抗牛支原體及巴氏桿菌融合蛋白Md-UF1-Md-AP2的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬生物技術領域，具有設及同時抗牛支原體和牛源英膜血清A型多殺性己 氏桿菌蛋白基因ifoLUFl-ifo^AP2、抗牛支原體、牛英膜血清A型多殺性己氏桿菌蛋白1(1-UFl-Md-AP2〇
【背景技術】
[000引牛源英膜血清A型多殺性己氏桿菌（化S 邸/toci缸化）和牛支原體（ 仿wis，必仿wis)是引起我過牛呼吸系統(tǒng)疾病的主要病原。主要發(fā)生在外地引 進的育肥架子牛中，老百姓稱之為"爛肺病"，其發(fā)病率高達80%，單場死亡率高達60%。該病 的發(fā)生已嚴重制約了東北的肉牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，相關政府部口與養(yǎng)殖戶均迫切希望盡快研制 出有效措施W控制發(fā)病，從而增強我國畜牧業(yè)的國際競爭力。
[0003] 目前，國內外還沒有有效的疫苗用于牛呼吸系統(tǒng)疾病的預防，獸醫(yī)臨床主要使用 藥物對該病發(fā)生進行治療，但隨著抗生素廣泛不合理的使用，使牛呼吸系統(tǒng)疾病主要病原 逐漸產生了耐藥性，不但給該病的防治工作帶來了困難，而且加劇了耐藥性問題造成的經 濟損失。
[0004] 牛支原體，必/wis)是感染牛的致病性病原體，于1961年首 次從患有乳房炎的病牛中分離出來，1976年被報道與牛呼吸系統(tǒng)疾病有關。近年來，該病原 引起的疾病已在我國普遍發(fā)生，給我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失。
[0005] 目前，僅有美國具有商業(yè)化的疫苗用于預防牛支原體的感染，而其它國家均采用 抗菌藥物對其進行治療，由于抗生素的廣泛使用，甚至濫用，使必出現耐藥株，且耐 藥率較高，其產生耐藥性的直接后果不僅給控制和治療該病帶來困難，也加劇了抗生素在 牛體內的殘留，為此，研制新型抗必仿W&?藥物已迫在眉睫。
[0006] 上述兩種疾病癥狀有相似之處，臨床診斷需要細菌培養(yǎng)等措施，確診需要一段時 間，而且常常是并發(fā)感染。
[0007] 本研究將肺炎支原體、沙口氏菌誘導家蛹幼蟲后構建的抑制性消減文庫中篩選到 了分別能表達抗牛支原體蛋白的基因ifoLUF1與表達抗牛源英膜血清A型多殺性己氏桿菌 蛋白的基因ifoLAP2構建成融合基因，為抗牛支原體新型藥物的研發(fā)奠定了試驗基礎。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種同時抗牛支原體和牛源英膜血清A型多殺性己氏桿菌 疾病的藥物，抗牛支原體及己氏桿菌融合蛋白Md-UFl-Md-AP2。
[0009] 一種融合蛋白基因ifoLUFi-ifoLAP2,其堿基序列如序列表SEQIDNO. 3所示； 一種融合蛋白Md-UFl-Md-AP2,其氨基酸序列如序列表SEQIDNO. 4所示； 一種融合蛋白基因ifoLUFl-ifo^AP2的制備方法，它包括； 1)人工合成下列引物： P1 ;5'-GGAATTCATGGGGAAAACAGTCT-3' ； P2 ;5'-CGATCCGCCACCGCCAGAGCCTCCACCTCCTGAACCGCCTCCACCCTGAATATAAAACAAG-3'； P3 ; 5'-GGTGGAGGCGGTTCAGGAGGTGGAGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGATGAAATTTTTCACGAACCACC ACCACCA-3'； P4；5' -CGCAGCTCGAGTTACTGAATATAAA-3'； 2)提取家蛹幼蟲的總RNA，分離提純mRNA，反轉錄合成cDNA ; 3) W cDNA為模板，用PI和P2擴增化神FI基因，用P3和P4擴增化MP2基因； 4) W ifoLUFl基因和MMP2基因為模板，用P3和P4擴增； 一種表達載體，它是在表達載體中插入了如序列表SEQ ID NO. 3所示的基因； 一種工程菌，它是在大腸桿菌中轉染了上述的一種表達載體。
[0010] 一種融合蛋白Md-UFl-Md-AP2在制備抗牛支原體和牛源英膜血清A型多殺性己氏 桿菌藥物中的應用。
[0011] 本發(fā)明提供了抗牛支原體及己氏桿菌融合蛋白Md-UFl-Md- AP2及其編碼該融 合蛋基因，它是用肺炎支原體誘導家蛹幼蟲，構建了抑制性消減文庫，在抑制性消減文庫 中篩選出來了的ifo^UFl基因，用雞源沙口氏菌誘導家蛹幼蟲，構建了抑制性消減文庫，在 抑制性消減文庫中篩選出來了的ifoLAP2基因，采用重疊延伸剪切技術，構建了融合基因 ifoWFl-化/- AP2,表達的抗牛支原體及己氏桿菌融合蛋白Md-UFl-Md- AP2,對牛源英膜血 清A型多殺性己氏桿菌和牛支原體均具有抑制作用，解決了牛己氏桿菌和牛支原體耐藥性 的問題。在牛出現肺炎癥狀時，早期用藥，可同時防治牛支原體和己氏桿菌病。
【附圖說明】
[001引圖1脈UF1基因PCR擴增結果；其中，M: DL2000; 1:脈UF1基因PCR產物； 圖2化MP2基因PCR擴增結果；其中，M: DL2000; 1: ifoLAP2基因PCR產物； 圖3 ifoLAP2-ifoLUFl基因PCR擴增結果；其中，M: DL2000; 1: ifoLAP2-ifoWFl基因PCR產物； 圖4純化的抗牛支原體、牛源英膜血清A型多殺性己氏桿菌融合蛋白ifoL AP2, SDS-PAGE分析結果。
【具體實施方式】
[0013] 實施例1沙口氏菌誘導家蛹幼蟲后抑制性消減文庫的構建及抗牛源英膜血清A 型多殺性己氏桿菌蛋白基因篩選 一、誘導菌株的來源 誘導菌雞源沙口氏菌分離自臨床患沙口氏菌病的家禽，采用S.S培養(yǎng)基和分子生物學 方法對所分離菌進行鑒定，結果證明，其是沙口氏菌。
[0014] 二、雞沙口氏菌誘導家蛹幼蟲后抑制性消減文庫的構建 選用2、3日齡家蛹（化wcaZ.)幼蟲（品種為綠頭蛹，蛹卵購買自吉林省迂 源生態(tài)養(yǎng)殖廠，由吉林農業(yè)大學藥理與毒理實驗室解育)。采用2號昆蟲針薩取雞沙口氏菌 菌液(濃度為l〇8c化/mL)刺入家蛹幼蟲（3日齡)腹部，每蟲1針。W薩取菌液針刺的為誘導 組，空針刺作為對照組。將同等數量的誘導組和對照組家蛹幼蟲置于人工氣候箱中，在相同 條件下（溫度為25~35°C，濕度65~75%)培養(yǎng)2化。分別提取實驗組及對照組家蛹幼蟲的總 RNA，利用磁珠法分離mRNA，反轉錄獲得cDNA，采用S甜技術，構建雞沙口氏菌誘導家蛹幼蟲 后的抑制性消減文庫，結合反向Ncxrthern雜交技術篩選出差異基因，并進一步通過RACE技 術獲取差異基因的全長。實驗結果表明，本研究成功構建了雞沙口氏菌誘導家蛹幼蟲后的 抑制性消減文庫，從正向消減文庫中得到500個單克隆，通過PCR篩選得到460個單克隆， 隨機挑取的陽性克隆的大小均在100~200bp之間。
[0015]S、抗牛源英膜血清A型多殺性己氏桿菌蛋白基因的篩選 通過斑點雜交技術共篩選出169個差異基因片段，對差異基因克隆、測序及同源性分 析后共鑒定出32個無同源序列片段，69個抗菌膚基因片段W及其它編碼蛋白的基因片段。 進一步通過cDNA末端快速擴增（rapidamplificationofcDNAends,RACE)對一個家蛹 抗菌膚2基因（MuscadomesticaAntimicrobialpeptide簡稱化/~AP2)進行擴增，產物測 序分析。通過T-A克隆技術，將全長PCR產物克隆至pMDlS-TVector中，成功構建出陽性 克隆質粒PMD18T-ifoLAP2。結果顯示，擴增出化MP2基因全長0RF序列198bp。其堿基序 列SEQIDNO. 2 所示。
[0016] 實施例2肺炎支原體誘導家蛹幼蟲后抑制性消減文庫的構建及抗牛支原體蛋白 基因篩選 一、 誘導菌株肺炎支原體分離鑒定 采集自患肺炎的豬的肺臟病灶，按支原體分離培養(yǎng)程序分離培養(yǎng)，經菌落形態(tài)學觀察， 分子生物學方法對分離菌進行鑒定，結果顯示，分離菌菌落在40倍普通光學顯微鏡下觀察 其菌落形態(tài)具有"油煎蛋"樣典型特征，初步證明所分離菌為支原體。
[0017] 采用肺炎支原體16SrRNA全長引物對其進行鑒定(見表1)，擴增出約1. 5化的片 段，與預期片段大小相符，該基因片段測序后使用BLAST對其堿基序列進行分析，其結果顯 示，所分離菌株的16SrRNA相應序列與Genbank登陸的肺炎支原體同源性為99%，進一步證 明所分離菌株為肺炎支原體。
[001引表1引物序列
二、 肺炎支原體誘導家蛹幼蟲后抑制性消減文庫的構建 選用2、3日齡家蛹（化wcaZ.)幼蟲來源（品種為綠頭蛹，蛹卵購買自吉林 省迂源生態(tài)養(yǎng)殖廠，由吉林農業(yè)大學藥理與毒理實驗室解育)。采用2號昆蟲針薩取肺炎支 原體菌液(濃度為l0Sccu/mL)刺入家蛹幼蟲（3日齡）腹部，每蟲1針。W薩取菌液針刺的 為誘導組，空針刺作為對照組。將同等數量的誘導組和對照組家蛹幼蟲置于人工氣候箱中， 在相同條件下(溫度為25~35