本發(fā)明屬于動物基因工程疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及動物分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生物技術(shù)等相關(guān)領(lǐng)域。具體涉及融合蛋白sHA1-Fc及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

禽流感(Avian influenza)是禽流行性感冒的簡稱，由甲型流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，它不僅能引起雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉等家禽和豬、狗、虎等哺乳類動物的感染，也能感染人，甚至引起死亡，嚴重危害人類的健康，是一種人畜共患的傳染病，因此被國際獸疫局確定為I類傳染病。自19世紀發(fā)現(xiàn)以來，全球每年約有20％的兒童和5％的成年人有感染的癥狀，平均每個世紀發(fā)生3-4次大規(guī)模疫情，已經(jīng)給世界帶來了巨大的損失和危害，引起了世界極大的關(guān)注。禽流感病毒是一種單股負鏈RNA病毒，屬于正黏病毒科的甲型流感病毒屬。根據(jù)病毒粒子表面的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的糖蛋白不同，將其分為18個H亞型(H1～H18)和9個N亞型(N1～N9)。其中可以感染人的禽流感病毒亞型主要有H5N1、H9N2、H7N7，H5、H7兩種亞型的病毒株是高致病性病毒，引起了國內(nèi)外高度關(guān)注。H5N1高致病性禽流感病毒在最近幾年有不斷擴散的趨勢，而且在中國和越南還出現(xiàn)了H5N1變種病毒，使現(xiàn)有疫苗失去作用。由于H5病毒不斷發(fā)生變化，因此我們必須研發(fā)新的疫苗來應(yīng)對。禽流感病毒主要通過呼吸道或消化道等粘膜感染動物，在預(yù)防病原入侵機體時，滴鼻或者口服接種的途徑與其他免疫途徑相比可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生局部的粘膜免疫和全身性的免疫應(yīng)答，阻止病原微生物入侵機體抵抗早期的病毒感染。

目前在預(yù)防禽流感暴發(fā)的眾多方法中，最有效的方法是疫苗接種。然而禽流感病毒的持續(xù)變異性、傳播的迅速性決定了傳統(tǒng)疫苗在保護力上無法達到理想的效果。隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，疫苗技術(shù)也獲得了飛速的發(fā)展?，F(xiàn)在世界上研制出的禽流感疫苗主要有滅活全病毒疫苗、減毒活疫苗、重組載體疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗等。我國用的禽流感疫苗主要是針對H2、H5和H7亞型的疫苗，其中較多的是滅活疫苗。滅活疫苗雖然安全性較好，且各亞型之間不會產(chǎn)生免疫干擾，但卻不能抵抗異源毒株的感染。因此在這種情況下需要加快禽流感疫苗的研制和開發(fā)，從而加強對動物機體的免疫保護。

禽流感主要通過動物機體的呼吸道粘膜部位感染動物。理想的疫苗不僅能引起全身的體液免疫和細胞免疫，還能引起機體產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答。然而，大多數(shù)疫苗是通過肌肉或皮下注射途徑，雖然注射可誘導(dǎo)強烈的系免疫反應(yīng)，但是只產(chǎn)生極弱的粘膜免疫應(yīng)答。因此阻止病原體侵入粘膜是現(xiàn)在疫苗研究的一個方向，其中最理想的免疫方式就是通過滴鼻免疫途徑，這種方式模擬病毒的自然感染，不僅可以引起全身性的系統(tǒng)免疫，而且在粘膜局部引起相應(yīng)的粘膜免疫，對病毒早期的感染和增殖起到有效的免疫效果。粘膜免疫系統(tǒng)是機體的第一道防線，如果能在禽流感病毒感染機體的“源頭”將病毒消滅或?qū)⒉《镜闹虏×p弱，那是最為理想的方法。因此，我們嘗試研制一種新型的粘膜免疫亞單位疫苗。

針對上述問題，申請人將禽流感病毒H5N1的HA1抗原與雞IgY Fc片段融合，將該融合蛋白輔以粘膜佐劑通過滴鼻免疫雞，發(fā)現(xiàn)FcRy能介導(dǎo)IgY Fc融合蛋白跨越粘膜屏障進入體內(nèi)，并能有效激發(fā)機體的局部粘膜免疫和全身性免疫反應(yīng)，為家禽禽流感及其它傳染病的新型粘膜疫苗研制提供一種新的策略。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種融合蛋白sHA1-Fc，其氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示，對應(yīng)的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示。該融合蛋白是通過Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了雞IgY Fc片段與禽流感病毒H5N1HA1的融合蛋白。

本發(fā)明的另一個目的在于提供了融合蛋白sHA1-Fc的應(yīng)用，包括用于制備成預(yù)防禽流感的疫苗，或用于制備提高雞免疫力的生物制劑。

本發(fā)明的最后一個目的在于提供了融合蛋白sHA1-Fc的制備方法，方法簡單，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。

為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

融合蛋白sHA1-Fc的制備方法，包括：

1.雞IgY Fc基因的擴增：按常規(guī)方案提取雞脾臟組織RNA并進行反轉(zhuǎn)錄，獲得CDN A，再以CDNA為模板，利用Fc-up(含42bp Linker序列)與Fc-down引物進行PCR擴增(兩步法RT-PCR)得到Linker-Fc基因片段；

Fc-up：5'-GGATCAGGCGGGGGTGGGTCCGGAGGAGGTGGCTCGGGATCTCAGGTCTGCCGGGTAGA-3'，斜體劃線部分為Linker。

Fc-down：5'-CCGCTCGAGTTATTTACCAGCCTGTTTCTGCAGCG-3'，斜體劃線部分為XhoI。

2.禽流感病毒H5N1HA1的擴增：pFAST HTb-sHA1-Linker-wFc重組質(zhì)粒為模板，利用sHA1-up與sHA1-down(含42bp Linker序列)引物，用PCR擴增得到sHA1-Linker基因片段；

Fc-up：5'-GGATCAGGCGGGGGTGGGTCCGGAGGAGGTGGCTCGGGATCTCAGGTCTGCCGGGTAGA-3'，斜體劃線部分為Linker。

Fc-down：5'-CCGCTCGAGTTATTTACCAGCCTGTTTCTGCAGCG-3'，斜體劃線部分為XhoI酶切位點。

3.sHA1-Fc融合基因的擴增：以回收的sHA1-Linker和Linker-Fc片段為模板，利用sHA1-up與Fc-down引物，用重疊PCR擴增得到sHA1-Linker-Fc基因片段，簡稱sHA1-Fc基因，其序列為SEQ ID NO.1所示。

4.重組質(zhì)粒pFastBac HTB-sHA1-Fc的構(gòu)建：將回收的sHA1-Linker-Fc基因片段插入到真核表達載體pFastBac HTB的XbaI和XhoI酶切位點之間，獲得的重組質(zhì)粒命名為pFastBac HTB-sHA1-Fc；

5.桿粒Bacmid的獲得：pFastBac HTB-sHA1-Fc轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH10Bac，挑取陽性菌落，提取陽性桿粒Bacmid進行PCR鑒定，獲得重組陽性桿粒Bacmid。

6.利用重組陽性桿粒Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細胞，收獲感染的SF9細胞，經(jīng)純化后獲得融合蛋白sHA1-Fc，其序列為SEQ ID NO.2所示。

融合蛋白sHA1-Fc在制備預(yù)防禽流感疫苗中的應(yīng)用，包括以融合蛋白sHA1-Fc為主效成分或是主效成分之一制備成禽流感疫苗，或是制備成提高雞免疫力的生物制劑，或是制備成提高雞HI抗體的生物制劑。

優(yōu)選的，所述的禽流感疫苗或生物制劑的劑型為滴鼻制劑或注射制劑。

以上方案中，優(yōu)選的，制備成所述的滴鼻制劑時，融合蛋白sHA1-Fc的佐劑為CpG-OD N 2006粘膜佐劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點：

1.本發(fā)明利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了雞IgY Fc片段與禽流感病毒H5N1HA1的融合蛋白(sHA1-Fc)。表達的該融合蛋白具有類似雞IgY的分子結(jié)構(gòu)，可以利用雞呼吸道上皮細胞中表達的雞免疫球蛋白IgY轉(zhuǎn)運受體(FcRy)主動轉(zhuǎn)運而跨越粘膜屏障進入體內(nèi)。而文獻報道已表達的抗原基因其他形式的融合蛋白通過滴鼻方式不能有效地跨越雞的呼吸道粘膜屏障而轉(zhuǎn)運進入體內(nèi)。同時由于sHA1-Fc具有FcγRI結(jié)合位點更有利于抗原遞呈細胞對其的識別與攝取。

2.將雞IgY Fc片段與禽流感病毒H5N1HA1的融合蛋白(sHA1-Fc)輔以CpG-ODN2006粘膜佐劑滴鼻接種雞，模擬禽流感病毒的自然感染途徑，能誘導(dǎo)有效的局部粘膜免疫反應(yīng)和全身性免疫反應(yīng)，從而保護動物機體。

3.可通過滴鼻或噴霧等方式接種，其操作簡單快速，既能激發(fā)機體產(chǎn)生有效的粘膜免疫，同時也能激發(fā)機體的系統(tǒng)免疫。其免疫效果優(yōu)于商品化的全病毒滅活疫苗，從而為家禽新型粘膜疫苗的研制提供一種新的策略。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖。

圖2為本發(fā)明中重組pFastBac HTB-sHA1-Fc質(zhì)粒的鑒定示意圖。

圖2中A：重組pFastBac HTB-sHA1-Fc質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果，泳道1，2：用XhoI和Xb aI酶切pFastBac HTB-sHA1-Fc質(zhì)粒圖，M：DL15000DNA Marker；

圖2中B：重組pFastBac HTB-sHA1-Fc質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果，泳道1，2：sHA1-Fc基因的PCR產(chǎn)物，M：DL2000DNA Marker。

圖3為本發(fā)明中重組Bacmid病毒桿粒的鑒定示意圖。

圖3中A：重組Bacmid病毒桿粒PCR鑒定結(jié)果，泳道1：sHA1-Fc基因的PCR產(chǎn)物，M：DL2000DNA Marker。

圖3中B：重組Bamid病毒桿粒PCR鑒定結(jié)果，泳道1：M13引物擴增的含sHA1-Fc基因的PCR產(chǎn)物，M：DL15000DNA Marker。

圖4為sHA1-Fc融合蛋白的SDS-PAGE檢測和Western blot鑒定示意圖。

圖4中A：sHA1-Fc融合蛋白的SDS-PAGE檢測。

圖4中B：sHA1-Fc融合蛋白的Western blot鑒定。

圖4中C：在非還原性條件下sHA1-Fc融合蛋白的Western blot鑒定。

圖5為HA1融合蛋白跨越雞呼吸道粘膜屏障進入血液的檢測示意圖。

圖6為ELISA檢測免疫雞血清中抗禽流感病毒H5N1HA1的特異性IgY抗體效價示意圖。

圖7為免疫雞血清特異性抗體的HI效價檢測示意圖。

圖8為二免后14d雞血清中抗禽流感病毒H5N1HA1特異性抗體的HI效價檢測示意圖。

圖9為ELISA檢測免疫雞氣管與肺臟沖洗液中的特異性IgY和sIgA抗體水平示意圖。

圖10為免疫雞血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的含量檢測示意圖。

圖11為免疫雞脾淋巴細胞增殖實驗結(jié)果。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細地說明。

實施例1：

融合蛋白sHA1-Fc的表達

1.按常規(guī)方案提取雞脾臟組織RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得CDNA。

2.引物設(shè)計

根據(jù)實驗室保存的重組質(zhì)粒pFastBac HTB-sHA1-Linker-wFc(黨威，2014)，設(shè)計一對引物，其中sHA1上游引物(sHA1-up)引入XbaI酶切位點，sHA1下游引物(sHA1-down)含42bp的Linker序列擴增sHA1序列。

sHA1-up：5'-CTAGTCTAGAATGGAGAAAATAGTGCTTC-3'，斜體劃線部分為XbaI。

sHA1-down：5'-AGATCCCGAGCCACCTCCTCCGGACCCACCCCCGCCTGATCCTCTTTTTCTTCTTCTCT-3'，斜體劃線部分為Linker。

根據(jù)GenBank收錄的雞重鏈序列(GenBank:X07174)設(shè)計一對引物，其中Fc上游引物(Fc-up)引入42bp的Linker序列，F(xiàn)c下游引物(Fc-down)引入XhoI酶切位點。

Fc-up：5'-GGATCAGGCGGGGGTGGGTCCGGAGGAGGTGGCTCGGGATCTCAGGTCTGCCGGGTAGA-3'，斜體劃線部分為Linker。

Fc-down：5'-CCGCTCGAGTTATTTACCAGCCTGTTTCTGCAGCG-3'，斜體劃線部分為XhoI。

檢測重組陽性桿粒的M13/pUC測序引物為：

M13上游(M13-up)：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′

M13下游(M13-down)：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3

3.禽流感病毒H5N1HA1、雞IgY Fc基因的擴增

PCR擴增條件：95℃預(yù)變性5min，95℃1min，58℃1min，72℃1min30s，30個循環(huán)，72℃延伸10min。

根據(jù)表1反應(yīng)體系和上述反應(yīng)條件，以本室保存的pFastBac HTB-sHA1-Linker-wFc重組質(zhì)粒為模板，利用sHA1-up與sHA1-down(含42bp Linker序列)引物，用PCR擴增得到sHA1-Linker基因片段；以雞的脾臟組織CDNA為模板，再利用Fc-up(含42bp Linker序列)與Fc-down引物，進行PCR擴增得到Linker-Fc基因片段。擴增條帶經(jīng)1％瓊脂凝膠電泳分析，大小分別為1020bp和1074bp，與預(yù)期的目的片段大小一致。

表1PCR反應(yīng)組成成分

4.sHA1-Fc融合基因的擴增

PCR擴增條件：95℃預(yù)變性5min，95℃1min，58℃1min，72℃1min50s，30個循環(huán)，72℃延伸10min。

根據(jù)表2反應(yīng)體系和上述反應(yīng)條件，以回收的sHA1-Linker和Linker-Fc片段為模板，利用sHA1-up與Fc-down引物，用重疊PCR擴增得到sHA1-Linker-Fc基因片段，簡稱sHA1-Fc基因，其序列為SEQ ID NO.1所示。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，大小為2094bp，與預(yù)期的目的片段大小一致，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。

表2重疊PCR反應(yīng)組成成分

5.重組質(zhì)粒pFastBac HTB-sHA1-Fc的構(gòu)建

將回收的sHA1-Linker-Fc基因片段和真核表達載體pFastBac HTB分別用XbaI和XhoI進行雙酶切，將酶切產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒分別回收sHA1-Fc片段與pFastBac HTB片段，將回收的sHA1-Fc片段與pFastBac HT B片段進行連接，連接反應(yīng)體系見表3，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α中并進行鑒定，用XbaI和XhoI進行雙酶切，將酶切產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，片段大小分別為2094bp和4857bp，片段大小與預(yù)期的目的片段一致。篩選出陽性克隆后，送武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測序，測序結(jié)果在線Blast分析，獲得的重組質(zhì)粒命名為pFastBac HTB-sHA1-Fc。BL ASTn比對同源性達99％。

表3 sHA1-Fc基因與pFastBac HTB連接反應(yīng)體系

6.重組質(zhì)粒pFastBac HTB-sHA1-Fc轉(zhuǎn)座

重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座步驟：

(1)制備KGTIX LB瓊脂平板

(2)轉(zhuǎn)化：取100μL DH10Bac感受態(tài)細胞，冰上融化15min；加入1μLpFAST HTB-sHA1-Fc陽性重組質(zhì)粒于感受態(tài)細胞中，輕輕混勻后，冰浴30min；42℃水浴熱擊45s，再迅速移出置冰上2min；加入900μL預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，37℃225rpm/min振蕩培養(yǎng)4h；用SOC培養(yǎng)基10倍梯度稀釋：10^-1、10^-2、10^-3，在避光條件下，每個稀釋度分別取100μL涂KGTIX LB平板，涂布均勻后，將平板避光正放于37℃溫箱5min，表面液體被瓊脂吸收后，再避光倒放繼續(xù)培養(yǎng)24-48h；避光下挑取白色菌落。

7.桿粒Bacmid的提取與鑒定

陽性桿粒Bacmid的篩選

在黑色背景下用滅菌槍頭挑取白色菌落，于5mL LB培養(yǎng)基(含終濃度為50μg/mL卡那霉素、10μg/mL四環(huán)素、7μg/mL慶大霉素)，37℃搖床250rpm/min培養(yǎng)24-48h；取3mL菌液提取質(zhì)粒，PCR鑒定正確的菌液，避光在KGTIX LB瓊脂平板上劃線，然后再挑取白色菌落，連續(xù)鑒定三次為陽性的菌液，可提取陽性桿粒Bacmid。

桿粒Bacmid的鑒定

(1)pUC/M13通用引物檢測：

PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5min；95℃1min，55℃1min，72℃5min，30個循環(huán)；72°C延伸10min。

根據(jù)上述反應(yīng)條件，以獲得的重組Bacmid桿粒為模板，利用pUC/M13通用引物(M13-up和M13-down)進行PCR檢測，PCR產(chǎn)物用0.6％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，大小為4534bp，與預(yù)期的目的片段大小一致，說明重組Bacmid病毒桿粒構(gòu)建成功。

(2)特異性引物檢測：

PCR擴增條件：95℃預(yù)變性5min，95℃1min，58℃1min，72℃1min50s，30個循環(huán)，72℃延伸10min。

根據(jù)上述反應(yīng)條件，以獲得的重組Bacmid桿粒為模板，利用目的基因特異性引物(sHA1-up和Fc-down)進行PCR檢測，PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，大小為2094bp，與預(yù)期的目的片段大小一致。

8.重組陽性桿粒Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細胞

提取陽性桿粒后，使用分光光度計測其濃度，并且按照每次1μg的用量計算轉(zhuǎn)染所需體積，使用Reagent(Invitrogen)進行轉(zhuǎn)染。

9.重組陽性桿狀病毒的擴增

轉(zhuǎn)染后的6-7d，出現(xiàn)晚期感染跡象，此時，收六孔板中的細胞培養(yǎng)上清到一離心管中，500×g離心5min去除細胞碎片，將離心后上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中4℃避光保存。制備P2病毒貯液方法如下：a.在六孔板中接種對數(shù)生長期Sf9細胞2×10⁶個細胞/2mL/孔，貼壁生長至少1h；b.加入病毒懸液，感染復(fù)數(shù)為MOI＝0.01-0.1，27℃孵育48-72h；c.根據(jù)細胞病變情況收集各孔中病毒上清液，4℃500×g離心5min，去除細胞和碎片，上清即為P2病毒貯液，4℃避光保存或分裝于-80℃長期保存；d.制備了高效價P2病毒液后，按上述方法擴增P3、P4貯液用于高效表達。

10.重組蛋白的制備及鑒定

(1)當Sf9細胞長滿整個細胞瓶的80％左右時細胞處于對數(shù)期。

(2)棄掉細胞瓶中的培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液。

(3)每孔加入適量的P4代病毒，MOI＝2。

(4)72h后，棄掉培養(yǎng)上清，加入PBS溶液，洗兩遍，用細胞刮刮取細胞。

(5)1000rpm/min離心5min，棄掉PBS溶液，將細胞凍起來。

(6)用20μL RIPA裂解液裂解細胞(用前加入終濃度為1mmol/L PMSF的PMSF)，12000rpm/min 4℃離心10min后取上清于另一干凈的離心管中，待檢。

經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，其蛋白大小為82KD(圖4中A)，應(yīng)用Western Blot分別對該融合蛋白的sHA1和Fc片段進行檢測，結(jié)果顯示該蛋白已成功表達(圖4中B)，在非還原條件下檢測蛋白大小約為160KD(圖4中C)，說明該融合蛋白以二聚體的形式存在，具有類似IgY的分子結(jié)構(gòu)。

11.sHA1-Fc融合蛋白的純化

離心收集接毒72h后的細胞，用預(yù)冷的Binding Buffer(加入終濃度為1mmol/L PMS F)重懸；壓力細胞破碎儀破碎細胞直至透亮；4℃12000rpm離心30min，收集上清；將上清用0.45μm濾膜過濾后，用HisTrap FF crude(柱體積1mL)親和層析柱純化，具體步驟如下：

平衡柱：用10mL Binding buffer緩慢流過柱子；

上樣：將過濾后的細胞裂解上清加到平衡好的柱子中；

洗柱：用至少10-15mL Binding buffer洗柱子，洗去未結(jié)合的成分以及一些雜蛋白；

洗脫：用5mL的Elution buffer洗脫目的蛋白，棄最初3滴，1mL/管，分5管收集，并分別從收集的5個離心管中取出10μL SDS-PAGE電泳檢測。

用核酸蛋白儀測定各管洗脫液中蛋白的濃度，蛋白濃度約為1mg/mL，分裝小管，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

實施例2：

sHA1-Fc融合蛋白的應(yīng)用：

sHA1-Fc融合蛋白跨越雞呼吸道粘膜屏障的檢測

分別將生物素標記的sHA1-Fc融合蛋白、GST-HA1融合蛋白和雞IgY滴鼻接種10日齡海蘭灰蛋雞雞苗，8h后經(jīng)ELISA檢測發(fā)現(xiàn)血清中sHA1-Fc含量遠高于GST-HA1，二者差異極顯著(P<0.01)，而與陽性對照IgY相比差異不顯著。這說明在體內(nèi)sHA1-Fc融合蛋白可以借助雞呼吸道粘膜上皮細胞中表達的FcRy跨越粘膜屏障特異性轉(zhuǎn)運進入血液(圖5)。

滴鼻和皮下接種雞的免疫效果檢測

175只7日齡海蘭灰蛋雞雞苗隨機分為7組，每組25只，分組情況和免疫劑量如表4和表5。7日齡首免，間隔兩周(21日齡)加強免疫1次，免疫時間及采血時間如表6。第二次免疫后10d每組隨機抓取5只，斷頸處死后，分別采取氣管或肺臟的沖洗液、血清和脾臟。GST-HA1融合蛋白在包涵體中表達(黨威，2014)，采用包涵體純化的方法對融合蛋白進行純化。

表4滴鼻接種免疫劑量

表5皮下接種免疫劑量

表6粘膜免疫及采血時間

血清特異性IgY ELISA抗體效價檢測

(1)包被：用包被液將純化后的GST-HA1或His-HA1蛋白包被到96孔酶標板上，經(jīng)過摸索，抗原的最終稀釋濃度定為3μg/mL(GST-HA1)或4μg/mL(His-HA1)，4℃包被過夜。

(2)洗滌：棄孔中溶液，拍干，每孔加入洗滌液200μL，洗3次，每次3min，棄去洗滌液，在吸水紙上將酶標板拍干。

(3)封閉：每孔加入100μL封閉液，37℃孵育lh。

(4)洗滌：棄溶液，拍干，每孔加入洗滌液200μL，洗3次，每次3min，棄去洗滌液，在吸水紙上將酶標板拍干。

(5)加待測血清：將待檢血清稀釋25倍。先在每孔加入100μL洗滌液，在第一橫行加入100μL稀釋血清，由上向下(縱向)倍比稀釋，終濃度為1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1:3200、1：6400和1：12800，同時設(shè)PBS陰性對照，37℃孵育1h。

(6)洗滌：棄溶液，拍干，每孔加入洗滌液200μL，洗3次，每次3min，棄去洗滌液，在吸水紙上將酶標板拍干。

(7)加酶標二抗：用洗滌液1∶7000稀釋羊抗雞IgG(IgY)酶標抗體，100μL/孔，37℃溫育30-45min。

(8)洗滌：棄溶液，拍干，每孔加入洗滌液200μL，洗3次，每次3min，棄去洗滌液，在吸水紙上將酶標板拍干。

(9)加底物混合溶液顯色：加入底物液，每孔100μL，37℃避光孵育15min，取出。

(10)終止反應(yīng)：每孔加50μL 2mol/LH₂SO₄終止液終止反應(yīng)。

(11)測定：放在酶標儀上測定450nm各孔的吸光值(A)，即OD₄₅₀nm值。

(12)結(jié)果判斷：實驗孔A值/陰性對照A值≥2.1者，判為陽性。呈陽性時，血清的最大稀釋倍數(shù)就是該血清的效價。

結(jié)果表明，一免后14d各免疫組均能產(chǎn)生特異性的抗體，二免后各免疫組誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體水平呈明顯的上升趨勢，到一免后28d時達到最高值，隨后開始下降。在28d時，sHA1-Fc滴鼻免疫組血清中特異性抗體IgY的ELISA抗體效價達到1：5680，與GST-HA1滴鼻免疫組(1：1080)相比差異極顯著(P<0.01)，與滅活疫苗組(1：3280)相比差異顯著(P<0.05)(圖6)。

HI試驗

(1)取U型微量血凝板，每孔加入50μL生理鹽水，在第一排加入雞血清50μL，從1-11孔依次倍比稀釋，第11孔做陽性對照，第12孔做紅細胞陰性對照，隨后向各孔依次加入50μL 4單位抗原，混合均勻后，室溫作用30min或37℃15min；在各反應(yīng)孔內(nèi)分別加入50μL 1％雞紅細胞懸液，室溫靜置30min或37℃15min。

(2)在紅細胞對照出現(xiàn)完全沉淀、陽性對照出現(xiàn)完全凝集的情況下，將U型微量血凝板45度傾斜，從反應(yīng)板背側(cè)觀察。以完全抑制紅細胞凝集的最大稀釋倍數(shù)判為該血清HI效價。

按《高致病性禽流感疫情處置規(guī)范(試行)》血凝抑制(HI)試驗技術(shù)進行結(jié)果判定，若血清的血凝抑制滴度≥2⁴(1：16)，判斷為免疫合格，抗體合格率≥70％為群體免疫合格。

HI效價檢測結(jié)果表明二免后14d各個免疫組血清中特異性抗體的HI效價都達到最高值，其中sHA1-Fc滴鼻免疫組最高，達到1：103.97，GST-HA1滴鼻免疫組、sHA1-Fc皮下免疫組和滅活苗組的HI抗體效價為1：10.92、1：61.82和1：66.26，滴鼻組中sHA1-Fc與GST-HA1相比差異顯著(P<0.05)，隨后開始下降(圖7)。二免后14d sHA1-Fc滴鼻和皮下免疫組的免疫合格率均為95％(19/20)，而GST-HA1滴鼻免疫組的免疫合格率僅為40％(8/20)，GST-HA1皮下免疫組的免疫合格率為75％(15/20)，滅活疫苗免疫組的免疫合格率為100％(圖8)。一免后42d sHA1-Fc滴鼻免疫組與滅活疫苗免疫組的免疫合格率均為65％(13/20)，二者的HI平均效價分別為1：14.93和1：12.99，sHA1-Fc滴鼻免疫組的HI效價略高于滅活疫苗免疫組。

呼吸道局部特異性抗體SIgA和IgY沖洗液的制備

(1)二免后10d每組各取5只，各組提前禁食禁水8h后將雞處死，置75％的酒精中浸泡3-5min，全身消毒。仰臥，無菌眼科剪和眼科鑷剪開頸部皮膚，暴露氣管并分離氣管，喉頭下方插入氣管內(nèi)，用1ml滅菌的PBS分三次洗滌雞氣管，獲得的沖洗液經(jīng)10000rpm/min離心5min，取上清即為氣管洗液，-20℃凍存。

(2)分離肺臟，放入7mL離心管中，加入1.5mL滅菌PBS(PH7.4)，用剪刀將肺臟剪碎，10000rpm/min離心5min，上清即為肺洗液，-20℃凍存。

(3)將氣管灌洗液與肺臟上清液樣品按1：5稀釋，每孔100μL，做間接ELISA，方法同上。

檢測結(jié)果顯示sHA1-Fc滴鼻免疫組氣管和肺臟沖洗液中的特異性IgY抗體的ELISA抗體效價分別為1：128和1：488，且顯著高于其他免疫組。sHA1-Fc滴鼻免疫組氣管和肺臟沖洗液中的特異性sIgA抗體的ELISA抗體效價分別為1:192和1:36，且顯著高于其他免疫組(圖9)。

細胞因子的檢測

(1)使用前，將所有試劑充分混勻，避免產(chǎn)生泡沫。

(2)根據(jù)實驗孔(空白和標準品)數(shù)量，確定所需的板條數(shù)目。樣品(含標準品)和空白都應(yīng)做復(fù)孔。

(3)加樣：100μL/孔加入稀釋后的細胞因子標準品至標準品孔，100μL/孔加入樣品至樣品孔，設(shè)置空白孔，用稀釋緩沖液(1×)代替樣本和標準品。

(4)加檢測抗體：50μL/孔加入稀釋后的生物素標記抗體?；靹蚝?，蓋上封板膜，37°C溫育90min。

(5)洗板：扣去孔內(nèi)液體，300μL/孔加入洗滌液；停留1min后棄去孔內(nèi)液體。重復(fù)4次，每一次在濾紙上扣干。

(6)加酶：100μL/孔加入稀釋后的親和素。蓋上封板膜，37℃溫育30min。

(7)洗板：重復(fù)步驟(5)。

(8)顯色：100μL/孔加入TMB，37℃避光溫育5-30min之間，根據(jù)孔內(nèi)顏色的深淺(深藍色)來判定終止反應(yīng)。通常顯色10-20min可以達到很好的效果。

(9)終止反應(yīng)：100μL/孔迅速加入終止液終止反應(yīng)。

結(jié)果表明二免后第10d，sHA1-Fc滴鼻免疫組血清中IFN-γ和IL-2含量均最高，分別為243.32pg/mL、341.55pg/mL，與GST-HA1滴鼻免疫組中IFN-γ含量(160.85pg/mL)相比二者差異極顯著(P<0.01)，sHA1-Fc皮下免疫組和滅活苗組的IFN-γ含量分別為242.46pg/mL和215.85pg/mL，且與sHA1-Fc滴鼻免疫組相比無顯著性差異。GST-HA1滴鼻免疫組、sHA1-Fc皮下免疫組和滅活苗組中IL-2的含量分別為229.73pg/mL、259.05pg/mL和248.02pg/mL，sHA1-Fc滴鼻免疫組與其他各免疫組相比差異極顯著(P<0.01)。sHA1-Fc滴鼻免疫組血清中IL-4含量為185.36pg/mL且與各組相比差異不顯著(圖10)。

MTT法測脾淋巴細胞增殖

(1)二免后10d每組取5只將其處死，置75％的酒精中浸泡3-5min，全身消毒。

(2)將其仰臥位放入超凈臺中，消毒腹部皮膚，無菌眼科剪和眼科鑷剪開腹腔，打開腹腔后換套剪刀鑷子，無菌取出脾臟，剝離干凈，將脾臟在勻漿器中磨碎。

(3)利用雞脾臟組織淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。

(4)以2mL完全培養(yǎng)液(RPMI-1640)懸浮細胞，取0.1mL在細胞計數(shù)板上計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為4×10⁶/mL。

(5)于96孔細胞培養(yǎng)板中各孔中加入上述細胞懸液(細胞濃度為4×10⁶/mL)，90μL/孔，然后加入10μL HA1(終濃度為5μg/mL)作為刺激原，每個樣品重復(fù)3孔，同時設(shè)立不加MTT的陰性對照和不加KG-HA1的空白對照孔，均重復(fù)3孔。

(6)混勻，37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

(7)加入MTT之前，吸棄各孔的的上清，每孔加入100μL基礎(chǔ)RPMI-1640，每孔加入10μL 5mg/mL的MTT，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4h。

(8)每孔中加入100μL DMSO，微型震蕩器震蕩5min后，37℃放置30min；

(9)用自動酶標測定儀測OD₅₇₀nm值。以刺激指數(shù)(Stimulation Index,SI)判斷淋巴細胞增殖滴度。

結(jié)果顯示sHA1-Fc滴鼻免疫組刺激指數(shù)為2.92，GST-HA1滴鼻免疫組、sHA1-Fc皮下免疫組和滅活苗組的刺激指數(shù)分別為1.32、2.16和2.74，sHA1-Fc滴鼻免疫組與GST-HA1滴鼻免疫組和sHA1-Fc皮下免疫組相比均差異極顯著(P<0.01)(圖11)。

SEQUENCE LISTING

<110> 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 融合蛋白sHA1-Fc及應(yīng)用

<130> 融合蛋白sHA1-Fc及應(yīng)用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 2097

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gccagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60

attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120

actgctacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acggaaagct ctgcgacctt 180

gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcgggaac 240

ccaatgtgtg acgaattcat caatgtaccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccagt 300

ccagccaatg acctctgtta cccaggggat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta 360

ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaaattc ttggtccaat 420

catgaagcct catcaggggt gagctcagca tgtccatacc tgggaaagcc ctcctttttc 480

agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtacatacc caacaataaa gaggagctac 540

aataatacca accaagaaga tcttttggtg ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg 600

gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg aacatcaaca 660

ctaaaccaga gattggtacc aaaaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720

aggatggagt tcttctggac aattttgaaa ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat 780

ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt 840

atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gccaaactcc aatgggggcg 900

ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960

tatgtgaaat caaacagatt agtccttgct actgggctca gaaatagccc tcaaggagag 1020

agaagaagaa aaagaggatc aggcgggggt gggtccggag gaggtggctc gggatctcag 1080

gtctgccggg tagatcccgt accgcctgta gccccagagg tgcaggtcct ccacccctcc 1140

tcctgcaccc cgagccaatc cgagtcggtg gagctgttgt gtttggtgac ggggttctcc 1200

ccggcgtcgg cggaggtcga atggttggtg gacggagtgg ggggactttt ggtggcctcc 1260

caaagcccgg cggtccgcag cggatccacc tacagcctga gcagccgcgt caacgtcagc 1320

ggcaccgatt ggagggaagg gaagagttac agctgtaggg tgaggcaccc cgcaaccaac 1380

accgtggtgg aggatcacgt caagggatgc ccggacggcg ctcagagctg cagccccatc 1440

cagctgtacg ccatcccacc cagcccgggc gagctgtaca tcagcttaga cgccaaactg 1500

aggtgcctgg tggtcaacct gcccagcgat tccagcctca gcgtcacctg gaccagggag 1560

aagagtggga acctccggcc cgacccgatg gtcctccaag aacacttcaa cggcacctac 1620

agcgccagca gcgccgtccc cgtcagcacc caggattggt tatccgggga gaggttcacc 1680

tgcaccgtgc agcacgagga gctgcccctg ccgctcagca agagcgtcta caggaacacg 1740

ggacccacca ccccacctct gatctacccc ttcgcccccc acccggaaga gctgtccctc 1800

tcccgcgtca ccctgagctg cctggtccgc ggcttccgcc cacgtgacat cgagatccgg 1860

tggctccgcg accaccgcgc cgttcccgcc accgaattcg tcaccaccgc cgtcctcccg 1920

gaagagagaa ccgcaaacgg cgccggcggt gacggcgaca ccttcttcgt gtacagtaag 1980

atgagcgtgg agaccgccaa gtggaacggc gggacggtgt tcgcctgcat ggcggtgcac 2040

gaggcgctgc ccatgcgctt cagccagcgc acgctgcaga aacaggctgg taaataa 2097

<210> 2

<211> 698

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Ala Ser Leu Val Lys Ser

1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Ala Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

65 70 75 80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Lys Ala Ser Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn

100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asn Ser Trp Ser Asn His Glu Ala Ser

130 135 140

Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Lys Pro Ser Phe Phe

145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln

195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

210 215 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

225 230 235 240

Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly

275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

325 330 335

Pro Gln Gly Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

340 345 350

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gln Val Cys Arg Val Asp Pro Val Pro

355 360 365

Pro Val Ala Pro Glu Val Gln Val Leu His Pro Ser Ser Cys Thr Pro

370 375 380

Ser Gln Ser Glu Ser Val Glu Leu Leu Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser

385 390 395 400

Pro Ala Ser Ala Glu Val Glu Trp Leu Val Asp Gly Val Gly Gly Leu

405 410 415

Leu Val Ala Ser Gln Ser Pro Ala Val Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Ser

420 425 430

Leu Ser Ser Arg Val Asn Val Ser Gly Thr Asp Trp Arg Glu Gly Lys

435 440 445

Ser Tyr Ser Cys Arg Val Arg His Pro Ala Thr Asn Thr Val Val Glu

450 455 460

Asp His Val Lys Gly Cys Pro Asp Gly Ala Gln Ser Cys Ser Pro Ile

465 470 475 480

Gln Leu Tyr Ala Ile Pro Pro Ser Pro Gly Glu Leu Tyr Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Ala Lys Leu Arg Cys Leu Val Val Asn Leu Pro Ser Asp Ser Ser

500 505 510

Leu Ser Val Thr Trp Thr Arg Glu Lys Ser Gly Asn Leu Arg Pro Asp

515 520 525

Pro Met Val Leu Gln Glu His Phe Asn Gly Thr Tyr Ser Ala Ser Ser

530 535 540

Ala Val Pro Val Ser Thr Gln Asp Trp Leu Ser Gly Glu Arg Phe Thr

545 550 555 560

Cys Thr Val Gln His Glu Glu Leu Pro Leu Pro Leu Ser Lys Ser Val

565 570 575

Tyr Arg Asn Thr Gly Pro Thr Thr Pro Pro Leu Ile Tyr Pro Phe Ala

580 585 590

Pro His Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Arg Val Thr Leu Ser Cys Leu

595 600 605

Val Arg Gly Phe Arg Pro Arg Asp Ile Glu Ile Arg Trp Leu Arg Asp

610 615 620

His Arg Ala Val Pro Ala Thr Glu Phe Val Thr Thr Ala Val Leu Pro

625 630 635 640

Glu Glu Arg Thr Ala Asn Gly Ala Gly Gly Asp Gly Asp Thr Phe Phe

645 650 655

Val Tyr Ser Lys Met Ser Val Glu Thr Ala Lys Trp Asn Gly Gly Thr

660 665 670

Val Phe Ala Cys Met Ala Val His Glu Ala Leu Pro Met Arg Phe Ser

675 680 685

Gln Arg Thr Leu Gln Lys Gln Ala Gly Lys

690 695