀釋酸溶液對(duì)壓碎的殼脫鈣；利用堿去除蛋白質(zhì)得到純 化的甲殼素；利用酸水解得到的甲殼素以生產(chǎn)氨基葡萄糖；然后對(duì)氨基葡萄糖進(jìn)行無水醋 酸乙?；?，從而得到N-乙酰-D-氨基葡萄糖。利用酸水解甲殼素生產(chǎn)氨基葡萄糖的方法， 還包括以真菌渣(如檸檬酸發(fā)酵使用的黑曲霉菌的菌渣）為原料，在高濃度鹽酸作用下水解 生產(chǎn)氨基葡萄糖，參見2006年5月23日公告的美國專利US7049433B2,其公開了氨基葡萄 糖及從微生物量中制備氨基葡萄糖的方法。
[0005] 此外，傳統(tǒng)方法還包括：（1)利用微生物產(chǎn)生的酶降解來自蝦殼原料產(chǎn)生的甲殼 素以生產(chǎn)N-乙酰-D-氨基葡萄糖，參見1999年12月7日公告的美國專利US5998173,其 公開了N-乙酰-D-氨基葡萄糖的制備過程；（2)利用微生物(木霉菌)產(chǎn)生的酶進(jìn)行酶解或 用酸部分水解純化來自真菌渣(檸檬酸發(fā)酵使用的黑曲霉菌的菌渣）的甲殼素以生產(chǎn)N-乙 酰-D-氨基葡萄糖，參見2003年4月17日公告的美國專利US20030073666A1，其公開了 N-乙酰-D-氨基葡萄糖及其制備方法；（3)通過培養(yǎng)綠藻病毒（C^oroKiri/61)感染的小球 藻細(xì)胞或者導(dǎo)入了源自綠藻病毒基因的重組大腸桿菌來生產(chǎn)N-乙酰-D-氨基葡萄糖，參 見2004年10月14日公告的日本專利JP2004283144A，其公開了制備氨基葡萄糖和N-乙 酰-D-氨基葡萄糖的方法；（4)采用遺傳修飾的微生物，特別是遺傳修飾的大腸桿菌，發(fā)酵 生產(chǎn)N-乙酰-D-氨基葡萄糖，參見2004年1月8日公告的W02004/003175,其公開了氨基 葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖的生產(chǎn)工藝及材料；（5)用木霉菌直接使用葡萄糖為碳源，不 需要來自真菌渣或蝦殼產(chǎn)生的甲殼素和殼多糖寡糖的碳源，發(fā)酵生產(chǎn)N-乙酰-D-氨基葡萄 糖，參見2011年3月10日公告的美國專利US20110059489A1，其公開了利用微生物發(fā)酵生 產(chǎn)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法。
[0006] 上述采用甲殼類動(dòng)物殼或曲霉菌渣(檸檬酸渣）為原料通過化學(xué)水解生產(chǎn)N-乙 酰-D-氨基葡萄糖或D-氨基葡萄糖的方法，通常需要使用高濃度的酸溶液和堿溶液，因此 會(huì)產(chǎn)生大量廢液。而利用蝦蟹殼為原料提取D-氨基葡萄糖，每生產(chǎn)1噸D-氨基葡萄糖就 可能產(chǎn)生100噸以上廢水和大量廢渣。而通過檸檬酸渣提取，每30-50噸檸檬酸渣僅能產(chǎn)1 噸D-氨基葡萄糖。并且，使用微生物或微生物產(chǎn)生的酶來降解源自甲殼類動(dòng)物如蟹、蝦類 殼的甲殼素以生產(chǎn)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法存在產(chǎn)量低和成本高的問題。
[0007] 而通過培養(yǎng)綠藻病毒感染的小球藻細(xì)胞生產(chǎn)N-乙酰-D-氨基葡萄糖，需要通過壓 碎細(xì)胞獲取N-乙酰-D-氨基葡萄糖，存在操作復(fù)雜的問題。利用遺傳修飾的微生物生產(chǎn) N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法則需要采取適當(dāng)措施來避免微生物在設(shè)備內(nèi)的擴(kuò)散，同樣存 在操作復(fù)雜的問題，甚至關(guān)乎食品安全及威脅社會(huì)的問題。
[0008] 此外，用木霉菌直接使用葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法， 雖然具有不需要使用來自甲殼類動(dòng)物殼或真菌渣產(chǎn)生的甲殼素或殼多糖寡糖等碳源的優(yōu) 點(diǎn)，但是由于木霉菌等真菌發(fā)酵溫度低、時(shí)間長、產(chǎn)量偏低，從而導(dǎo)致其存在生產(chǎn)周期長、成 本高、易污染等缺點(diǎn)，并嚴(yán)重限制了該方法的工業(yè)化應(yīng)用。
[0009] 因此，針對(duì)傳統(tǒng)的N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖生產(chǎn)方法存在的上述 缺點(diǎn)，亟需尋找一種新的，同時(shí)具有工業(yè)化應(yīng)用前景的N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡 萄糖的生產(chǎn)方法。
[0010]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄 糖的方法，以克服目前現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足。
[0012] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)： 根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種微生物發(fā)酵N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄 糖的非遺傳重組菌株，其特征在于，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心，一種枯草芽孢桿菌BacillussubtilisNJ090259菌株，保藏號(hào)為CGMCC10257,保藏日 期為2014年12月29日，以及一種地衣芽抱桿菌BacilluslincheniformisNJ091195菌 株，保藏號(hào)為CGMCC10258,保藏日期為2014年12月29日，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，利用上述菌株發(fā)酵生產(chǎn)非動(dòng)物源性N-乙酰-D-氨基葡 萄糖和D-氨基葡萄糖的方法，以該菌為出發(fā)菌種，經(jīng)種子培養(yǎng)和已優(yōu)化的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生 N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖，包括以下步驟： (1)菌株篩選、鑒定與培養(yǎng) 采集50份土壤樣品，稀釋后涂布于初篩平板，采用初篩培養(yǎng)基：膠體幾丁質(zhì)2. 5 g/L，磷酸氫二鉀0.7 g/L，磷酸二氫鉀0.3 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，瓊脂20 g/ L，pH7. 0,培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間72h，進(jìn)行培養(yǎng)，得到單菌落，分離菌落，得到枯草芽孢 桿菌和地衣芽孢桿菌，并對(duì)其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液幾丁質(zhì)酶活力，并根據(jù)發(fā)酵液 含幾丁質(zhì)酶活力篩選菌株； (2 )發(fā)酵培養(yǎng) 將在平板培養(yǎng)基上活化后的枯草芽孢桿菌（你ciWMNJ090259、地衣芽孢 桿菌NJ091195分別接入種子培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)，用作 種子液，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)，離心取上清液，測(cè)定N-乙酰-D-氨基葡萄糖含 量； 平板培養(yǎng)基：膠體幾丁質(zhì)30g/L，硫酸銨2g/L，磷酸二氫鉀1.0g/L，硫酸鎂0.5g/L， 氯化鈉 〇? 5g/L，瓊脂 20g/L，pH6. 5 ; 種子培養(yǎng)基：蛋白胨5. 0g/L，牛肉膏5. 0g/L，氯化鈉5. 0g/L，pH7. 0-7. 2 ; 發(fā)酵培養(yǎng)基：膠體幾丁質(zhì)10g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏3. 0g/L，MgS04*7H20 0. 6g/L，F(xiàn)eS04 ? 7H20 0? 01g/L，KH2P04 0? 4g/L，K2HP04 0? 6g/L，ZnS04 0? 001g/L; 發(fā)酵條件：溫度35°C，發(fā)酵時(shí)間18h，起始pH6. 5,接種量10%，裝液量50ml/250ml; (3) N-乙酰-D-氨基葡萄糖發(fā)酵液純化 將由培養(yǎng)基離心獲得的上清液，電滲析除鹽，將除鹽后發(fā)酵液真空加熱，濃縮至過 飽和，對(duì)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行降溫，并加入5倍無水乙醇，攪拌離心，得到高純度N-乙 酰-D-氨基葡萄糖結(jié)晶； (4) N-乙酰-D-氨基葡萄糖酸化水解 將N-乙酰-D-氨基葡萄糖結(jié)晶粗品配制成飽和溶液，加入37%濃鹽酸至終濃度為 12-16%，90°C保溫45-90min，冷卻過夜，過濾得到的晶體用乙醇洗滌、真空干燥并檢測(cè)，得到 高純度D-氨基葡萄糖鹽酸鹽，收率為86%。
[0014] 進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)基的碳源和氮源如下：所述碳源包括葡萄糖、黑曲霉菌渣、木 霉菌渣、黑木耳生產(chǎn)下腳料、香菇生產(chǎn)下腳料、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖漿和 糖蜜中的一種或幾種，所述氮源包括氨水、豆粉、麥芽、玉米漿、棉籽粉、酵母浸膏、氯化銨、 硫酸銨、硝酸銨、醋酸銨、硝酸鈉和尿素中的一種或幾種。
[0015] 進(jìn)一步的，所述真菌為擔(dān)子菌、霉菌和酵母菌種的一種或幾種。
[0016] 本發(fā)明從不同環(huán)境條件下的土壤中篩選出枯草芽孢桿菌（你ciWM NJ090259 和地衣芽孢桿菌（你NJ091195,所述NJ090259 菌株和 NJ091195的細(xì)菌學(xué)特性如下： 1、NJ090259菌株的細(xì)菌學(xué)特性 (1) 培養(yǎng)學(xué)/形態(tài)學(xué)特性 NJ090259菌株生長時(shí)是膿狀淺黃色半透明菌落，菌落表面光滑；菌落圓形，直 徑4-7mm;低凸起，規(guī)則，放射狀，邊緣葉狀；表面皺褶，無光澤，灰白色，帶有鱗片，不透 明；生長到一定程度后就變成奶白色菌落，傘形，菌落表面有褶皺，菌落較大，中央突起； 單菌桿狀，兩端鈍圓，單個(gè)排列，偶爾2-3個(gè)細(xì)菌排成短鏈，經(jīng)涂片干燥的染色的細(xì)菌 0.7-0. 8X2-3ym，革蘭氏陽性，液體發(fā)酵24h后有芽孢出現(xiàn)，芽孢中生或端生，橢圓形，不 明顯膨脹；在液體基質(zhì)中呈均勻混濁，不形成菌膜和菌環(huán)； (2) 生理生化特性 NJ090259菌株專性好氧，不具凝乳作用，過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn) 陽性；苯丙氨酸脫氨酶實(shí)驗(yàn)、卵黃卵磷脂酶實(shí)驗(yàn)陰性；分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，能分解阿拉 伯糖、甘露醇、酪素、明膠、淀粉。
[0017] 2、NJ091195菌株的細(xì)菌學(xué)特性 (1)培養(yǎng)學(xué)/形態(tài)學(xué)特性 NJ091195菌株當(dāng)培養(yǎng)于肉湯瓊脂平板上時(shí)，菌落近似圓形，乳白色，表面暗，不透明，邊 緣不整齊，粗糙；菌落與培養(yǎng)基緊貼，不易挑取；液體培養(yǎng)有菌膜，無渾濁，無沉淀；單菌呈 短棒狀，兩端鈍圓，單個(gè)或2個(gè)并排排列，菌體長度1. 5-3. 0ym，菌體寬度0? 6-1. 0ym，革蘭 陽性，芽孢呈橢圓形，中間膨大，芽孢在中間或偏一端； (2)生理學(xué)特性 NJ091195菌株接觸酶試驗(yàn)呈陽性，可在含7%NaCl的培養(yǎng)基上生長，可在50°C條件下生 長，具有運(yùn)動(dòng)性，可利用檸檬酸鹽，可水解淀粉，甲基紅試驗(yàn)呈陰性，革蘭氏染色陽性，卵磷 脂酶試驗(yàn)陰性，V.P試驗(yàn)陽性，可利用硝酸鹽，pH5. 7的營養(yǎng)肉湯下可生長，可發(fā)酵幾丁質(zhì)、 D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖和D-甘露醇產(chǎn)酸，可使明膠液化。
[0018] 本發(fā)明的有益效果為：提供了一種生產(chǎn)N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨