本發(fā)明涉及增加重組毒素的生物活性的方法。本發(fā)明還涉及含有前區(qū)域(pro-region)和毒素(尤其是節(jié)肢動物毒素)的序列的核酸構建體。

發(fā)明背景

針對不斷增加的全球人口的背景，對變得越來越有效的食物生產系統(tǒng)的壓力不斷增加。盡管采取作物保護方面的進展，有害生物仍然是作物生產的主要限制。對最主要六種作物在世界范圍內的可能損失的估計在25-80％之間變化(對于土豆40％)。一些有害生物和疾病可以通過施用農用化學品防治。然而，盡管在市場上可獲得多種殺蟲劑，植物病害仍是主要問題。

在過去，大多數開發(fā)殺蟲劑的研究集中于鑒別能夠用于該目的的化學實體。然而，這些非靶特異的殺蟲劑常常導致環(huán)境破壞，并且對非靶向物種(包括動物物種)和人健康具有消極影響。因此，已經批準禁止將某些化學化合物用于殺蟲劑的歐盟立法。因此，已經向鑒別可以用于有害生物控制的新類型的“生物殺蟲劑”轉變。生物殺蟲劑通常被認為是天然存在的物質(生化殺蟲劑)，能夠防治有害生物的微生物(微生物殺蟲劑)和含有添加的遺傳物質的植物生產的殺蟲物質(植物結合的防護劑)。希望該開發(fā)生物殺蟲劑的驅動力將導致用于預防植物病害的更環(huán)境友好的選擇。

由蜘蛛和其他節(jié)肢動物作為毒液合成的神經肽毒素已經是用于作為生物殺蟲劑開發(fā)的研究的主題。WO2006/052806、WO2005/025313和US2007/0066529描述了蜘蛛毒素毒液肽用作生物殺蟲劑的用途，并且Khan等人，2006描述了在植物中表達蜘蛛毒液毒素以保護植物免受昆蟲攻擊。本發(fā)明人之前表明，ω-ACTX-Hv1a，一種源自藍山漏斗網蜘蛛(Hadroncyhe versuta)的毒素，當融合能夠介導融合蛋白自無脊椎動物消化道(gut)的移位的蛋白如雪花蓮凝集素“載體”GNA時，可以用作針對寬范圍有害生物的有效殺蟲劑(WO2012/131302)。

發(fā)明概述

本發(fā)明部分基于本發(fā)明人對在用于表達重組毒素的構建體中包含前區(qū)域對所述重組毒素的生物活性的影響的研究。

本研究者希望確定可以如何提高體外表達的重組毒素蛋白的生物活性。為了研究這一點，本發(fā)明人分析了編碼節(jié)肢動物毒素的基因的DNA序列。在WO2012/131302中使用的節(jié)肢動物毒素是小的、富含半胱氨酸的蛋白，其屬于蛋白序列的幾個超家族(其包括來自除了節(jié)肢動物之外的生物的毒素)。所述編碼基因包括兩種在最終蛋白產物中不存在的序列；在翻譯期間移除的預測的N-端信號肽和在信號肽和如分離的蛋白的最終序列之間的預測的前區(qū)域(參見圖1A)。前區(qū)域是節(jié)肢動物和其他生物中的小肽毒素的常見特征(Windley等人，2012)。本發(fā)明人出人意料地發(fā)現在用于表達重組毒素的構建體中包含該預測的前區(qū)域導致比由缺少前區(qū)域的構建體制備的毒素更好的生物活性。此外，與由缺少前序列的構建體制備的毒素相比，在用于表達在基因組DNA序列中并不天然含有前序列的毒素(例如δ-amaurobitoxin-PI1a)的構建體中包含前序列同樣導致增加的生物活性。

因此，在本發(fā)明的第一方面，提供增加重組毒素的生物活性的方法，所述方法包括：

提供核酸構建體，所述核酸構建體包含：(i)毒素序列或其片段或變體，所述毒素序列或其片段或變體連接于(ii)前區(qū)域或其片段或變體；和任選地表達重組毒素。

在本發(fā)明的第二方面，提供核酸構建體，其包含：(i)前區(qū)域或其片段或變體；和(ii)與所述前區(qū)域相鄰的位點，其中可以插入毒素基因序列或其片段或變體。

在根據本發(fā)明的第二方面的實施方案中，所述核酸構建體還包含插入在與所述前區(qū)域相鄰的位點中的毒素基因序列或其片段或變體。

在本發(fā)明的第三方面中，提供宿主細胞，其包含根據本發(fā)明的第二方面的其中插入有毒素基因序列的核酸構建體或其任意實施方案。

在本發(fā)明的第四方面中，提供制備具有增加的生物活性的重組毒素的方法，所述方法包括在適于表達重組毒素的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的第三方面中所述的宿主細胞。

根據本發(fā)明的上述方面的毒素是殺蟲劑毒素。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，毒素可以源自節(jié)肢動物、軟體動物或其他無脊椎動物。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述毒素是節(jié)肢動物毒素。本發(fā)明的節(jié)肢動物毒素可以包括來自藍山漏斗網蜘蛛(Hadronyche versuta)的ω-ACTX-Hv1a和κ-ACTX-Hv1c、來自陰暗擬隙蛛(Pireneitega luctuosus)的δ-amaurobitoxin-PI1a、管道網型蜘蛛(Segestria florentina)毒素Sfl1-8、印度紅蝎(Buthus mesotamulus)毒素ButaIT、來自Eucratoscelus constrictus的theraphotoxin Ec2a、來自Apomastus schlingeri的cyrtoautoxin As1a、來自Loxosceles intermedia的sicaritoxin Li1a，和其他類似毒素。

根據本發(fā)明的毒素可以包含20-100個氨基酸殘基的肽。所述毒素可以含有多個半胱氨酸殘基，其形成內部二硫鍵。

在一個實施方案中，所述毒素是ω-ACTX-Hv1a或其片段或變體。ω-ACTX-Hv1a毒素是本領域中已知的(Fletcher等人，1997)。其是分離自藍山漏斗網蜘蛛(Hadroncyhe versuta)的毒素。ω-ACTX-Hv1a的氨基酸序列是已知的，編碼ω-ACTX-Hv1a的核酸序列也是已知的。ω-ACTX-Hv1a毒素是鈣通道拮抗劑，其之前已被證明阻斷無脊椎動物鈣通道，但不阻斷脊椎動物鈣通道。在多數情況下，希望使用對脊椎動物沒有活性的殺蟲劑，從而避免對人或動物的有害作用。

之前報道ω-ACTX-Hv1a在局部用于毛蟲時其本身可以用作殺蟲劑(Khan等人，2006)。然而，上述文獻的作者報道的是所述肽在含有已知自身具有殺昆蟲性的咪唑的溶液中的局部應用。此外，未報道單獨的所述肽的殺昆蟲活性的進一步證據，其他涉及ω-ACTX-Hv1a的公開僅述及通過注射入無脊椎動物有害動物的活性。

本發(fā)明人之前已經證明，重組ω-ACTX-Hv1a的生物活性可以通過產生融合蛋白來提高，其中毒素ω-ACTX-Hv1a與能夠介導融合蛋白自無脊椎動物消化道的移位的“載體”肽融合(WO2012/131302)。本發(fā)明人使用植物凝集素GNA作為這樣的載體肽的實例。

為了研究可以如何另外地提高重組毒素融合蛋白的生物活性，本發(fā)明人分析了編碼節(jié)肢動物毒素尤其是ω-ACTX-Hv1a的基因的DNA序列。發(fā)現很多節(jié)肢動物基因含有不存在于最終蛋白中的預測的前區(qū)域，其之前未被結合到用于體外表達融合蛋白的構建體中。如可從本文看出的，本發(fā)明人將前區(qū)域的序列結合到用于制備重組毒素蛋白的核酸構建體中。本發(fā)明人發(fā)現，與由未修飾的構建體(即含有ω-ACTX-Hv1a序列而沒有另外的前區(qū)域)制備重組ω-ACTX-Hv1a相比，通過注射或在包含在膳食中的情況下施用于多種無脊椎有害生物的由含有前區(qū)域的構建體制備的重組ω-ACTX-Hv1a導致增加的癱瘓和死亡。因此，當以此形式提供時，ω-ACTX-Hv1a肽毒素可以非常有效地作為針對無脊椎動物的殺蟲劑。

如本文使用的，并且如下文進一步說明的，“殺蟲劑”是指針對任何有害生物使用的化學物質、生物劑(如病毒或細菌)、抗微生物劑、消毒劑或裝置。有害生物包括昆蟲、植物病原體、雜草、軟體動物、鳥、哺乳動物、魚、線蟲(蛔蟲)和破壞財產、傳播疾病或作為疾病的載體或引起麻煩的微生物。然而，對于本發(fā)明，通過“殺蟲劑”我們是指有害生物是任何破壞財產，尤其是農產品的無脊椎動物。

在備選實施方案中，本發(fā)明可以包含δ-amaurobitoxin-PI1a毒素或其片段或變體。

毒素δ-amaurobitoxin-PI1a來自蜘蛛陰暗擬隙蛛(Pireneitega luctuosus)并且在其內源基因序列中不含有預測的前區(qū)域。出人意料地，本發(fā)明人發(fā)現，在用于重組δ-amaurobitoxin-PI1a的表達構建體中包括前區(qū)域(基于存在于全球數據庫中的類似序列設計)產生針對無脊椎有害生物具有增加的生物活性的重組毒素。該意料之外的研究結果表明，可以使用本發(fā)明通過設計前區(qū)域并將其結合到表達構建體中來增加不含有與其內源基因序列結合的前區(qū)域的重組毒素的生物活性。

盡管不希望受理論限制，但是據信，在核酸構建體中包括前區(qū)域，導致毒素在體外表達時折疊的改善。

“片段或變體”包括的是，本發(fā)明的毒素序列可以與天然存在的序列不同，條件是所述片段或變體基本上保持毒素的生物活性。保持毒素的生物活性意為與天然毒素相比，所述片段和/或變體保持至少部分的殺蟲劑活性。通常，所述片段和/或變體保持至少50％，如60％、70％、80％或90％活性。在一些情況下，所述片段和/或變體可以具有比天然毒素更高的殺蟲劑活性。在一些實施方案中，與天然毒素相比，所述片段和/或變體可以顯示另一種生理特征的提高。例如，與天然毒素相比，所述片段和/或變體可以具有更長的體外和/或體內半衰期。

序列的“變體”包括的是保守或非保守插入、缺失和置換。尤其包括這樣的核苷酸序列變體，其中此種改變基本上不改變毒素的生物活性。技術人員將知道可以在損失生物活性的情況下改變這樣的序列。特別地，核苷酸序列的單個改變可以不導致序列表達后氨基酸序列的改變。此外，如果核苷酸序列的改變導致選擇性的氨基酸的結合，但其中相應的氨基酸的理化性質基本上沒有改變(例如，保守置換如Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr)，則相應的毒素的功能性不應該受影響。此外，毒素的非功能區(qū)域內的小的缺失也是可容忍的，并且因此被認為是用于本發(fā)明的“變體”?！白凅w”還包括重組毒素蛋白，其中氨基酸通過例如糖基化或二硫鍵形成被翻譯后修飾。技術人員可以容易地采用本文中描述的實驗過程來確定“變體”是否仍然可以作為毒素行使功能。

如果變體的序列與毒素的“天然存在的”核苷酸序列具有至少75％，進一步更優(yōu)選至少80％，進一步優(yōu)選至少85％，更進一步優(yōu)選至少90％和最優(yōu)選至少95％或97％同一性，則是優(yōu)選的。

在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及節(jié)肢動物毒素。本發(fā)明人研究的節(jié)肢動物毒素是小的、富含半胱氨酸的蛋白，其屬于多個蛋白序列超家族。這些毒素中的一些的基因序列含有不存在于最終蛋白產物中的序列。這些額外的序列包括在翻譯期間被移除的預測的N-端信號肽和在信號肽與如分離的蛋白的最終序列之間的預測的前區(qū)域(參見圖1A)。

多數富含半胱氨酸的小肽毒素最初被翻譯為較大的前體(70–120個氨基酸)，所述前體含有在翻譯期間被移除的保守的N-端信號肽(大約20個氨基酸的)，在蛋白家族內顯示顯著序列保守性的前區(qū)域(大約15-60個氨基酸)，和產生成熟毒素并且更可變的C-端毒素編碼區(qū)。

前區(qū)域已經從編碼很多毒素的cDNA序列被預測，并且當在蛋白家族的成員之間比較時其通常不如成熟毒素序列可變，盡管還未鑒別序列基序如在信號肽中發(fā)現的那些。然而，前區(qū)域常常富含酸性氨基酸殘基(Tedford等人，2004)。例如，與ω-ACTX-Hv1a毒素相關的前區(qū)域的氨基酸序列是：

EDTRADLQGGEAAEKVFRR(還參見圖1B)

與Ao1b毒素相關的前區(qū)域的氨基酸序列是：

ISYEEGKELFQKER

前區(qū)域可以通過將對從其正常來源分離的蛋白確定的序列與通過編碼它的基因預測的序列相比較來鑒定。這樣的比較可以顯示蛋白水解或裂解步驟是否與轉錄同時或在轉錄后發(fā)生從而獲得最終蛋白產物。前區(qū)域被從成熟蛋白的N-末端移除；然而，它們區(qū)別于參與導向多肽進入分泌途徑的信號肽。信號肽可以使用軟件算法如SignalP*(Nielsen等人，1997)基于通過基因預測的蛋白序列鑒定。為了鑒別前區(qū)域，首先將直接確定的蛋白序列與預測的序列相比，以顯示一個區(qū)域被從N-末端移除；；然后通過從所述軟件預測確定信號肽的存在；然后前區(qū)域可以被鑒定為信號肽和成熟蛋白N-末端之間的序列區(qū)域?？梢曰谏鲜隼砟?，使用可在Arachnoserver數據庫(http://www.arachnoserver..org/spiderP.html；Wong等人，2013)上自由獲得的軟件(SpiderP)預測節(jié)肢動物毒素中的前區(qū)域。該支持向量機(SVM)法使用專門設計的算法來將局域和全球序列信息相結合。

使用上述方法鑒別的前區(qū)域可以用于本發(fā)明。在其天然存在的序列中本發(fā)明的毒素可以與本發(fā)明的上述方面的前區(qū)域結合。備選地，前區(qū)域的序列可以基于可在全球數據庫中獲得的序列設計，或基于上述方法鑒定，并且結合到通常(即，在天然存在的序列中)不與前區(qū)域結合或在天然存在的序列中與不同的前區(qū)域結合的毒素的核酸構建體中。

在本發(fā)明的實施方案中，前區(qū)域包含氨基酸序列EDTRADLQGGEAAEKVFRR或其片段或變體。

在本發(fā)明的進一步實施方案中，前區(qū)域包含氨基酸序列ISYEEGKELFQKER或其片段或變體。

前區(qū)域的“片段或變體”包括的是，前區(qū)域的核酸序列可以不同于本領域中已知的和天然存在的，條件是所述片段或變體基本上保持前區(qū)域的生物活性，即其仍然能夠提高與其相結合的毒素的生物活性。

在伴隨的實施例中，本發(fā)明人已經表明，前區(qū)域可以在表達期間被去除，以致其不存在于最終蛋白或融合蛋白中。然而，應該理解，表達后保持前區(qū)域的蛋白/融合蛋白仍落在本發(fā)明的范圍內。

根據本發(fā)明的上述方面的核酸構建體和其任意實施方案也可以含有能夠介導由構建體產生的蛋白自無脊椎動物消化道的移位的蛋白(“載體”蛋白)的序列或其片段或變體。該序列可以融合至毒素蛋白序列，從而產生融合蛋白。任何結合于昆蟲消化道的蛋白都可以用作載體蛋白，條件是其在消化道中發(fā)現的環(huán)境下穩(wěn)定，并且對哺乳動物無毒性。

能夠用作載體蛋白的合適的蛋白包括凝集素。通常，可以使用任何結合于昆蟲消化道的凝集素。在本發(fā)明的一個實施方案中，載體蛋白是植物凝集素。

本發(fā)明人之前證明某些植物凝集素對消化道蛋白水解有抗性并且有能力充當載體以將其他肽從靶物種的消化道遞送到循環(huán)系統(tǒng)。本發(fā)明人還證明將植物凝集素與毒素融合有助于跨無脊椎有害生物的消化道壁的移位，由此增加毒素的生物活性，并且使得這樣的融合蛋白能夠被用作殺蟲劑。

本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是這樣的，其中所述載體蛋白是選自以下各項中的任一種或多種的植物凝集素：雪花蓮凝集素(GNA)、大蒜凝集素大蒜(Allium sativum)、豌豆凝集素豌豆(Pisum sativum)(P-lec)、花生凝集素花生(Arachis hypogaea)、菜豆凝集素(PHA，植物凝集素)或其片段或變體。

植物凝集素的“片段或變體”包括的是，特定凝集素的核酸序列可以區(qū)別于本領域中已知的和天然存在的，條件是所述片段或變體基本上保持凝集素的生物活性，即其能夠介導融合蛋白自無脊椎動物消化道的移位。

在優(yōu)選的實施方案中，所述凝集素是GNA。在伴隨的實施例中，本發(fā)明人出人意料地證明，與單獨的毒素、僅與GNA連接的毒素和僅與前區(qū)域連接的毒素相比，由除了前區(qū)域和GNA的序列外還含有毒素序列的核酸構建體制備的毒素蛋白產生針對無脊椎有害生物的增加的生物活性。雖然預期添加前區(qū)域或與另一蛋白融合能夠各自增強重組毒素的生物活性，但是不會預期兩種修飾的組合將產生加成效應?？紤]到的是這兩種修飾都會導致相同的結果，即正確的蛋白折疊，并且因此任一種修飾或二者會導致生物活性的相同的增強。本發(fā)明人已經證明這并非事實。

如將理解的，用于制備包含(i)節(jié)肢動物毒素序列，(ii)前區(qū)域和(iii)載體蛋白序列的核酸構建體的起始材料是由(i)前區(qū)域和(ii)載體蛋白序列組成的核酸構建體。

因此，本發(fā)明的第五方面包括核酸構建體，所述核酸構建體包含(i)前區(qū)域或其片段或變體和(ii)能夠介導由所述構建體生產的蛋白自無脊椎動物消化道的移位的蛋白(載體蛋白)的序列或其片段或變體。

前區(qū)域和載體蛋白可以是關于本發(fā)明的上述方面所討論的任何前區(qū)域/載體蛋白。

制備核酸構建體的方法使用常規(guī)分子生物學技術。已經開發(fā)了多種方法用于連接多核苷酸以形成連續(xù)的單鏈或雙鏈(特別是雙鏈)DNA，例如經由利用限制性酶的消化產生的互補粘性末端。合適的方法在Sambrook&Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual：第3版中描述。技術人員可以容易地使用這樣的方法來制備根據本發(fā)明第二方面的核酸分子。此外，伴隨的實施例提供了關于如何制備這樣的分子的進一步詳情。

希望的制備本發(fā)明的核酸構建體的方法使用聚合酶鏈式反應。該方法可以用于例如通過改造限制性酶消化的合適位點將DNA引入合適的載體中，或其可以用于以本領域中已知的其他有用方式修飾DNA。

在本發(fā)明的實施方案中，根據本發(fā)明的上述方面及其實施方案的核酸構建體是表達構建體。

“表達構建體”是本領域中公知的術語。表達構建體是生物技術中用于生產重組蛋白的基本工具。表達構建體通常包括用于將具體核酸序列引入靶細胞“宿主細胞”中的質粒。一旦表達構建體在細胞內部，由該核酸序列編碼的蛋白由細胞轉錄和翻譯機制核糖體復合物生產。所述質粒還可以包括維持和擴增載體所需的核酸序列(在一些情況中通過整合到宿主基因組中)。表達載體的目標是生產大量的穩(wěn)定的信使RNA，并且因此生產蛋白。

本發(fā)明的核酸構建體還可以包含適當的調節(jié)序列，其包括啟動子序列、終止子片段、增強子序列、標志物基因和/或其他序列。對于進一步詳情，參見，例如，Sambrook&Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual：第3版。

還可以將核酸構建體改造成含有充當增強子和啟動子區(qū)的調節(jié)序列并且導致所述構建體上攜帶的融合蛋白序列的有效轉錄。調節(jié)單元的很多部件位于異源基因的編碼序列的上游并且與其可操作連接。如果預期在真核宿主例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達，則所述核酸構建體還可以含有包含聚腺苷酸化位點的下游3’非翻譯區(qū)。調節(jié)序列可以引導異源編碼序列的組成型或誘導型表達。

用于連接個體核酸片段以產生本發(fā)明的核酸構建體的方法可以在前區(qū)域的N-末端引入2-4個額外的氨基酸殘基，并且在載體蛋白的C-末端引入多至12個氨基酸。在毒素和載體序列間還可以存在短的“接頭”區(qū)。這些另外的氨基酸殘基保持編碼序列并且不影響毒素或融合蛋白的活性。

如本文使用的，術語“生物活性”是指重組毒素對無脊椎有害生物的毒性。生物活性的計算可以基于LD₅₀。

與由沒有前區(qū)域的核酸構建體生產的重組毒素的生物活性相比，將前區(qū)域結合入用于表達重組毒素的核酸構建體可以導致生物活性的至少25％，50％，100％，200％，300％，400％或更高的增加。在本情況中，這樣的生物活性可以是殺蟲劑活性，其可以通過多種技術測量，包括有害生物死亡、減少的壽命、繁殖限制如減少的繁殖率或卵產生等。

與由含有毒素序列和前區(qū)域的核酸構建體生產的重組毒素的生物活性相比，進一步將載體蛋白的序列結合入用于表達重組毒素的表達構建體可以導致生物活性的至少25％，50％，100％，200％，300％，400％或更高的增加。

本發(fā)明的表達系統(tǒng)可以是原核的或真核的。合適的表達系統(tǒng)包括細菌表達系統(tǒng)(例如大腸桿菌(E.coli)和枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis))，酵母表達系統(tǒng)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德畢赤酵母)，絲狀真菌表達系統(tǒng)(例如曲霉(Aspergillus))，和植物、動物和昆蟲細胞表達系統(tǒng)。然而，優(yōu)選的是，使用的表達系統(tǒng)是巴斯德畢赤酵母。畢赤酵母蛋白表達系統(tǒng)是本領域中公知的，并且因此可容易地獲得用作宿主細胞的細胞。

本發(fā)明的宿主細胞可以是原核或真核的。優(yōu)選的原核宿主細胞通常是大腸桿菌菌株如，例如大腸桿菌菌株DH5和RR1。優(yōu)選的真核宿主細胞包括酵母、昆蟲和哺乳動物細胞，優(yōu)選脊椎動物細胞如來自小鼠、大鼠、猴或人成纖維細胞系的那些。酵母宿主細胞包括YPH499、YPH500和YPH501，其通?？蓮腟tratagene Cloning Systems，La Jolla，CA92037，USA獲得。然而，優(yōu)選的是，宿主細胞是酵母巴斯德畢赤酵母。畢赤酵母蛋白表達系統(tǒng)是本領域中公知的，并且因此可容易獲得用作宿主細胞的細胞。特別優(yōu)選的是，細胞株是SMD1168H，其可以從Invitrogen^TM獲得。

用核酸構建體轉化適當細胞宿主通過已知方法完成，所述方法通常取決于使用的載體的類型。關于原核宿主細胞的轉化，參見例如，Sambrook&Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual：第3版。酵母細胞的轉化描述于Sherman等人，1986中。

電穿孔也可用于轉化和/或轉染細胞，并且在本領域中公知用于轉化酵母細胞、細菌細胞、昆蟲細胞和脊椎動物細胞。通過電穿孔轉化酵母的方法在Becker&Guarente，1990中公開。

成功轉化的細胞，即含有根據本發(fā)明的核酸構建體的細胞可以通過公知技術鑒別。例如，可以將通過引入本發(fā)明的核酸構建體得到的細胞培養(yǎng)以產生毒素融合蛋白。可以將細胞收獲并裂解，并且針對所述DNA的存在檢查其DNA內含物，如Southern，1975或Berent等人，1985描述的。

因此，除了轉化的宿主細胞本身，本發(fā)明還預期在營養(yǎng)培養(yǎng)基中的所述細胞的培養(yǎng)物，優(yōu)選單克隆培養(yǎng)物，或源自單克隆培養(yǎng)物的培養(yǎng)物。

本發(fā)明的上述方面的一個實施方案是這樣的，其中核酸構建體還包含編碼親和標簽的序列以幫助在表達后回收和純化毒素蛋白。

使用短氨基酸標簽序列來幫助親和純化重組蛋白是本領域中公知的。事實上，很多可商購的蛋白表達構建體包括編碼這樣的標簽的核酸序列。將目的蛋白以這樣的方式插入表達構建體中，使得親和標簽與所述蛋白相連。多種不同的親和標簽在本領域中是已知的，包括幾丁質結合蛋白(CBP)，麥芽糖結合蛋白(MBP)，谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)，和聚組氨酸-標簽(His-標簽)。

His-標簽是蛋白中的氨基酸基序，其由至少五個組氨酸(His)殘基組成，常常在蛋白的N-或C-末端。其也被稱為六組氨酸-標簽，6xHis-標簽，并且商標名為其是公知的親和標簽并且將His-標簽引入重組蛋白的方法是本領域中已知的，純化具有His-標簽的蛋白的常規(guī)方法也是已知的。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是這樣的，其中另外的親和標簽序列編碼His-標簽。

本發(fā)明的第四方面的方法還可以包括將本發(fā)明的第三方面(及在本說明書中描述的其任意實施方案)描述的宿主細胞在適當的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)足夠時間以獲得融合蛋白的表達。

培養(yǎng)宿主細胞和分離重組蛋白的方法是本領域中公知的。合適的純化技術的實例在伴隨的實施例中描述。如上文描述的，融合蛋白可以包含親和標簽以幫助使用親和試劑的純化，如本領域技術人員已知的。

根據本發(fā)明的具有增加的生物活性的重組毒素蛋白可以通過公知的方法從重組細胞培養(yǎng)物回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析，疏水相互作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析和凝集素層析。

備選地，根據本發(fā)明的具有增加的生物活性的重組毒素蛋白可以從上清回收。在該情況下，通過如本領域技術人員將理解的簡單離心將宿主細胞從上清移出?？梢允褂帽绢I域中已知的標準技術如上述技術從培養(yǎng)基中分離蛋白。

本發(fā)明人已經確定，根據本發(fā)明的具有增加的生物活性的重組毒素蛋白可以用作殺蟲劑。

本發(fā)明的第六方面提供殺蟲劑組合物，其包含根據本發(fā)明的第一或第四方面及在本說明書中描述的其任意實施方案制備的毒素蛋白。

殺蟲劑可以是化學物質、生物劑(如病毒或細菌)、抗微生物劑、消毒劑或用于針對任意有害生物的裝置。有害生物包括昆蟲、植物病原體、雜草、軟體動物、鳥、哺乳動物、魚、線蟲類(蛔蟲)和破壞財產、傳播疾病的微生物或是疾病的載體或引起麻煩。然而，對于本發(fā)明，通過“殺蟲劑”，我們的意思是，有害生物是破壞財產，特別是農業(yè)商品的任何無脊椎動物。

更優(yōu)選地，毒素蛋白能夠消滅或至少削弱來自以下目的昆蟲有害生物：鞘翅目(Coleopterans)例如黃瓜十一星葉甲(Diabrotica undecimpunctata)；四紋豆象(Callosobruchus maculatus)；鱗翅目(Lepidopterans)例如歐洲玉米螟(Ostinia nubilalis)；煙草天蛾(Manduca sexta)；斑禾草螟(Chilo partellus)：同翅目(Homopteran)有害生物例如褐飛虱(Nilaparvata lugens)；黑尾葉蟬(Nephotettix cinciteps)；小綠葉蟬(Empoasca fabae)；桃蚜(Myzus persicae)；豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)；雙翅目(Dipteran)例如麥稈蠅(Chlorop pumilionis)；直翅目(Orthoptera)例如蟋蟀和蝗蟲；等翅目(Isoptera)例如白蟻；纓翅目(Thysanoptera)例如牧草蟲(thrips)；膜翅目(Hymenoptera)例如螞蟻和螨目(Acarina)的節(jié)肢動物有害生物(螨)。

特別優(yōu)選的有害生物包括鱗翅目甘藍夜蛾(Mamestra brassicae)、馬鈴薯葉甲(Leptinotarsa decemlineata，鞘翅目)、麥地種蠅(Delia coarctata，花蠅科(Anthomyiidae))和麥長管蚜(Sitobion avenae，同翅目)。

本發(fā)明人還研究了根據本發(fā)明的方法產生的具有增加的生物活性的重組毒素蛋白是否對軟體動物具有殺蟲活性。如在伴隨的實施例中表明的，他們出人意料地發(fā)現，麥蛞蝓(grey field slug)(Decoceras reticulatum，一種軟體動物)對根據本發(fā)明生產的重組毒素蛋白的殺蟲活性易感。因此，根據本發(fā)明的重組毒素蛋白能夠消滅或至少削弱包括蛞蝓和蝸牛的軟體動物，并且特別是麥蛞蝓。

優(yōu)選根據本發(fā)明的殺蟲組合物是任何所需制劑的形式，如溶液、乳液、噴劑、混懸劑、粉劑、泡沫、糊劑、粒劑、氣溶膠、膠囊或其他精細或粗略分開的材料或用于天然或合成材料的浸漬劑。

在優(yōu)選的實施方案，殺蟲組合物是與合適的稀釋劑、佐劑、防腐劑、分散劑、溶劑、乳化劑等混合的噴劑、混懸劑等的形式。合適的組合物成分是本領域中常規(guī)使用的那些，并且尤其是適于本發(fā)明口服施用應用的那些。所述組合物可以使用任何合適的溶劑(優(yōu)選水、醇、礦物油等)、任何合適的固體載體如高嶺土、粘土、滑石、白堊、石英、凹凸棒石(attapulgite)、蒙脫石、硅藻土、硅石等，使用作為顆粒支持物的任何固體載體如方解石、大理石、浮石和粉碎的天然纖維材料等來獲得。

用于本發(fā)明的組合物可以另外用于與其他已知的殺昆蟲劑、生長促進或調解物質、除草劑、殺真菌劑、增效劑等一起的緊密或物理混合物。

所述組合物優(yōu)選適于與植物或其生長處物理或化學相關，并且適于被病原體口服攝取。

所述組合物可以因此包含以重量計0.001％至99％，優(yōu)選以重量計0.5％至98％，更優(yōu)選以重量計1.0％至95％的量的融合蛋白(毒素)。

上文使用的術語“生長處”是指作物或植物生長的物理位置。例如，對于農作物，生長處可以是田地；對于蔬菜作物，生長處可以是花圃或菜園；對于觀賞植物，生長處可以是花盆或容器。

本發(fā)明的第七方面提供制備根據本發(fā)明的第六方面(和本說明書中描述的其任意實施方案)的殺蟲劑組合物的方法，所述方法包括將一定量的根據本發(fā)明(和本說明書中描述的其任意實施方案)生產的具有增加的生物活性的毒素蛋白與一種或多種合適的載體、稀釋劑、佐劑、防腐劑、分散劑、溶劑、乳化劑以有效的殺蟲量混合。

本發(fā)明的第八方面提供預防或治療植物的有害生物感染的方法，所述方法包括向植物或其生長處施用一定量的根據本發(fā)明生產的具有增加的生物活性的毒素蛋白或根據本發(fā)明第六方面的殺蟲劑組合物(和本說明書中描述的其任意實施方案)；或向植物引入根據本發(fā)明的核酸構建體。

使用本發(fā)明第八方面的方法可以防治眾多不同的軟體動物有害生物，特別是麥蛞蝓(Decoceras reticulatum)。因此，本發(fā)明第八方面的方法包括其中軟體動物是蛞蝓或蝸牛，并且特別是麥蛞蝓。

本發(fā)明的第九方面提供預防或治療植物的軟體動物有害生物感染的方法，所述方法包括向植物或其生長處施用一定量的根據本發(fā)明生產的具有增加的生物活性的毒素蛋白或根據本發(fā)明第六方面的殺蟲劑組合物(和本說明書中描述的其任意實施方案)，或向植物引入根據本發(fā)明的核酸構建體。

根據本發(fā)明和上述的本發(fā)明的相關方面和實施方案生產的具有增加的生物活性的毒素蛋白，尤其是殺蟲劑組合物，可以用作軟體動物殺滅劑。

將理解，適當制備和配制所述軟體動物殺滅劑，以允許容易被消費者使用。例如，可以將軟體動物殺滅劑制備為可以噴在作物上的液體，或也可以施用于作物和/或生長處的顆粒。

本領域中公知，軟體動物殺滅劑通常以餌料(或丸劑)形式存在。當以這樣的形式存在時，使用者可以容易地將軟體動物殺滅劑用于植物或其生長處，從而預防或治療軟體動物有害生物感染。

因此本發(fā)明的第十方面提供殺軟體動物誘餌組合物，其包含根據本發(fā)明生產的具有增加的生物活性的毒素蛋白和/或根據本發(fā)明第六方面的殺蟲劑組合物。

所述丸劑或餌料還可以包括軟體動物引誘劑，從而促進有害生物暴露于軟體動物殺滅劑。軟體動物引誘劑是引誘軟體動物的任何物質。引誘劑可以是助食素。助食素通常用于蛞蝓和蝸牛餌料制劑，以吸引腹足動物攝取軟體動物殺滅劑，并且通常是引誘劑和/或食物。還可以使用助食素與其他合適的有機和/或無機載體的混合物。用于軟體動物殺滅劑的合適的助食素包括研磨的谷物(如小麥粉、大麥粉、黑麥粉和水稻淀粉)、粉碎的大豆、魚粉、糖蜜、粉碎的菜籽等。助食素的混合物也可以用于本發(fā)明。其他已知引誘劑包括啤酒、酵母和死蛞蝓提取物。餌料組合物還可以包含一種或多種驅鳥劑，如蒽醌。

可以配制組合物以提供軟體動物殺滅劑隨時間的緩慢或延遲釋放，從而提供針對軟體動物的長期保護?？梢杂糜谒鲋苿┑暮线m的緩釋輔料包括，例如，樹脂(如脲/甲醛樹脂)、大豆粉、蠟、硬脂酸酯和油(如蓖麻油)。

可以用于本發(fā)明的餌料或丸劑組合物的其他輔料包括，例如，粘合劑(如甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、天然蠟、化學改性蠟和合成蠟、糖、淀粉、藻酸鹽、瓊脂、木質素磺酸酯和阿拉伯膠)、保濕劑(如多元醇，例如糖或甘油)、防腐劑、著色劑和溫血物種驅逐劑。

還可以將餌料組合物涂層以保護它免于水分降解。這樣的涂層可以延長餌料組合物的壽命，并且減少所需的再施用頻率。適當地，當施用于潮濕的土壤時，餌料組合物不過早降解。

餌料組合物通常以粒劑或丸劑的形式提供。丸劑的大小使得其可以容易地被目標腹足動物消耗以保證攝取。通常，丸劑長約1mm至約5mm。

本發(fā)明的第十一方面提供轉基因植物或其后代，其包含能夠表達根據本發(fā)明的毒素的根據本發(fā)明的核酸構建體。

“轉基因植物”包括的是，植物可以具有結合入其生殖系的根據本發(fā)明的核酸構建體或植物可以含有根據本發(fā)明的外源核酸構建體，其均可以在植物中表達。

將理解，含有根據本發(fā)明的核酸構建體的轉基因植物，當被以正確方式調節(jié)時，將產生根據本發(fā)明的方法的具有增加的生物活性的毒素蛋白。產生的蛋白/融合蛋白將作為殺蟲劑行使功能。

可以將多種不同的植物物種修飾成包括根據本發(fā)明的核酸構建體。

本領域技術人員將知曉，可以使用任何單子葉或雙子葉植物。雙子葉植物可以選自包括但不限于以下各項的科：菊科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)(例如歐洲油菜(Brassica napus))、藜科(Chenopodiaceae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、豆科(Leguminosae)(蘇木科(Caesalpiniaceae)、蘇木亞科(Aesalpiniaceae)含羞草科(Mimosaceae)、蝶形花科(Papilionaceae)或豆科(Fabaceae))、錦葵科(Malvaceae)、薔薇科(Rosaceae)或茄科(Solanaceae)。例如，植物可以選自萵苣、向日葵、擬南芥、花椰菜、菠菜、西瓜、南瓜、卷心菜、番茄、馬鈴薯、青椒、煙草、棉花、秋葵、蘋果、玫瑰、草莓、苜蓿、豆、大豆、菜豆、豌豆、小扁豆、花生、鷹嘴豆、杏仁、梨、桃、葡萄藤或柑橘類物種。

還包括的是生物燃料和生物能源作物如甘蔗、油菜/加拿大油菜、亞麻籽、柳樹、楊樹、雜交楊樹、柳枝稷、芒草或裸子植物，如火炬松。還包括的是用于青貯飼料(例如飼草玉米)、放牧或草料(例如草、三葉草、sanfoin、苜蓿)、纖維(例如棉花、亞麻)、建筑材料(例如松樹、橡樹)、紙漿(例如楊樹)、化學工業(yè)的進料儲存(例如高芥酸油菜、亞麻籽)的作物。

單子葉植物可以，例如，選自棕櫚科(Arecaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)或禾本科(Poaceae)。例如，植物可以是谷類作物，如小麥、水稻、大麥、玉米、燕麥、高粱、黑麥、洋蔥、韭菜、粟、蕎麥、草坪草、多花黑麥草(Italian rye grass)、柳枝稷、芒草、甘蔗或羊茅屬物種。

優(yōu)選，植物是作物植物。作物植物意為以商業(yè)規(guī)模種植的用于人或動物消費或使用或用于其他非食物/飼料用途的任何植物。優(yōu)選的植物是玉米、煙草、小麥、水稻、油菜、高粱、大豆、馬鈴薯、番茄、大麥、豌豆、豆、菜豆、棉花、萵苣、花椰菜或其他蕓苔類蔬菜。

核酸構建體可以作為轉基因引入植物。這可以通過植物遺傳改造領域中已知的多種方法進行，例如利用農桿菌、粒子轟擊、電穿孔或病毒轉化來轉化。這樣的技術是本領域中公知的。本文中列出的用于各個植物物種的具體技術的使用也是公知的。技術方法可以容易地被技術采用以制備包含根據本發(fā)明的核酸序列的轉基因植物或其后代。

當用于制備本發(fā)明的該方面的轉基因植物時，核酸構建體通常置于適于在植物中表達核酸序列的“表達盒”內。表達盒將通常含有用于調節(jié)核酸在植物中的表達的核酸序列，例如啟動子區(qū)。

一些啟動子可以驅動核酸在植物中的組成型表達，包括公知的35S啟動子、19S啟動子或泛素啟動子。

其他啟動子可以用于調節(jié)核酸構建體的器官或組織特異性表達。"組織特異性啟動子"或"組織優(yōu)選啟動子"是指并不在所有植物細胞中表達，而僅在特定器官(如葉或種子)、特定組織(如胚或子葉)中的一種或多種細胞類型或特定細胞類型(如葉實質或種子儲存細胞)中表達的調節(jié)的啟動子。這些還包括時間調節(jié)的啟動子，如在早期或晚期胚發(fā)生中，發(fā)育中的種子或果實中果實成熟期間，完全分化的葉中，或在順序的開始。合適的啟動子包括來自油菜籽的napin-基因啟動子，來自蠶豆(Vicia faba)的USP-啟動子，來自擬南芥(Arabidopsis)的油質蛋白(oleosin)-啟動子，來自菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白(phaseolin)-啟動子，來自蕓苔(Brassica)的Bce4-啟動子或豆球蛋白(legumin)B4啟動子，以及在單子葉植物中賦予種子特異性表達的啟動子。

在光合作用組織中有活性從而驅動綠色組織如葉和莖中的轉錄的啟動子包括核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶(RbcS)啟動子如來自美洲落葉松(Larix laricina)的RbcS啟動子、松樹cab6啟動子、來自小麥的Cab-1基因啟動子、來自菠菜的CAB-1啟動子、來自水稻的cablR啟動子、來自玉米的丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)啟動子、擬南芥SUC2蔗糖-H+共輸送體啟動子。這樣的啟動子的代表性核酸序列可以容易地由本領域技術人員自例如GenBank鑒別。

適于植物根組織中優(yōu)先表達的啟動子包括例如源自玉米煙酰胺合成酶基因的啟動子和水稻RCC3啟動子。

適于優(yōu)先在植物脈管組織中表達的啟動子包括例如水稻蔗糖合成酶-1基因(RSs1)。

誘導型啟動子包括響應非生物和生物環(huán)境刺激的啟動子。非生物環(huán)境刺激包括光、溫度和水利用度。生物環(huán)境刺激包括病原體(包括病毒誘導的、細菌誘導的、真菌誘導的、昆蟲誘導的和線蟲誘導的啟動子)，與共生體和食草動物的相互作用。啟動子還可以響應于運動、接觸、組織損傷和植物激素(包括脫落酸、細胞分裂素、茁長素、赤霉素、乙烯、油菜素甾醇和肽如系統(tǒng)素(systemin)和結瘤因子(nodulation factor))。時間調節(jié)的啟動子包括晝夜節(jié)律調節(jié)的啟動子以及相應于非節(jié)律時間保持機制的那些。

如果希望基因表達以時間特異的方式發(fā)生，化學誘導的啟動子是特別合適的。這樣的啟動子的實例是水楊酸誘導型啟動子、四環(huán)素誘導型啟動子和乙醇誘導型啟動子(WO 93/21334)。

為了在植物中獲得改善的表達，可以根據技術改變核酸構建體的密碼子使用以形成相當的、改進的或人工的基因或基因部分，從而增加毒素蛋白在植物細胞中的表達效率。此外還可以將核酸插入植物的質體(例如葉綠體)或線粒體基因組中，并使用合適的啟動子在那里表達。為了在單子葉植物如玉米或水稻中獲得增強的表達，可以將內含子(例如單子葉內含子)添加于嵌合基因。

可以優(yōu)選的是，本發(fā)明的(和適于用于本發(fā)明的方法的)嵌合核酸還包含用于產物表達的核酸序列，其可以有助于鑒別其中成功地結合有所述嵌合核酸序列的植物細胞?？梢砸源朔绞绞褂玫暮线m的進一步的核酸序列的實例對于本領域技術人員將是顯而易見的，并且包括產生賦予對可以用于選擇的物質(如抗生素)的抗性的產物的核酸或產生可以用作選擇基礎的可檢測產物(如顯色酶產物)的標志物。

本發(fā)明的進一步方面提供轉化有根據本發(fā)明的核酸構建體的植物。

本發(fā)明的進一步方面提供包含根據本發(fā)明的核酸構建體的植物種子。

本發(fā)明的進一步方面提供根據本發(fā)明的核酸構建體或根據本發(fā)明制備的毒素蛋白在制造殺蟲劑或轉基因植物細胞或植物中的用途。

本發(fā)明的進一步方面提供根據本發(fā)明第六方面的殺蟲劑(和本說明書中描述的其任意實施方案)消滅或削弱一種或多種有害生物的用途。

本發(fā)明的進一步方面提供基本上如本文說明書或序列中描述或附圖中顯示的核酸構建體、毒素蛋白、組合物、載體、宿主細胞、轉基因植物、或其制備方法或用途。

詳細描述

現在將參考以下非限制性實施例和附圖描述本發(fā)明，所述附圖顯示:

圖1：含有前區(qū)域的毒素的基因結構的示意圖

(A)含有前區(qū)域的毒素蛋白的基因結構的示意圖。(B)蜘蛛毒素Hv1a 的序列。加框的氨基酸序列對應于前區(qū)域。

圖2:重組Hv1a和pro-Hv1a毒素的表達和純化

(A)SDS-PAGE凝膠(20％丙烯酰胺)分析，其顯示從培養(yǎng)物上清純化重組的帶Strep標簽的Hv1a毒素。泳道1&2是GNA標準物(分別為0.5和0.25μg)并且泳道3&4是利用2.5mM脫硫生物素從Streptactin柱洗脫后的峰級分(10μl)。(B)重組pro-Hv1a的Tris-Tricine凝膠(15％丙烯酰胺)分析，泳道1&2是利用0.2M咪唑從鎳親和柱洗脫后的峰級分(10μl)。箭頭指示已經切除組氨酸標簽的預測為pro-Hv1a的主要蛋白產物。(C)使用抗-His抗體對(B)中樣品的蛋白質印跡分析。

圖3：純化的pro-Hv1a/GNA、Hv1a/GNA和MODHv1a/GNA的凍干的樣品的SDS-PAGE凝膠分析

純化的重組的含有Hv1a的融合蛋白的SDS-PAGE分析(17.5％丙烯酰胺凝膠)，用考馬斯藍進行針對總蛋白的凝膠染色。如下上樣：泳道1：pro-Hv1a/GNA；泳道2：Hv1a/GNA；泳道3：MODHv1a/GNA；泳道4-6：分別為1、2和4μg的GNA標準物；泳道7-9：12.5、25和50μg凍干的純化的pro-Hv1a/GNA(以使得能夠定量融合蛋白含量)。

圖4：重組pro-Hv1a、pro-Hv1a/GNA和Hv1a/GNA對甘藍夜蛾(Mamestra brassicae)的注射毒性

注射不同劑量的重組pro-Hv1a、pro-Hv1a/GNA或Hv1a/GNA后第3-5齡甘藍夜蛾幼蟲的存活百分數。(A)注射各種劑量的pro-Hva1后第5齡幼蟲的存活百分數。(B)注射各種劑量的pro-Hv1a/GNA(劑量A)或Hv1a/GNA(劑量B)后第3-4齡幼蟲的存活百分數。(C)注射各種劑量的pro-Hv1a/GNA(劑量A)和Hv1a/GNA(劑量B)后第5齡幼蟲的存活百分數。

圖5：重組pro-Hv1a、Hv1a/GNA、pro-Hv1a/GNA和GNA對甘藍夜蛾的攝取毒性

攝取單次2μl含有20μg純化的pro-Hv1a、Hv1a/GNA、pro-Hv1a/GNA或GNA的小滴后第3齡甘藍夜蛾幼蟲的存活百分數。對照幼蟲以不含有添加的蛋白的小滴喂食(每次處理n＝10)。

圖6：重組pro-Hv1a、pro-Hv1a/GNA、Hv1a/GNA或GNA對豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)和麥長管蚜(Sitobion avenae)的攝取毒性

在含有0.05–0.75mg/ml純化的重組pro-Hv1a、pro-Hv1a/GNA、Hv1a/GNA或GNA的人工飼料的情況下的(A)豌豆蚜(豌豆蚜蟲)和(B)麥長管蚜(麥蚜)的存活百分數。

圖7：重組pro-Hv1a/GNA和Hv1a/GNA對麥蛞蝓(Deroceras reticulatum)的注射毒性

被注射以100、50或25μg的Hv1a/GNA或pro-Hv1a/GNA的麥蛞蝓(200mg±40mg)的存活百分數。對于對照處理，n＝18；對于100μg劑量，n＝10；并且對于50和25μg劑量，n＝8。

圖8：重組PI1a和Ao1bPro-PI1a毒素的表達和純化

(A)在“普通”SDS-PAGE上分離的源自編碼成熟毒素序列的構建體的PI1a毒素；M表示標志物，PI1a的上樣是5和10μg。(B)用6M脲變性后在SDS-PAGE上分離的PI1a毒素(5μg)。(C)在SDS-PAGE上指定為Ao1b的源自含有前區(qū)域的構建體的重組PI1a毒素，Ao1bPro-PI1a的上樣是2.5μg。(D)使用抗-His抗體對純化的Ao1bPro-PI1a(25、50&100ng)的蛋白質印跡。

圖9：通過SDS-PAGE表征純化的重組PI1a/GNA融合蛋白

(A)PI1a/GNA融合蛋白(10μg)和GNA標準物(5μg)的SDS-PAGE分析。(B)使用PNGase F的PI1a/GNA融合蛋白的去糖基化(空心箭頭指示的條帶)，GNA標準物(5μg)。(C)Ao1bPro-PI1a/GNA(1、2和4μg)的SDS-PAGE分析，GNA標準物(5μg)。(D)Hv1aPro-PI1a/GNA(1、2和4μg)的SDS-PAGE分析，GNA標準物(1、2和4μg)。

圖10：重組PI1a和Ao1bPro-PI1a對甘藍夜蛾的注射毒性

(A)注射不同劑量的純化的重組PI1a后第5齡甘藍夜蛾幼蟲的存活百分數。(B)注射不同劑量的純化的重組PI1a(劑量A)或Ao1bPro-PI1a(劑量B)后第5齡甘藍夜蛾幼蟲的存活百分數。

圖11：重組PI1a/GNA、Ao1bPro-PI1a/GNA和Pro-HV1a-PI1a/GNA對甘藍夜蛾的注射毒性

注射不同劑量的純化的重組PI1a/GNA(A)、Ao1b-ProPI1a/GNA(B)或Pro-Hv1a-PI1a/GNA(C)后第5齡甘藍夜蛾幼蟲的存活百分數。每次處理n＝20。

圖12：重組PI1a/GNA、Ao1bPro-PI1a/GNA和Hv1aPro-PI1a/GNA對甘藍夜蛾的攝取毒性

攝取單次2μl含有20μg純化的PI1a/GNA(A)、Ao1bPro-PI1a/GNA(B)或Hv1aPro-PI1a/GNA(C)融合蛋白的小滴后第3齡甘藍夜蛾幼蟲的存活百分數。在所有情況中，對照是單獨的蔗糖(無添加的蛋白)；30μg的任一種PI1a毒素(成熟或修飾形式)或GNA。

縮寫

BB：結合緩沖液

ECL：增強的化學發(fā)光

HRP：辣根過氧化物酶

PBS：磷酸鹽緩沖鹽水

SDS-PAGE：十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳

YPG：酵母提取物蛋白胨甘油

材料和方法

重組Hv1a、pro-Hv1a和pro-Hv1a/GNA融合蛋白的克隆

使用一系列重疊的寡核苷酸組裝編碼成熟Hv1a氨基酸序列的合成的基因，針對在酵母中的表達優(yōu)化密碼子選擇(Fitches等人，2012)。為了產生編碼成熟Hv1a肽的表達構建體，編碼序列通過PCR使用具有PstI和SalI位點的引物擴增并按照制造商的方案中描述的使用QiaQuick凝膠提取試劑盒(Qiagen)從切下的凝膠條純化。將提取的DNA片段消化(PstI和SalI)并連接到同樣消化的酵母表達載體pGAPZαB(Invitrogen)中，所述載體在之前已被修飾成含有與酵母α-因子前體前序列(pre-pro-sequence)同框的5’Strep標簽。將得到的質粒轉化入電感受態(tài)大腸桿菌細胞并且通過凝膠電泳和DNA測序檢查選擇的克隆的構建體的正確組裝。

將pro-Hv1a編碼序列通過PCR使用具有PstI和XbaI位點的引物(正向：TACTGCAGCAGAAGATACTAGAGCT和反向：ATTCTAGAATCACATCTCTTAAC)擴增。將凝膠提取的產物用PstI和XbaI消化并連接到同樣消化的酵母表達載體pGAPZαB中。將得到的重組質粒轉化入大腸桿菌細胞并且通過凝膠電泳和DNA測序檢查選擇的克隆的構建體的正確組裝。

為了產生pro-Hv1a/GNA構建體，將pro-Hv1a編碼序列通過PCR使用具有PstI和NotI位點的引物(正向：TACTGCAGCAGAAGATACTAGAGCT和反向：ATGCGGCCGC ATCACATCTCTTAAC)擴增并如上所述通過凝膠電泳純化。用PstI和NotI限制性酶切后，將PCR產物連接入之前產生的用相同酶消化的含有成熟GNA編碼序列的pGAPZαB質粒中。含有編碼pro-Hv1a/GNA融合蛋白的表達載體的選擇的克隆通過DNA測序驗證。

Hv1a構建體的序列顯示如下：

天然Hv1a：SPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD

重組Hv1a(α因子信號序列，Hv1a毒素，Strep標簽綠色突出顯示區(qū)域，無前區(qū)域，無載體)：

MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAAWSHPQFEKGLQSPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD

重組pro-Hv1a(α因子信號序列，Hv1a毒素，前區(qū)域，無載體，(His)₆標簽)：

MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAAAEDTRADLQGGEAAEKVFRRSPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCDALEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH

重組Hv1a/GNA(α因子信號序列，Hv1a毒素，無前區(qū)域，載體)：

MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAAASPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCDAAADNILYSGETLSTGEFLNYGSFVFIMQEDCNLVLYDVDKPIWATNTGGLSRSCFLSMQTDGNLVVYNPSNKPIWASNTGGQNGNYVCILQKDRNVVIYGTDRWATGVD

重組pro-Hv1a/GNA(α因子信號序列，Hv1a毒素，前區(qū)域，載體，(His)₆標簽)：

MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAAAEDTRADLQGGEAAEKVFRRSPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCDAAADNILYSGETLSTGEFLNYGSFVFIMQEDCNLVLYDVDKPIWATNTGGLSRSCFLSMQTDGNLVVYNPSNKPIWASNTGGQNGNYVCILQKDRNVVIYGTDRWATGVDHHHHHH

重組PI1a和PI1a/GNA融合蛋白的克隆

結合編碼成熟PI1a毒素(P83256)的序列的雙鏈DNA(針對酵母優(yōu)化密碼子選擇)由本發(fā)明人設計并由ShineGene Molecular Biotech，Inc.(Shanghai 201109，China；http：//www.synthesisgene.com/)合成和提供在載體pUC57中。其他寡核苷酸由Sigma Chemical Co提供。

通過用PstI和XbaI消化，通過瓊脂糖凝膠電泳分離編碼序列片段，接著連接于用相同酶消化的pGAPZαB，來將Pl1a編碼序列從pUC57轉移到酵母表達載體pGAPZαB(Invitrogen)。使用QiaQuick凝膠提取試劑盒(Qiagen)從切下的凝膠條純化DNA片段。使用標準方案通過轉化電感受態(tài)大腸桿菌細胞將得到的重組質粒克隆。通過DNA測序檢查選擇的克隆的構建體的正確組裝。為了產生修飾的構建體以表達Pl1a，將編碼來自U3-agatoxin-Ao1b(Q5Y4V7)的前區(qū)域的兩條互補的合成的寡核苷酸組裝并插入Pl1a表達構建體的PstI位點。構建體(ProAo1b-PI1a)的正確組裝通過DNA測序檢查。

為了產生編碼Pl1a/GNA融合蛋白的構建體，將來自pGAPZαB中驗證的表達構建體的成熟PI1a編碼序列通過用PstI和NotI消化切下并通過瓊脂糖凝膠電泳純化。將含有融合蛋白構建體Hv1a/GNA的pGAPZαB質粒(Fitches等人，2012)用PstI和NotI消化以去除Hv1a編碼序列并通過瓊脂糖凝膠電泳純化。隨后通過連接純化的片段并克隆得到的重組質粒，將Hv1a編碼區(qū)用Pl1a替代。為了產生含有來自U3-agatoxin-Ao1b的前區(qū)域的Pl1a/GNA的修飾的表達構建體，如上所述修飾Pl1a/GNA表達構建體；此外，還將來自pro-Hv1a毒素的前區(qū)域用于被稱為Pro-Hv1a-PI1a的另一個構建體。通過DNA測序驗證含有編碼PI1a/GNA融合蛋白的表達載體的選擇的克隆。所有DNA測序使用Applied Biosystems ABI Prism 3730自動DNA測序儀，由DBS Genomics，School of Biological and Biomedical Sciences，Durham Universitv，UK進行。

PI1a構建體的序列如下所示：

天然PI1a：GCLGEGEKCADWSGPSCCDGFYCSCRSMPYCRCRNNS

重組PI1a(α因子信號序列，PI1a毒素，無前區(qū)域，無載體，(His)₆標簽)：

MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAAAGCLGEGEKCADWSGPSCCDGFYCSCRSMPYCRCRNNSALEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH

重組Ao1bPro-PI1a(α因子信號序列，前區(qū)域[Ao1b]，PI1a毒素，無載體，+(His)₆標簽)：

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重組PI1a/GNA(α因子信號序列，PI1a毒素，無前區(qū)域，載體，(His)₆標簽)：

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重組Ao1bPro-PI1a/GNA(α因子信號序列，前區(qū)域[Ao1b]，PI1a毒素，載體，(His)₆標簽)：

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重組Hv1aPro-PI1a/GNA(α因子信號序列，前區(qū)域[Hv1a]，PI1a毒素，載體，(His)₆標簽)：

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Hv1a、pro-Hv1a、Hv1a/GNA和pro-Hv1a/GNA融合蛋白在酵母中的表達

將含有Hv1a、pro-Hv1a、Hv1a/GNA和pro-Hv1a/GNA序列的pGAPZαB質粒在大腸桿菌中擴增，純化并用BlnI(Takara)線性化。將線性化的質粒使用EasyComp轉化試劑盒(Invitrogen)如制造商的方案中所述轉化入巴斯德畢赤酵母株SMD1168H(Invitrogen)。在含有博萊霉素(100mg/ml)的YPG瓊脂板(1％酵母提取物(w/v)，2％蛋白胨(w/v)，4％甘油(v/v)，1.5％瓊脂(w/v))上選擇轉化的酵母克隆。通過分析來自在YPG-博萊霉素培養(yǎng)基中在30℃生長2-3天的小規(guī)模搖瓶培養(yǎng)物(10ml)的培養(yǎng)物上清檢查選擇的克隆的表達。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離上清樣品；將凝膠印跡在硝酸纖維素上并用抗-(His)₆一抗(BioRad)或抗-Strep抗體探測，或對于Hv1a/GNA和pro-Hv1a/GNA印跡，用抗-GNA一抗探測，接著洗滌，用HRP-綴合的二抗(BioRad)探測，并通過ECL檢測結合的抗體，如前所述(Fitches等人，2001；2012)。

為了蛋白生產，選擇的含有整合的Hv1a、pro-Hv1a、Hv1a/GNA和pro-Hv1a/GNA表達盒的巴斯德畢赤酵母克隆在7.5L BioFlo 110臺式發(fā)酵罐(New Brunswick Scientific)或5L Bio-Controlly ADI1010臺式發(fā)酵罐(APPLIKON BIOTECHNOLOGY，Holland)中生長。將轉化的巴斯德畢赤酵母的YPG培養(yǎng)物(200ml)在30℃震蕩培養(yǎng)2-3天(無博萊霉素抗生素)，之后接種2.5L補充有PTM1鹽的無菌最小培養(yǎng)基。用4天時間，在增加的甘油進料(5-10ml/h；總共1.25l)的情況下，進行在30℃，30％溶解氧，pH 4.5-5.0，在連續(xù)攪拌下的培養(yǎng)。隨后通過離心(20min，8000rpm；4℃)將培養(yǎng)物上清與細胞分離，經2.7μM和0.7μM玻璃纖維濾器(GFD和GFF；Whatmann)過濾來澄清。僅對于Hv1a，通過加入4x濃縮儲液將上清調節(jié)至含有0.3M氯化鈉，pH 8.0的50mM磷酸鹽緩沖液。在streptactin柱(1 ml)上，以0.5ml/min的流速純化重組Hv1a。在含有0.3M氯化鈉的pH 8.0的50mM磷酸鹽緩沖液中平衡柱。使用2.5mM脫硫生物素(在磷酸鹽緩沖液中；pH 8.0)從柱上洗脫帶Strep標簽的Hv1a。對于所有其他蛋白，通過加入4x濃縮儲液(4X結合緩沖液[BB])將上清調節(jié)至0.02M磷酸鈉緩沖液，0.4M氯化鈉，pH 7.4。通過鎳親和層析在5ml HisTrap粗制鎳柱(GE Healthcare)上以2ml/min的流速純化重組pro-Hv1a Hv1a/GNA和pro-Hv1a/GNA。上樣后，將柱用1xBB(50mM磷酸鈉；0.4M氯化鈉)洗滌并隨后用含有0.025M咪唑的BB洗滌，并且最后用含有0.2M咪唑的BB將結合的重組蛋白洗脫。在所有情況下，之后通過SDS-PAGE檢查洗脫的蛋白的純度，使用多次改變對去離子水進行透析以去除所有小分子，并冷凍干燥。通過與SDS-PAGE凝膠上運行的GNA標準物的已知量相比或通過使用BCA^TM蛋白測定試劑盒(Thermo Scientific)的BCA分析評估重組蛋白的濃度。

PI1a和PI1a/GNA融合蛋白在酵母中的表達

將含有PI1a和PI1a/GNA表達構建體的pGAPZαB質粒在大腸桿菌中擴增，純化并用BlnI線性化。使用EasyComp轉化試劑盒(Invitrogen)如制造商的方案中所述將線性化的質粒轉化入巴斯德畢赤酵母株SMD1168H(Invitrogen)。將轉化的酵母克隆在含有博萊霉素(100mg/ml)的YPG瓊脂板(1％酵母提取物(w/v)，2％蛋白胨(w/v)，4％甘油(v/v)，1.5％瓊脂(w/v))上鋪板并選擇。通過分析來自在YPG–博萊霉素培養(yǎng)基中在30℃培養(yǎng)2-3天的小規(guī)模搖瓶培養(yǎng)物的培養(yǎng)物上清檢查選擇的克隆(對于每種構建體至少10個)的重組蛋白表達。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離上清樣品；將凝膠印跡在硝酸纖維素上，并用抗-(His)₆一抗(BioRad)或抗-GNA一抗探測，接著洗滌，用HRP-綴合的二抗(BioRad)探測，并通過ECL檢測結合的抗體。

將選擇的含有整合的PI1a和PI1a/GNA構建體的巴斯德畢赤酵母的克隆在5L Bio-Controlly ADI1010臺式發(fā)酵罐(Applikon Biotechnology，Holland)中培養(yǎng)。對于發(fā)酵，將兩個含有毒素或融合基因的巴斯德畢赤酵母的100ml YPG培養(yǎng)物在30℃在振蕩下培養(yǎng)2–3天，之后將其用于接種2.5L補充有PTM1鹽的無菌最小培養(yǎng)基。用4天時間，在增加的甘油進料(5–10ml/h)的情況下，進行在30℃，30％溶解氧，pH 4.5-5.0的在連續(xù)攪拌下的培養(yǎng)。通過離心(20min，5000g)將培養(yǎng)物上清與細胞分離，并通過加入5x濃縮儲液調節(jié)至0.02M磷酸鈉緩沖液，0.4M氯化鈉，pH 7.4。將重組蛋白通過鎳親和層析在5ml HisTrap粗制鎳柱(GE Healthcare)上，以2ml/min的流速純化。上樣后，將柱用0.02M磷酸鈉緩沖液，0.4M氯化鈉pH 7.4洗滌并將結合的蛋白用在相同緩沖液中的0.2M咪唑洗脫。通過SDS-PAGE檢查洗脫的蛋白的純度，使用多次改變對去離子水進行透析以去除所有小分子，并冷凍干燥。通過與SDS-PAGE凝膠上運行的GNA標準物的已知量相比或通過使用BCA^TM蛋白測定試劑盒(Thermo Scientific)的BCA分析評估重組蛋白的濃度。

昆蟲生物測定

將第3-5齡甘藍夜蛾幼蟲(重約30-55mg)用于注射生物測定。給幼蟲注射在5μl PBS(磷酸緩沖鹽水；0.15M NaCl，0.015M磷酸鈉緩沖液，pH7.2)中的不同劑量的Hv1a、pro-Hv1a、pro-Hv1a/GNA、Pl1a、Ao1bProPl1a、Pl1a/GNA、Ao1bPro-Pl1a/GNA或Hv1aPro-Pl1a/GNA(每個劑量n＝20)。給對照幼蟲注射5μl 1×PBS。注射后12-96h記錄癱瘓和死亡率。

進行小滴-喂食測定以評價Hv1a/GNA、pro-Hv1a/GNA、Pl1a、Ao1bProPl1a、Pl1a/GNA、Ao1bPro-Pl1a/GNA或Hv1aPro-Pl1a/GNA對甘藍夜蛾的第三至第五齡幼蟲的口服活性。將幼蟲饑餓大約24h，之后喂食以促進小滴消耗。用2μl含有在含有10％蔗糖(w/w)的1x PBS溶液中的20μg上述融合蛋白，30μg毒素或30μg GNA的小滴喂食幼蟲。用不含有添加蛋白的PBS/蔗糖小滴喂食對照幼蟲。消耗小滴后，將處理的幼蟲置于標準人工飼料上。

Hv1a/GNA和pro-Hv1a/GNA對豌豆蚜(豌豆蚜蟲)和麥長管蚜(麥蚜)的殺昆蟲效應通過喂食100μl含有已知濃度的融合蛋白的液體人工飼料(Prosser和Douglas，1992)，使用雙parafilm小袋(飼料小滴在中間)將飼料遞送至昆蟲來評價。所述實驗使用1-2日齡蚜蟲并且每日評價存活達六天。

注射生物測定：麥蛞蝓(軟體動物麥蛞蝓)

通過注射到成體蛞蝓(0.2–0.3g)中測試Hv1a/GNA和pro-Hv1a/GNA對成體蛞蝓(麥蛞蝓)的活性。將蛞蝓在4℃冰冷(達約15分鐘)，之后注射重懸在20μl PBS中的25μg、50μg或100μg的純化的融合蛋白。每日評價死亡率達7天。

統(tǒng)計分析

使用Kaplan–Meier存活分析，使用Prism(v5)軟件分析存活數據。所有其他數據分析使用Origin 8.5制圖和數據分析軟件進行。進行ANOVA分析(利用Bonferroni-Dunn事后檢驗)以確定處理之間在測量的參數方面的任何顯著差異。

結果

本發(fā)明人進行實驗以研究在用于毒素的表達構建體中包含前區(qū)域對所述毒素的生物活性的影響。

研究Hv1a的毒性的實驗

引言

為了研究包含前區(qū)域對重組毒素的毒性的影響，使用ω-Hexatoxin-Hv1a。ω-Hexatoxin-Hv1a是分離自藍山漏斗網蜘蛛(Hadroncyhe versuta)的毒素。ω-Hexatoxin-Hv1a(或ω-ACTX-Hv1a)是鈣通道拮抗劑，并且之前證明ω-ACTX-Hv1a可以阻斷無脊椎動物鈣通道但不阻斷脊椎動物鈣通道。

盡管已經表明，在局部用于毛蟲時，ω-ACTX-Hv1a本身可以用作殺蟲劑(Khan等人，2006)，但是沒有單獨的該肽的殺昆蟲活性的進一步證據。在專利申請PCT/GB2012/000287中，本發(fā)明人表明巴斯德畢赤酵母中表達的重組毒素(ω-ACTX-Hv1a)的毒性可以通過將該蛋白與植物凝集素GNA融合表達來增強，之前證明所述植物凝集素GNA跨消化道上皮并將‘乘客(passenger)’肽從無脊椎動物的消化道遞送至循環(huán)系統(tǒng)。

為了進一步研究體外表達的毒素的效力可能怎樣改善，本發(fā)明人分析了編碼節(jié)肢動物毒素的基因的DNA序列。用于PCT/GB2012/000287的節(jié)肢動物毒素是小的，富含半胱氨酸的蛋白，其屬于多個蛋白序列超家族(其包括來自除節(jié)肢動物之外的生物的毒素)。編碼基因包括兩條最終蛋白產物中不存在的序列；在翻譯期間去除的預測的N-端信號肽和信號肽和分離的蛋白最終序列之間的預測的前區(qū)域(參見圖1A)。

本發(fā)明人研究在表達構建體中包含前區(qū)域對重組蛋白的整體毒性的影響。

在第一個例子中，使用ω-ACTX-Hv1a，因為該毒素在其基因序列中含有預測的前區(qū)域(參見圖1B)。

重組Hv1a、pro-Hv1a、Hv1a/GNA和pro-Hv1a/GNA的合成基因構建體、表達和純化

基于載體pGAPZαB合成重組Hv1a、pro-Hv1a、Hv1a/GNA和pro-Hv1a/GNA融合蛋白構建體，所述載體pGAPZαB具有強的組成型啟動子(GAPDH)以指導靶基因表達。pGAPZ載體是表達宿主巴斯德畢赤酵母中的整合載體并且選擇的轉化子含有整合入宿主基因組的表達構建體。用于表達重組Hv1a和pro-Hv1a的構建體含有對應于毒素的公開序列的預測的氨基酸序列。對于Hv1a，將成熟肽克隆在酵母α-因子前體前序列和編碼Strep標簽的8個氨基酸(即經3氨基酸接頭‘GLQ’連接于成熟Hv1a序列的N-末端的WSHPQFEK)的框內。對于Pro-Hv1a，N-端前區(qū)域排列在編碼酵母α-因子前體前序列的序列的C-端框內，并且構建體還含有編碼myc表位和(His)₆標簽的序列(由載體提供，在預測的產物的C-末端)。對于Hv1a/GNA，將成熟毒素序列經3氨基酸(AAA)接頭肽融合于對應于成熟雪花蓮凝集素(GNA)的殘基1–105的編碼序列的N-末端。對于pro-Hv1a/GNA，將合成的pro-Hv1a編碼序列經3氨基酸(AAA)接頭肽融合至對應于成熟雪花蓮凝集素(GNA)的殘基1–105的編碼序列的N-末端。兩種融合蛋白構建體也均排列在酵母α-因子前體前序列，和編碼(His)₆標簽的序列(由載體提供)的C-末端的框內。通過核酸內切酶消化的DNA的連接組裝構建體并在克隆后通過DNA測序檢查。

將序列驗證的克隆(含有重組Hv1a、pro-Hv1a、Hv1a/GNA或pro-Hv1a/GNA)轉化入巴斯德畢赤酵母蛋白酶缺陷株SMD1168H，并使用抗生素博萊霉素選擇。將選擇的克隆在在30℃搖瓶培養(yǎng)中生長3-4天并使用蛋白質印跡分析培養(yǎng)物上清中重組蛋白的表達。這使得高表達克隆能夠被選擇用于通過臺式發(fā)酵生產。分析的轉化的酵母克隆中的大多數顯示蛋白表達的證據，如由在蛋白質印跡上具有預期大小的免疫反應性條帶的存在判斷的(結果未示)。

選擇的克隆的發(fā)酵在控制的環(huán)境條件下在生物反應器中進行。使用引導表達蛋白分泌出細胞并進入生長培養(yǎng)基中的pGAPα因子分泌信號，使得能夠隨后從發(fā)酵的培養(yǎng)物上清純化重組蛋白。通過離心獲得上清，通過過濾澄清，并隨后將重組蛋白通過親和層析(對于Hv1a用Streptactin，并且對于pro-Hv1a和pro-Hv1a/GNA用鎳親和)純化。含有目標蛋白的洗脫峰通過透析脫鹽并凍干。對于重組蛋白的產量，以大約5-10mg/L培養(yǎng)物上清產生Hv1a；以大約40mg/L產生pro-Hv1a，如通過BCA定量估計的，并且以大約40mg/L產生Hv1a/GNA，和以大約21mg/L產生pro-Hv1a/GNA，如通過半定量SDS-PAGE估計的。

如圖2A(泳道3和4)中所示，在SDS-PAGE凝膠分離為大約6.5kDa的單個蛋白的帶5’Strep標簽的成熟純化的Hv1a，與5.47kDa的預測的分子量相當(未將凝膠優(yōu)化以用于分離小分子量蛋白)。使用Tris-Tricine SDS-PAGE凝膠分離純化的重組pro-Hv1a并且通過對總蛋白染色和使用抗-His抗體的蛋白質印跡來分析(圖2B&C)。在Tris-Tricine凝膠上，重組毒素pro-Hv1a產生在大約4kDa的主蛋白條帶和進一步的在分子量范圍6-16kDa內的較弱條帶。大約4kDa的顯著條帶不與抗-(His)₆抗體免疫反應(圖2C)，并且分子量與切割C-端標簽區(qū)域后的預測的分子量(4.06kDa)一致。不帶His標簽的蛋白連同帶His標簽的蛋白從鎳親和柱的拉下(Pull down)之前對于從畢赤酵母上清回收的其他重組蛋白已經觀察到。顯示與抗-(His)₆抗體的陽性免疫反應性的10kDa蛋白對應于包括前區(qū)域的重組Hv1a的預測的分子量(9kDa)，提示在酵母細胞的加工期間前區(qū)域的切割不完全?？紤]到含有C-端His域但無前區(qū)域的Hv1a預測的分子量是6.74kDa，也與抗-(His)₆抗體免疫反應的14kDa條帶可能代表Hv1a的二聚形式。

在SDS-PAGE凝膠上分析純化的pro-Hv1a/GNA、Hv1a/GNA和MODHv1a/GNA的凍干的樣品(圖3)。所有融合蛋白都觀察到大約19kDa和14kDa的兩個條帶。Hv1a/GNA的預測分子量是16.27kDa，而沒有前區(qū)域但含有(His)₆標簽的pro-Hv1a/GNA的預測分子量是16.95，均稍小于觀察到的19kDa條帶。然而，pro-Hv1a/GNA和Hv1a/GNA在SDS-PAGE凝膠上的相同分離提示，前區(qū)域在巴斯德畢赤酵母細胞的加工期間已從pro-Hv1a/GNA切割。完整MODHv1a/GNA的預測分子量是17.09kDa，并且相應地，與Hv1a/GNA和pro-Hv1a/GNA相比，由于存在在Hv1a/GNA中不存在的另外的組氨酸標簽，該蛋白作為稍大的蛋白跑膠。在所有情況下，較小的14kDa條帶都與GNA抗體免疫反應(結果未示)并且在大小上對應于已經切去Hv1a毒素的GNA。如之前對于Hv1a/GNA所觀察到的(Fitches等人，2012)，完整pro-Hv1a/GNA融合蛋白與切割的GNA的比例評估為約1:1，如通過對SDS-PAGE凝膠的考馬斯藍染色判斷的，而MODHv1a/GNA中Hv1a序列的修飾導致完整融合蛋白的較高回收(完整:切割比2:1)。Hv1a/GNA融合蛋白的定量是基于與已知濃度的GNA標準物相比的條帶強度，如圖3中所示。

重組Hv1a、pro-Hv1a、Hv1a/GNA和pro-Hv1a/GNA融合蛋白對菜蛾(甘藍夜蛾)幼蟲的注射毒性

以多至100μg的重組毒素的劑量注射Hv1a不導致任何幼蟲死亡，存活與對照相當(n＝40；存活>90％)。這表明，沒有N-端前區(qū)域的成熟Hv1a肽的表達導致無生物活性的毒素的產生，提示在由酵母細胞合成期間毒素未正確加工和/或折疊。相反，用pro-Hv1a、Hv1a/GNA、MODHv1a/GNA或pro-Hv1a/GNA注射新羽化的第3-4(～30-40mg)和第5齡(～45-55mg)甘藍夜蛾幼蟲導致顯著的幼蟲死亡率。

如圖4A中所示，重組pro-Hv1a在注射到第5齡幼蟲后的效應是劑量依賴性的。10μg和20μg pro-Hv1a/昆蟲的注射劑量導致注射后24小時完全死亡，并且注射5μg/昆蟲導致注射后24小時80％死亡。在1.25μg/昆蟲的最低劑量，所有昆蟲顯示無力的癱瘓和暫時的不進食，盡管一些癱瘓的昆蟲在注射后2-3小時恢復并能夠繼續(xù)進食。從這些測定，估計的重組pro-Hv1a的LD₅₀(致死劑量；48小時)是25μg/g昆蟲。如表1中總結的，這比之前公布的在大腸桿菌中產生的重組Hv1a毒素的LD₅₀(其LD₅₀(72小時)是～69μg/g昆蟲)低約3倍。

如圖4B&C中所示，與Hv1a/GNA相比，用pro-Hv1a/GNA注射第3-4和第5齡甘藍夜蛾幼蟲顯示增加的毒性。例如，與注射相同劑量的pro-Hv1a/GNA后24小時記錄的100％死亡相比，向第5齡幼蟲注射10μg Hv1a/GNA導致72小時后50％死亡。在2.5μg/昆蟲的pro-Hv1a/GNA劑量觀察到顯著的幼蟲死亡率(75％)，而注射5或10μg Hv1a/GNA不導致第5 齡幼蟲任何顯著的死亡水平。在注射較小的第3-4齡幼蟲后觀察到相似的結果(圖4B)。如表1中所示，與Hv1a/GNA的55μg/g昆蟲的LD₅₀相比，估計的pro-Hv1a/GNA的LD₅₀值低約10倍(4.6μg/g昆蟲)。這表明，與源自編碼融合于GNA的成熟毒素序列的構建體的蛋白相比，將前區(qū)域添加至Hv1a/GNA構建體導致顯著更具毒性的融合蛋白的產生。更出人意料地，計算的pro-Hv1a/GNA的4.6μg/g昆蟲的LD₅₀值比估計的pro-Hv1a的25μg/g昆蟲低約5倍。這表明，pro-Hv1a與GNA的連接得到具有比單獨的pro-Hv1a或沒有前區(qū)域的Hv1a/GNA高的生物活性的蛋白。計算的pro-Hv1a/GNA的4.6μg/g昆蟲的LD₅₀值也比天然Hv1a的文獻值低超過2倍(與重組Hv1a相對；參見表1)。該文獻值代表在實夜蛾(Heliothis)(與甘藍夜蛾相同的昆蟲目中的物種)的LD₅₀值。我們猜測，將GNA與pro-Hv1a融合進一步作用以促進巴斯德畢赤酵母細胞對Hv1a毒素的正確加工和折疊，允許要獲得的生物活性的進一步增加。以多至40μg/昆蟲單獨注射GNA不導致甘藍夜蛾幼蟲的死亡。

表1：在利用甘藍夜蛾幼蟲的注射生物測定中重組毒素和融合蛋白的毒性

*未獲得甘藍夜蛾的數據

重組Hv1a、pro-Hv1a和pro-Hv1a/GNA融合蛋白對菜蛾(甘藍夜蛾)幼蟲的攝取毒性

通過將2μl含有20μg融合蛋白的小滴飼喂給羽化的第三齡甘藍夜蛾幼蟲評估proHv1a/GNA和Hv1a/GNA的口服活性。除了未添加蛋白的對照組以外，對照處理是20μg的GNA或pro-Hv1a之一。如圖5和表2中所示，僅用pro-Hv1a/GNA飼喂的幼蟲觀察到顯著的效應，在攝取一滴融合蛋白后5天記錄到90％死亡率。相反，對于Hv1a/GNA融合蛋白，死亡率僅為30％，僅稍高于對于分別用GNA和pro-Hv1a處理觀察到的20％和15％死亡率。在發(fā)現在4天時間內20μg pro-Hv1a/GNA融合蛋白的單一劑量導致第五齡幼蟲30％死亡率的測定中觀察到類似的結果，而對于用20μg的Hv1a/GNA或pro-Hv1a飼喂的幼蟲未觀察到死亡(結果未示)。

表2：利用甘藍夜蛾幼蟲的口服喂食測定中重組毒素和融合蛋白的毒性

重組Hv1a、pro-Hv1a和pro-Hv1a/GNA融合蛋白對豌豆蚜(A.pisum)和麥蚜(Sitobion avenae)的攝取毒性

通過以0.125mg–0.75mg/ml(125-750ppm)的濃度結合入人工飼料中來檢測重組pro-Hv1a蛋白、pro-Hv1a/GNA和Hv1a/GNA針對豌豆蚜和麥蚜的口服活性。如對于鱗翅目幼蟲所觀察的，發(fā)現純化的pro-Hv1a/GNA比Hv1a/GNA對兩種蚜蟲物種都顯著更具毒性(圖6A&B)。750ppm的Pro-Hv1a/GNA在3天后引起豌豆蚜蟲100％死亡，而相同劑量的Hv1a/GNA在喂食8天后僅導致50％死亡。在500ppm的較低劑量，與Hv1a/GNA的20％的死亡率相比，以pro-Hv1a/GNA喂食的豌豆蚜蟲在喂食8天后的死亡率是100％。

還發(fā)現Pro-Hv1a/GNA比Hv1a/GNA對麥蚜顯著的更具毒性。如圖6B中所示，與對于Hv1a/GNA喂食的蚜蟲60％的死亡率相比，用含有250ppm pro-Hv1a/GNA的飼料喂食7天的麥蚜記錄到100％死亡率。麥蚜似乎比豌豆蚜蟲對pro-Hv1a/GNA更易感，因為在低至125ppm pro-Hv1a/GNA的水平觀察到顯著的死亡率水平(2天喂食后80％死亡)，而對于以相同劑量的融合蛋白喂食的豌豆蚜蟲未記錄到死亡。

重組MODHv1a和Pro-Hv1a/GNA融合蛋白對麥蛞蝓(Deroceras reticulatum)的注射毒性

通過注射入成體蛞蝓(～0.2g)檢測MODHv1a/GNA和Pro-Hv1a/GNA對于蛞蝓(D.reticulatum)的活性。MODHv1a/GNA對應于修飾形式的Hv1a/GNA，其中Hv1a C-末端的單個氨基酸改變已經顯示改善完整融合蛋白的表達，但具有與Hv1a/GNA相當的毒性。將蛞蝓在4℃冷卻(～15分鐘)，之后注射重懸在20μl PBS中的25、50或100μg的純化的Hv1a/GNA。每日評估死亡率達7天。圖7顯示對于兩種處理觀察到的劑量依賴性的死亡率。對于所有注射劑量，與MODHv1a/GNA相比，對于pro-Hv1a/GNA的死亡率顯著更高(P<0.05；Mantel Cox檢驗)。例如，與注射50μg MODHv1a/GNA后5天觀察到的10％死亡率相比，注射50μg pro-Hv1a/GNA后3天記錄到100％死亡率。

研究PI1a的毒性的實驗

引文

對于Hva1/GNA融合蛋白獲得的結果通過選取其基因序列不包括預測的前區(qū)域的毒素蛋白并基于全球蛋白數據庫中的相似序列將前區(qū)域結合入表達構建體中來延伸。使用來自蜘蛛陰暗擬隙蛛的毒素δ-amaurobitoxin-PI1a。

重組PI1a和PI1a/GNA的表達和純化

用于在巴斯德畢赤酵母中生產重組蛋白的表達構建體基于載體pGAPZαB，其含有用于引導重組蛋白表達的強組成型啟動子，并且其被設計為在GAPDH基因座整合入宿主基因組，得到穩(wěn)定的轉化子。用于生產重組Pl1a的表達構建體含有對應于被稱為PI1a的毒素的公布的氨基酸序列的合成的編碼序列，其排列在編碼酵母α-因子前體前序列的序列的C-端框內。含有毒素前區(qū)域的構建體在酵母α-因子前體前序列和Pl1a毒素序列之間插入這些。使用的前區(qū)域取自來自蜘蛛Agelena orientalis的被稱為Ao1bPro-PI1a的密切相關的毒素U3-agatoxin-Ao1b(Pl1a未獲得包括前區(qū)域的cDNA序列)，和取自被稱為Hv1aPro-PI1a的如之前描述的Hv1a atracotoxin的前區(qū)域。表達構建體還含有編碼myc表位(His)₆標簽(由載體提供)的C-端序列。

對于重組PI1a/GNA融合蛋白的生產，產生三種表達構建體，并且所有都含有經3氨基酸接頭肽與對應于成熟雪花蓮凝集素(GNA)的殘基1–105的編碼序列的N-末端融合的成熟PI1a編碼序列；同樣，融合蛋白框內排列在α-因子前體前序列的C-端和編碼(His)₆標簽的序列(由載體提供)的N-端。修飾的融合蛋白構建體還含有如上所述的Ao1b和Hv1a的前區(qū)域，其被插入在酵母α-因子前體前序列和Pl1a的成熟編碼序列之間；它們稱為Ao1bPro-Pl1a/GNA和Hv1aPro-Pl1a/GNA。通過限制性酶切-連接組裝構建體并在克隆后通過DNA測序檢查。

將驗證的表達構建體的克隆轉化入蛋白酶-缺陷巴斯德畢赤酵母株SMD1168H，使用抗生素(博萊霉素)選擇轉化子。對于每種表達構建體獲得大約50個抗性克隆。通過蛋白質印跡對搖瓶培養(yǎng)中生長的選擇的克隆的培養(yǎng)物上清分析重組蛋白的生產，從而允許選擇產生最高水平的PI1a和PI1a/GNA融合蛋白的克隆。不需要篩選大量轉化的酵母克隆，因為大多數克隆表達重組蛋白，如通過培養(yǎng)物上清的蛋白質印跡上預期大小的免疫反應條帶的存在判斷的(結果未示)。

對于各個構建體，選擇小規(guī)模培養(yǎng)物中篩選的那些的表達最好的克隆用于通過平臺發(fā)酵的大規(guī)模蛋白生產。通過鎳親和層析純化培養(yǎng)物上清并且將洗脫峰通過透析脫鹽并凍干。在優(yōu)化前，重組蛋白的產率與其他融合蛋白相當；產生大約26mg/L Pl1a，大約32mg/L Ao1bPro-PI1a，大約21mg/L PI1a/GNA，大約32mg/L Ao1bPro-PI1a/GNA和大約13mg/L Hv1aPro-PI1a，如通過半定量分析的估計。

通過SDS-PAGE和蛋白質印跡分析純化的重組PI1a毒素(圖8)。在SDS-PAGE凝膠上，由沒有添加的前區(qū)域的構建體產生的重組毒素Pl1a跑膠為在大約18kDa的指定分子量處緊密靠近的兩個條帶(圖8A)；兩個條帶都與抗-(His)₆抗體免疫反應。重組Pl1a(包括標簽序列)的預測的分子量是6.87kDa。在凝膠、樣品和電泳前使用的還原劑不同的情況下，毒素的雙條帶可重復，但被認為是凝膠系統(tǒng)的假象，可能是由于SDS對多肽的差的結合的結果。當相同樣品用6M脲預處理時，Pl1a在14kDa的指定分子量處形成單一條帶(圖8B)；移動性的改變表明凝膠假象，并且單一條帶表示產物的均勻性。含脲凝膠上的進一步分析得到Pl1a的單一條帶，在不封閉半胱氨酸殘基殘基的情況下為～11kDa的指定分子量，并且在用碘乙酰胺處理以封閉半胱氨酸殘基后為～9kDa；這些結果說明在"正常"條件下由于在電泳前或電泳期間殘基二級結構和半胱氨酸殘基之間的相互作用導致的不正確的分子量。N-末端測序驗證了Kex2pGAPZαB切割位點的不完全加工，導致在N-末端的另外的谷氨酸和丙氨酸殘基和7.07kDa的預測的產物重量。有趣的是，由結合前區(qū)域(Ao1bPro-PI1a)的修飾的構建體產生的Pl1a在"正常"SDS-PAGE條件下運行為在～9kDa處緊密靠近的雙條帶，有一些在較高分子量具有彌散條帶的證據(圖8C)。包括另外的前區(qū)域的肽的預測的分子量是8.6kDa。N-末端測序確認，前區(qū)域存在于蛋白產物中，并且在丙氨酸和Ao1b前區(qū)域異亮氨酸的第一殘基之間發(fā)生切割，得到8.46kDa的預測分子量。

“正?！盤l1a/GNA融合蛋白(即源自不含有另外的前區(qū)域的構建體)在SDS-PAGE凝膠上分離為兩個18和21kDa的指定大小的主蛋白蛋白(圖9A)。18kDa蛋白，與抗-GNA抗體免疫反應(結果未示)在質量上對應于對于重組PI1a/GNA預測的蛋白(17.1kDa)。21kDa蛋白也與抗-GNA抗體免疫反應，并且與18kDa條帶具有相同的N-端序列。用去糖基化酶PNGase F(其切割通過N-糖苷鍵連接于Asn殘基的碳水化合物側鏈)處理，去除該條帶，而作為處理的結果，對于Pl1a/GNA融合蛋白“正確”條帶的強度增加(圖9B)。該結果提示，額外的條帶是由于在合成和分泌期間巴斯德畢赤酵母“核心”糖基化融合蛋白。GNA不含有潛在的N-糖基化位點，但Pl1a毒素序列在Asn-35處含有潛在的N-糖基化位點(N-X-S/T)。單個條帶的N-端序列確定為E-A-A-A-G-，如對于在翻譯和從巴斯德畢赤酵母分泌期間去除酵母α-因子前體前區(qū)域后的融合蛋白所預期的。此外，與重組GNA(12.7kDa)類似的指定分子量處的小量條帶(其與抗-GNA抗體免疫反應(結果未示))，提示在生產和純化過程中發(fā)生融合蛋白向其成分的小量切割。完整PI1a/GNA融合蛋白與切割的GNA的比例估計為～30:1，如通過在SDS-PAGE凝膠上的考馬斯藍染色所判斷的。

源自含有另外的前區(qū)域序列的構建體的PI1a/GNA融合蛋白二者(即Ao1bPro-PI1a/GNA和Hv1aPro-PI1a/GNA)在SDS-PAGE凝膠上分離為兩個大約17和21kDa的主要染色條帶(圖9C&D)。較小的17kDa蛋白在質量上對應于對于去除前區(qū)域后的Ao1bPro-PI1a/GNA和Hv1aPro-PI1a/GNA(16.94kDa)所預測的蛋白，提示在兩種情況下，前區(qū)域在酵母細胞加工期間被去除。較大21kDa蛋白條帶最可能表示糖基化的蛋白，如對于Pl1a/GNA所觀察的。Ao1bPro-PI1a/GNA和Hv1aPro-PI1a/GNA二者都表達為100％完整融合蛋白，沒有SDS-PAGE和蛋白質印跡證據表明在毒素和GNA序列之間切割。

重組PI1a和Ao1bPro-PI1a蛋白對菜蛾(甘藍夜蛾)幼蟲的注射毒性

將甘藍夜蛾的新羽化的第5齡幼蟲(重～45-55mg)用純化的重組蛋白注射以評價和比較毒素和融合蛋白的體內活性。圖10A顯示用PI1a注射后幼蟲的存活，并且圖10B顯示注射相當劑量的PI1a和Ao1bPro-PI1a后的存活。用PI1a毒素注射的幼蟲在1–2小時內全部顯示無力的癱瘓(幾乎不移動和幾乎完全不進食)。在第一個24小時內觀察到大多數死亡。癱瘓期后，一些昆蟲顯示逐步恢復并且能夠從新開始進食。Pl1a的影響是劑量依賴性的，24小時后的死亡率范圍從20μg毒素/昆蟲的75％至1.25μg毒素/昆蟲的20％。甚至以高劑量的毒素，在72小時后觀察不到完全死亡。從這些測定，基于50mg的平均幼蟲重量，對于重組Pl1a估計的LD₅₀(48小時)是4.1μg/昆蟲或82μg/g昆蟲(參見表3)。天然PI1a的文獻LD₅₀值(相對于重組PI1a)是9.5μg/g。該文獻值代表夜蛾(Spodoptera)(與甘藍夜蛾相同昆蟲目的物種)中的LD₅₀值。

從修飾的表達構建體(包括來自U3-agatoxin-Ao1b的前區(qū)域)產生的重組Pl1a顯示與Pl1a類似的毒性作用，但一致地在較低的劑量比由沒有該額外序列的構建體產生的Pl1a更有效(圖10B)。此外，在第一個24小時期間觀察到Ao1bPro-PI1a對死亡率的主要影響，死亡率范圍從10μg毒素/昆蟲的80％至1.25μg毒素/昆蟲的30％。在這些測定中，存在由修飾的構建體產生的毒素導致的死亡率繼續(xù)增加至72小時的趨勢并且最高的毒素劑量(10μg毒素/昆蟲)在72小時導致100％死亡率。同時利用由未修飾的構建體產生的Pl1a進行的測定得到與之前的測定類似的結果，并且在相同測定中的兩種樣品之間的直接比較表明，當分析相同劑量存活曲線時，由未修飾的和修飾的構建體產生的Pl1a之間的差異統(tǒng)計學上顯著(圖10B)。對于從修飾的構建體(Ao1bPro-PI1a)產生的重組Pl1a估計的LD₅₀(48小時)是～1.0μg/昆蟲，或基于50mg的平均幼蟲重量為21μg/g昆蟲；這相當于～4倍的毒性增加(參見表3)。

表3：利用甘藍夜蛾幼蟲的注射生物測定中重組毒素和融合蛋白的毒性

*未獲得甘藍夜蛾的數據

Pl1a/GNA融合蛋白在注射入甘藍夜蛾幼蟲時還引起癱瘓和死亡，并且比單獨毒素顯著更有作用(圖11A)。當用1.25-10μg融合蛋白/昆蟲(相當于0.50-4.0μg PI1a/昆蟲，因為重組Pl1a的分子量是PI1a/GNA融合蛋白的分子量的～0.404)注射幼蟲時，在所有劑量觀察到顯著的死亡，并且在最高劑量觀察到在24小時后的完全死亡(圖11A)。如利用Pl1a的，在測定的第一個24小時內觀察到大部分死亡，并且作用是劑量依賴性的，范圍從10μg融合蛋白/昆蟲的100％死亡率至1.25μg融合蛋白/昆蟲的35％死亡率。融合蛋白在該最低劑量的死亡率在72h后增加至65％，而只注射1.25μg毒素的死亡率在24至72小時之間變化沒有20％。從這些測定，對于重組Pl1a/GNA融合蛋白估計的LD₅₀(48小時)是1.4μg/昆蟲，或28μg/g昆蟲(基于50mg的平均幼蟲重量)。LD₅₀相當于0.56μg Pl1a毒素/昆蟲，使得Pl1a/GNA融合蛋白活性基于摩爾數是由未修飾的構建體產生的毒素的～7倍，并且活性是由修飾的Ao1b-Pro-PI1a構建體產生的毒素的～2倍。通過使用在72小時的死亡數值獲得類似的比。相同劑量的毒素和融合蛋白產生的死亡率的直接比較表明，三種處理彼此不同，并且與對照不同，p<0.0001(ANOVA)。在所有這些測定中，經72小時未觀察到對照注射的昆蟲的死亡。

如利用Pl1a毒素觀察到的，將Ao1b前區(qū)域加入至Pl1a/GNA融合蛋白表達構建體導致具有增強的生物活性的蛋白產物(圖11B)。源自該構建體的融合蛋白產物具有0.94μg/昆蟲的估計的LD₅₀(48小時)，在所有劑量(除了最高的)具有增加死亡率。將來自pro-HV1a毒素的備選前區(qū)域加入至Pl1a/GNA表達構建體也增強了得到的融合蛋白的生物活性(圖11C)；該蛋白具有<0.6μg/昆蟲的估計的LD₅₀(48小時)，盡管總體死亡率值與pro-Ao1b-Pl1a/GNA融合蛋白類似。這些數據提示，通過在Pl1a/GNA的表達構建體中包含前區(qū)域可以獲得兩倍的毒性增加。

重組PI1a/GNA、AoIbPro-PI1a/GNA和Pro-Hv1aPI1a/GNA蛋白對菜蛾(甘藍夜蛾)幼蟲的攝取毒性

在利用第3期甘藍夜蛾幼蟲的小滴喂食測定中，也觀察到與注射測定中觀察到的相似的源自包含前區(qū)域的表達構建體的融合蛋白的毒性增加(圖12)。攝取單個2μl含有20μg融合蛋白的小滴后，5天后的死亡率對于PI1a/GNA是40％；對于AoIbPro-PI1a/GNA是50％并且對于Hv1aPro-PI1a/GNA是70％(表4中總結的數據)。對于對照處理(其中幼蟲用30μg毒素或GNA喂食)觀察到最小的存活的減少(0-20％)，并且對照的存活曲線顯著不同于融合蛋白處理。這提供進一步證據表明，將前區(qū)域加入至PI1a/GNA構建體導致增加的生物活性。對于注射研究，觀察到使用Hv1a前區(qū)域導致相對于未修飾的PI1a/GNA融合蛋白的最大的毒性增強。

表4：利用甘藍夜蛾幼蟲的口服喂食測定中的重組毒素和融合蛋白的毒性

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