融合免疫調(diào)節(jié)蛋白及其制備方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求在2013年3月12日提交的美國臨時專利申請61/777016的優(yōu)先權(quán)， 出于所有目的將所述申請的內(nèi)容在此通過引用并入本文中。
[0003] 發(fā)明背景
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明大體涉及生產(chǎn)用于癌癥治療的重組嵌合融合蛋白的領(lǐng)域，更具體地涉及 抗-EGFR1-TGFPRII、抗-EGFR1-PD1和抗-CTLA4-PD1的融合分子其生產(chǎn)方法，其中所述方 法削減了生產(chǎn)成本并增加了重組嵌合融合蛋白的同源性。
【背景技術(shù)】
[0005] 盡管醫(yī)藥研究有許多進(jìn)展，但是癌癥仍是美國死亡的第二主要原因。臨床護(hù)理的 傳統(tǒng)模式如手術(shù)切除、放射療法和化學(xué)療法具有顯著的失效率，尤其對于實體腫瘤。因為原 發(fā)腫瘤不響應(yīng)或因為在起始部位處的再生或轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的復(fù)發(fā)而發(fā)生失效。癌癥仍是醫(yī)藥研 究和開發(fā)的中心焦點。
[0006] 對癌癥的免疫療法已經(jīng)探索了 一個世紀(jì)，但是僅僅是在過去十年才將各種抗體基 產(chǎn)品引入患有不同形式癌癥的患者的管理中。目前，這是臨床研究的最活躍領(lǐng)域之一，有許 多抗體治療產(chǎn)品已經(jīng)被批準(zhǔn)用于腫瘤學(xué)。
[0007] 使用特定抗體作為治療劑提供了相對于非靶向療法的優(yōu)點，所述非靶向療法例如 為通過藥物的口服或靜脈內(nèi)施用的全身化學(xué)療法或放射療法。存在兩種類型的抗體基療 法。更常用的類型是識別腫瘤抗原（即在腫瘤和癌細(xì)胞上表達(dá)且不在正常組織中表達(dá)的蛋 白）和開發(fā)抗體，優(yōu)選針對腫瘤抗原的單克隆抗體。人們便可以將任何治療劑如化療劑、放 射性核素、改性毒素等結(jié)合至該抗體以實現(xiàn)治療劑對腫瘤的靶向治療。另一種抗體基療法 是通過提供本身對于其靶向的腫瘤/癌細(xì)胞具有治療性能的抗體。該第二種形式的抗體基 療法的附加優(yōu)點是人們可以將另一種治療劑結(jié)合至該治療抗體以實現(xiàn)更有效的治療。任何 抗體引導(dǎo)的療法和特別是使用單克隆抗體（mAb)的療法的主要優(yōu)點是能夠?qū)⒃黾觿┝康?治療劑輸送至腫瘤，并且更多地使正常組織免受治療劑的副作用。
[0008] 盡管識別了用于癌癥療法的幾種抗體，但仍需要識別新的和更有效的療法來克服 免疫耐受性和激活T細(xì)胞應(yīng)答。另外，即使分子工程已經(jīng)改善了這種抗體基療法的前景，但 是仍存在關(guān)于生成的重組產(chǎn)品的連續(xù)性的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了用于生成如下的新型和一致的合成方法：同源重組融合免疫調(diào)節(jié)分 子，更具體地，包括連接至免疫調(diào)節(jié)蛋白的靶向抗體的重組嵌合多肽。
[0010] 為了介導(dǎo)對癌癥的免疫應(yīng)答，T細(xì)胞活化和共刺激都是重要的。T細(xì)胞的共刺激主 要通過CD28與其在抗原呈細(xì)胞（APC)上的B7家族的配體結(jié)合來介導(dǎo)。然而，在活化之后， T細(xì)胞表達(dá)被稱作細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(CTLA-4)的分子，其以比⑶28高的多的親和 力結(jié)合至B7配體，并且這種結(jié)合下調(diào)了T細(xì)胞活性。因此，包括結(jié)合至CTLA-4受體的抗體 將阻斷與B7家族的配體的相互作用并增強(qiáng)抗腫瘤應(yīng)答。
[0011] 上面討論的B7配體之一程序性死亡配體-I(PDLl)通過如下阻斷了抗腫瘤免疫： (1)通過結(jié)合至其在T細(xì)胞上的受體HH(⑶279)而使腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞耐受；（ii)通過經(jīng) 腫瘤細(xì)胞表達(dá)的I3DLl的H)-l信號傳導(dǎo)使得腫瘤細(xì)胞對于CD8+T細(xì)胞和FasL介導(dǎo)的裂解 是抗性的；和（iii)促進(jìn)誘導(dǎo)的T調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和維持。因此，TOLl是自然抗腫瘤免疫 和需要活化宿主T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫的癌癥免疫療法的主要障礙。這一理念得到了如 下研究的支持，所述研究證明了TOLl-PDl相互作用的抗體阻斷改進(jìn)了T細(xì)胞活化并減小了 腫瘤進(jìn)展。盡管TOLl或PDl的抗體已經(jīng)在癌癥患者的小團(tuán)體中顯示了療效，但是大多數(shù)患 者沒有受益于抗體治療。因此，需要用于調(diào)節(jié)ro-Li功能的機(jī)制，其將產(chǎn)生新的普遍適用的 用于將癌癥患者中的ro-Li介導(dǎo)的免疫抑制最小化的治療且比當(dāng)前可獲得的ro-i或ro-Li 的mAb更有效。
[0012] 許多上皮癌如結(jié)腸、頭頸部、乳房、卵巢、非小細(xì)胞肺（NSCL)和胰腺癌癥的特征是 癌細(xì)胞表面上的表皮生長因子受體（EGFR)的水平不正常得高。表皮生長因子受體家族 (EGFR ;HER1，HER2/neu，HER3和HER4)包括具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性的細(xì)胞膜受體，所述細(xì) 胞膜受體響應(yīng)不同配體的結(jié)合而誘發(fā)生物生理信號反應(yīng)的級聯(lián)。這些受體在惡性腫瘤細(xì)胞 在種種人腫瘤中的行為方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而誘導(dǎo)增加的增殖、降低凋亡、并增強(qiáng)腫瘤細(xì) 胞能動性和血管形成。因此，本發(fā)明包括革G向EGFR家族成員的抗體。
[0013] 本發(fā)明還提供通過削弱癌細(xì)胞的免疫耐受性而降低癌細(xì)胞生長的方法，其中T細(xì) 胞仍是有活性的并抑制T調(diào)節(jié)的招募，所述T調(diào)節(jié)的招募被認(rèn)為是抑制免疫系統(tǒng)的腫瘤應(yīng) 答。因此，由本發(fā)明的多核苷酸序列產(chǎn)生的嵌合多肽因為表達(dá)的融合或嵌合多肽而有用于 治療癌癥。
[0014] 在一個方面，本發(fā)明提供如下的嵌合多肽，其包含至少一個靶向癌細(xì)胞的靶向部 分和至少一個削弱癌細(xì)胞的免疫耐受性的免疫調(diào)節(jié)部分，其中所述靶向部分和所述免疫調(diào) 節(jié)部分通過足夠長度氨基酸殘基的氨基酸間隔子連接，使得兩個部分能夠成功地結(jié)合至它 們各自的靶點。在可選方案中，靶向部分和削弱癌細(xì)胞的免疫耐受性的免疫調(diào)節(jié)部分可以 直接相互結(jié)合。本發(fā)明的嵌合/融合多肽有用于結(jié)合至癌細(xì)胞受體并降低癌細(xì)胞避免免疫 應(yīng)答的能力。
[0015] 優(yōu)選靶向部分是對CTLA-4或EGFRl具有結(jié)合親和力的抗體，其中所述抗體是從如 下多核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的，所述多核苷酸序列缺失用于表達(dá)所表達(dá)的抗體的重鏈的C末端賴 氨酸的核苷酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過在轉(zhuǎn)錄期間去除抗體重鏈的C末端賴氨酸，終產(chǎn)品顯示提高 的同源性，由此降低了進(jìn)一步純化的需要和成本。
[0016] 已知在IgG分子在CHO細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程期間，將表達(dá)在重鏈C末端的賴 氨酸（K)。在商業(yè)產(chǎn)品中，必須去除這種表達(dá)的賴氨酸以增加純度。如在圖1中所示，在制 造的產(chǎn)品存在很多異源性。這是因為CHO細(xì)胞具有內(nèi)源酶羧肽酶B(CPB)而發(fā)生，只要表達(dá) 的抗體仍可細(xì)胞內(nèi)獲得，則所述羧肽酶B將會剪切C末端賴氨酸。然而，一旦抗體被分泌到 介質(zhì)中，該酶將不會剪切賴氨酸。因此，該內(nèi)源CPB的剪切效率是基于細(xì)胞內(nèi)的可獲得性。 這樣，抗體中的一些將會分泌有賴氨酸而一些將不會，并且這種組合將在分泌的產(chǎn)品中造 成顯著的異源性，即一些抗體有C末端賴氨酸而一些沒有。當(dāng)將重組產(chǎn)品用于治療用途時， 人們需要純化至同源性。因此，現(xiàn)有技術(shù)的重組產(chǎn)品需要另外的純化步驟，其中重組產(chǎn)品需 要首先用酶CPB處理并使用另外的步驟再次純化以從終產(chǎn)品去除任何賴氨酸和酶CPB。這 些另外的步驟向制造工藝添加了大量成本。
[0017] 通過從缺失用于表達(dá)所表達(dá)的抗體的重鏈的C末端賴氨酸的核苷酸的多核苷酸 序列轉(zhuǎn)錄表達(dá)的蛋白，本發(fā)明避免了以前的合成重組抗-CTLA-4和抗-EGFRl抗體的方法的 缺點。
[0018] 本發(fā)明是基于通過表達(dá)編碼削弱或逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的免疫耐受性的融合蛋白的多核 苷酸而制備嵌合/融合蛋白。癌細(xì)胞能夠通過在腫瘤微環(huán)境中的特定免疫抑制機(jī)制逃脫化 療劑或腫瘤靶向抗體的消除并且癌細(xì)胞的這種能力被視作免疫耐受性。這種免疫抑制機(jī)制 包括免疫抑制細(xì)胞因子（例如轉(zhuǎn)變生長因子P(TGF-P))和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和/或免疫抑制 髓樣樹突狀細(xì)胞（DC)。通過削弱腫瘤誘導(dǎo)的免疫耐受性，本發(fā)明提供用于癌癥治療的有效 組合物和方法，其任選地與另一種現(xiàn)有的癌癥治療相結(jié)合。通過活化和利用對于抗性和彌 散性癌細(xì)胞的T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性抗腫瘤，本發(fā)明提供削弱腫瘤誘導(dǎo)的免疫耐受性和增強(qiáng) 化療的抗腫瘤療效的策略。
[0019] 在另一個方面，本發(fā)明提供包含與至少一個免疫調(diào)節(jié)部分融合的至少一個靶向部 分的分子。所述靶向部分特異地結(jié)合靶分子，所述免疫調(diào)節(jié)部分特異地結(jié)合以下分子中的 一種：⑴轉(zhuǎn)化生長因子0 (TGF-0 )和/或（ii)程序性死亡配體I(TO-Ll)。
[0020] 在另一個方面，靶向部分包括含有重鏈和輕鏈兩者的抗體，其中抗體特異地結(jié)合 腫瘤細(xì)胞、腫瘤抗原、腫瘤血管、腫瘤微環(huán)境或腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的組分。值得注意的是，重 鏈和/或輕鏈可能單獨地連接至相同類型的免疫調(diào)節(jié)部分或分開的和不同的免疫調(diào)節(jié)部 分。另外，抗體靶向部分的重或輕鏈可以連接至免疫調(diào)節(jié)部分，免疫調(diào)節(jié)部分轉(zhuǎn)而可以進(jìn)一 步連接至第二免疫調(diào)節(jié)部分，其中在兩個免疫調(diào)節(jié)部分之間有連接子。
[0021] 在又一個方面，提供了包含腫瘤靶向部分和免疫調(diào)節(jié)部分的嵌合多肽，所述免疫 調(diào)節(jié)部分包含結(jié)合轉(zhuǎn)化生長因子P(TGF-P)的分子，其中腫瘤靶向部分是結(jié)合EGFRl的抗 體，其中抗體可以是完整的抗體、重鏈或輕鏈。
[0022] 腫瘤靶向部分可包括靶向癌細(xì)胞的單克隆抗體，包括但不限于西妥昔單抗，曲妥 單抗，利妥昔單抗，易普利姆瑪，tremelimumab，莫羅單抗-⑶3,阿昔單抗，達(dá)利珠單抗，巴利 昔單抗，帕利珠單抗，英夫利昔，吉妥珠單抗奧唑米星，阿侖單抗，替伊莫單抗，阿達(dá)木單抗， 奧馬珠單抗、托西莫單抗，1-131托西莫單抗，依法利珠單抗，貝伐單抗，帕尼單抗，帕妥珠單 抗，那他珠單抗，依那西普，IGNlOl(Aphton)，volociximab(BiogenIdec和]3DLBioPharm)， 抗-CD80 單抗（BiogenIdec)，抗-CD23 單抗（BiogenIdel)，CAT-3888(Cambridge AntibodyTechnology),CDP-79I(ImcIone),eraptuzumab(Immunomedics), MDX-010(MedarexandBMS)，MDX-060 (Medarex)，MDX-070 (Medarex)，matuzumab(默克）， CP-675,206(Pfizer)，CAL(Roche)，SGN-30(SeattleGenetics)，zanolimumab(Serono和 Genmab)，adecatumumab(Sereno)，奧戈伏單抗（UnitedTherapeitics)，尼妥珠單抗（YM Bioscience)，ABT_874(AbbottLaboratories)，地諾單抗（Amgen)，AM108(Amgen)，AMG 714(Amgen)，fontolizumab(BiogenIdee和]3DLBioPharm)，達(dá)克珠單抗（BiogentIdee 和]3DLBioPharm)，戈利木單抗（Centocor和Schering-Plough)，CNTO1275 (Centocor)， ocrelizumab (Genetech 和 Roche)，HuMax_CD20 (Genmab)，貝利木單抗（HGS 和 GSK)，依 中白珠單抗（Immunomedics)，MLN1202 (Millennium Pharmaceuticals),visilizumab (PDL BioPharm)，塔西單抗（Roche)，ocrerlizumab (Roche)，聚乙二醇化賽妥珠單抗（UCB， 前 Celltech)，依庫剛單抗（Alexion Pharmaceuticals)，培克珠單抗（Alexion Pharmaceuticals 和 Procter&Gamble)，阿昔單抗（Centocor)，ranibizimumab (Genetech)， 美泊利單抗（GSK)，TNX-355 (Tanox)，或MY0-029 (Wyeth)〇
[0023] 在優(yōu)選實施方式中，腫瘤靶向部分是通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的結(jié)合至CTLA-4或 EGFRl的單克隆抗體，其中所述方法包含以下步驟：
[0024] a.制備編碼融合蛋白的密碼子優(yōu)化的核酸序列，其中抗體的密碼子優(yōu)化的核酸序 列缺失用于表達(dá)在抗體重鏈C末端的賴氨酸的核苷酸；
[0025] b.在能夠瞬時或連續(xù)表達(dá)的宿主細(xì)胞中克隆所述融合蛋白的優(yōu)化序列；
[0026] c.在生長的合適條件下在介質(zhì)中生長宿主細(xì)胞并允許宿主細(xì)胞表達(dá)融合蛋白； 以及
[0027] d?收集分泌的融合蛋白。
[0028] 在又一個方面，免疫調(diào)節(jié)部分包括結(jié)合TGF-P并抑制其功能的分子。具體地，免 疫調(diào)節(jié)部分包括轉(zhuǎn)化生長因子-P受體TGF-PRII、TGF-PRIIb或TGF-PRIII的細(xì)胞外 配體-結(jié)合區(qū)域。在另一個方面，免疫調(diào)節(jié)部分包括TGF-PRII的細(xì)胞外配體-結(jié)合區(qū)域 (ECD)〇
[0029]在又一個方面，靶向部分包括特異地結(jié)合至HER2/neu、EGFRl、⑶20或細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞抗原-4 (CTLA-4)的抗體，其中免疫調(diào)節(jié)部分包括TGF-PRII的細(xì)胞外配體-結(jié)合 區(qū)域。
[0030] 在又一個方面，免疫調(diào)節(jié)部分包括特異地結(jié)合程序性死亡-1配體I(ro-Li)并抑 制程序性死亡-1配體1的活性的分子。
[0031] 在另一個方面，靶向部分包括特異地結(jié)合至冊1?2/1161146?1?1、〇)20、細(xì)胞毒性1'淋 巴細(xì)胞抗原-4(CTLA-4)、CD25(lL-2a受體；IL-2aR)或CD4的抗體、抗體片段或多肽，其中 免疫調(diào)節(jié)部分包括程序性死亡-I(PD-I)的細(xì)胞外配體-結(jié)合區(qū)域或胞外域。
[0032] 在又一個方面，靶向部分包括特異地結(jié)合至EGFRl和CTLA-4的抗體，免疫調(diào)節(jié)部 分包括來自與轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-P)相互作用的序列。
[0033] 在一個方面，本發(fā)明提供用于編碼融合多肽的優(yōu)化基因，所述融合多肽包含至少 一個靶向部分和至少一個免疫調(diào)節(jié)部分，用于治療人類受試者中的癌癥，其中已經(jīng)對所述 基因進(jìn)行了優(yōu)化以增加在人類受試者和/或細(xì)胞中的表達(dá)。
[0034] 在另一個方面，本發(fā)明提供包含用于治療人類受試者中的癌癥的優(yōu)化基因的載 體，其中所述優(yōu)化基因已經(jīng)被修飾為增加了CG序列。優(yōu)選地，載體包括用于編碼至少一個 靶向部分、至少一個免疫調(diào)節(jié)部分和連接部分的核苷酸序列，其中如在表2中所列出的，優(yōu) 化的核苷酸序列選自SEQIDNO: 1-7。
[0035] 在又一個方面，本發(fā)明提供治療受試者中癌癥的方法，所述方法包含：
[0036]提供至少一種包含如下核苷酸序列的重組載體，所述核苷酸序列編碼至少一個靶 向部分、至少一個免疫調(diào)節(jié)部分和位于靶向部分和免疫調(diào)節(jié)部分之間的連接部分，其中所 述核苷酸序列選自SEQIDNO: 1-7 ;和
[0037] 在使得所述核苷酸序列以在受試者中生產(chǎn)治療有效量的編碼的融合蛋白的水平 表達(dá)的條件下將所述重組載體施用至受試者。
[0038] 在又一個方面，本發(fā)明提供用本發(fā)明的編碼融合蛋白肽的多核苷酸序列轉(zhuǎn)染的重 組宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸序列選自SEQIDNO:1_7。
[0039] 在又一個方面，本發(fā)明構(gòu)想了制備本發(fā)明的嵌合融合蛋白的方法，其包含：
[0040] 用編碼嵌合融合蛋白的多核苷酸序列轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞以制造轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中 所述多核苷酸序列編碼至少一個靶向部分和至少一個免疫調(diào)節(jié)部分，其中所述多核苷酸序 列包含選自SEQIDNO: 1-7的序列的組合；和
[0041] 將所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞保持在足以表達(dá)所述嵌合融合蛋白的生物條件下。
[0042] 在另一個方面，本發(fā)明涉及嵌合融合蛋白的用途，其中在用于治療癌癥的藥物中 時，如分別在圖3、4和5中所示的，所述嵌合融合蛋白包含抗-EGFRl連接子H)1(SEQIDNO: 8、9、1〇和11);抗46卩1?1-連接子-16卩01?11(5￡〇1〇勵 ：8、9、1〇和12);抗-(：1'1^-4-連接 子-PDUSEQIDNO:13、14、10和11)。優(yōu)選地，融合蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)，并且以治療量 施用這種表達(dá)的蛋白以在需要其的受試者中減小癌癥的影響。
[0043] 在又一個方面，本發(fā)明提供治療腫瘤病的方法。在各個方面，該方法包括將本發(fā)明 的一種或多種融合蛋白施用至需要其的受試者，將本發(fā)明的一種或多種融合蛋白連同另一 種抗癌療法施用至受試者。在一個方面，所述抗癌療法包括化療分子、抗體、小分子激酶抑 制劑、激素制劑或細(xì)胞毒素劑。所述抗癌療法可還包括電離放射、紫外線放射、冷凍消融、熱 消融或射頻消融。
[0044] 在優(yōu)選的實施方式中，治療活性抗體-肽融合蛋白是融合至一個或多個削弱癌細(xì) 胞的免疫耐受性的免疫調(diào)節(jié)部分的