Wasabi蛋白納米抗體及其編碼序列與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及Wasabi蛋白納米抗體及其在檢測(cè)Wasabi蛋 白中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] Wasabi蛋白是一種近年來發(fā)現(xiàn)的變體綠色熒光蛋白，它的熒光大約是EGFP的2 倍，因?yàn)槠鋬?yōu)異的特性，在未來會(huì)替代現(xiàn)在使用較多的EGFP和GFP等綠色熒光蛋白。Wasabi 蛋白以其本身所具有的熒光特性而成為用途非常廣泛的蛋白標(biāo)簽，為檢測(cè)或純化目的蛋白 提供了便利。含Wasabi蛋白標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)后，可以通過熒光顯微鏡對(duì)其進(jìn)行定性檢 測(cè)，但是在很多情況下仍然需要對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)。如今對(duì)含有Wasabi蛋白標(biāo)簽的重組蛋 白的定量檢測(cè)方法主要是針對(duì)重組蛋白的免疫印跡，但是免疫印跡屬于半定量，并且實(shí)驗(yàn) 所需時(shí)間較長(zhǎng)，步驟繁瑣。
[0003] 1993年比利時(shí)的Hamers Casterman報(bào)道了在胳§它血清中不僅存在由2條H鏈 和2條L鏈構(gòu)成的IgGl型常規(guī)抗體，還存在缺失輕鏈的IgG2和IgG3亞型的重鏈抗體 (heavy-chain antibody，hcAb)這類抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)僅由重鏈的可變區(qū)VHH(variable domain of the heavy chain of HCAbs, VHH)單結(jié)構(gòu)域形成，盡管天然缺失輕鏈可變區(qū)， 卻仍具有良好和廣泛的抗原結(jié)合力。由于其在可變區(qū)，框架FR2區(qū)存在一些不同于常規(guī)抗 體的親水性氨基酸，使得VHH抗體在水溶液中具有良好的穩(wěn)定性。VHH抗體是目前所發(fā)現(xiàn) 的具有完整功能的最小分子抗體片段，其分子高度4. 8nm，直徑2. 2nm，故被稱為單域抗體 或納米抗體（nanobody)。納米抗體重要的特征之一是其具有更為伸展的抗原互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)，可結(jié)合一些常規(guī)抗體無法接近的抗原表位。如位于酶蛋白裂隙中的活性中心結(jié)構(gòu)。 納米抗體，它還具有易表達(dá)，水溶性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，免疫原性弱，組織穿透性好等優(yōu)點(diǎn)，使得 該抗體作為一種小型化的基因工程抗體在基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004] 獲得納米抗體的編碼序列以及氨基酸序列是通過噬菌體展示技術(shù)，對(duì)構(gòu)建的納米 抗體文庫(kù)進(jìn)行高效率的篩選，從而使特異結(jié)合的克隆得到高度富集。噬菌體展示技術(shù)是一 種噬菌體表面表達(dá)篩選技術(shù)，其原理是以噬菌體為載體，將外源核酸片段克隆至噬菌體外 殼蛋白基因中，并以外殼蛋白融合蛋白的形式表達(dá)于噬菌體表面，組成了噬菌體展示庫(kù)。然 后用固定化的靶分子去篩選與之親和的噬菌體，不能結(jié)合的噬菌體被洗脫掉，而能結(jié)合的 噬菌體被保留下來并通過感染大腸桿菌得以擴(kuò)增和富集，實(shí)現(xiàn)高通量篩選。特異性噬菌體 得到富集后，對(duì)其進(jìn)行基因測(cè)序得到編碼序列，進(jìn)而進(jìn)行原核表達(dá)得到具有活性的納米抗 體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種針對(duì)Wasabi表位的納米抗體。同時(shí)提供該 納米抗體的編碼序列及該納米抗體在制備檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種Wasabi蛋白納米抗體，所述的Wasabi納米抗體的VHH鏈包括 框架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)，
[0008] 其中，
[0009] 所述的框架區(qū)包括以下4段氨基酸序列：如SEQ ID NO :1所示的FR1，如SEQ ID NO :2所示的FR2,如SEQ ID NO :3所示的FR3,如SEQ ID NO :4所示的FR4 ;所述的互補(bǔ)決 定區(qū)包括以下3段氨基酸序列：如SEQ ID NO :5所示的CDR1，如SEQ ID NO :6所示的CDR2， 如 SEQ ID NO :7 所示的 CDR3 ;
[0010] 或者，
[0011] 所述的框架區(qū)包括以下4段氨基酸序列：如SEQ ID NO :8所示的FR1，如SEQ ID N0:9所示的FR2,如SEQ ID N0:10所示的FR3,如SEQ ID N0:11所示的FR4;所述的互補(bǔ) 決定區(qū)包括以下3段氨基酸序列：如SEQ ID NO :12所示的⑶R1，如SEQ ID NO :13所示的 CDR2,如 SEQ ID NO :14 所示的 CDR3。
[0012] -種Wasabi蛋白納米抗體，所述Wasabi納米抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO : 15 或者SEQ ID NO : 16所示。
[0013] 一種編碼Wasabi蛋白納米抗體的基因，其核苷酸序列，如SEQ ID NO :17或者SEQ ID NO : 18 所示。
[0014] 一種重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒中包含SEQ ID NO :17或SEQ ID NO :18所示核苷酸序 列。
[0015] 一種重組細(xì)胞，該重組細(xì)胞中包含SEQ ID NO : 17或SEQ ID NO : 18所示核苷酸序 列。
[0016] 上述Wasabi蛋白納米抗體的制備方法，包括如下步驟：
[0017] (1)將Wasabi蛋白納米抗體的核苷酸序列克隆至表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒，將 該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，誘導(dǎo)表達(dá)納米抗體蛋白；所述的宿主菌包括大腸桿菌、酵母等常用 的基因工程表達(dá)宿主；
[0018] (2)從宿主菌中純化Wasabi蛋白納米抗體。
[0019] 步驟（1)中，所述的表達(dá)載體為PET32b，所述的宿主菌優(yōu)選大腸桿菌。
[0020] 步驟（2)中，利用Ni-IDA親和層析的方法純化Wasabi蛋白納米抗體。
[0021] 上述Wasabi蛋白納米抗體在檢測(cè)Wasabi蛋白中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之 內(nèi)。
[0022] 其中，所述的Wasabi蛋白為Wasabi標(biāo)準(zhǔn)蛋白或Wasabi融合蛋白，采用雙抗體夾 心酶聯(lián)免疫吸附的方法檢測(cè)Wasabi蛋白。
[0023] 具體的方法如下：
[0024] 將Wasabi蛋白納米抗體作為包被抗體，用包被緩沖液（50mmol/L Na2CO3-NaHCO3, pH 9. 6)稀釋至5ug/ml，ELISA板每孔加200ul，4°C包被過夜。TBST洗ELISA板3次，加入 0. 5% BSA封閉液，室溫封閉一小時(shí)。丟棄封閉液并用TBST洗3次，對(duì)照孔中加入梯度稀釋 的Wasabi標(biāo)準(zhǔn)蛋白，實(shí)驗(yàn)孔中加入待測(cè)樣品Wasabi融合蛋白，室溫孵育一小時(shí)。TBST洗 板3次，每孔加入200ul，I :500稀釋的檢測(cè)抗體（兔抗Wasabi多克隆抗體），室溫孵育一 小時(shí)。TBST洗板3次后，加入1:2000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔抗體，200 μ 1/孔，室溫孵育一 小時(shí)。TBST洗板3次后，每孔加入IOOul顯色液，室溫避光反應(yīng)20分鐘，ELISA板置于酶標(biāo) 儀上，測(cè)吸光值。
[0025] 有益效果：
[0026] (1)本發(fā)明中公開了兩種Wasabi蛋白納米抗體及其基因序列，這兩種基因均能在 大腸桿菌中表達(dá)，得到可溶的蛋白。
[0027] (2)利用Ni-IDA親和層析的方法，從大腸桿菌中純化得到兩種Wasabi蛋白納米抗 體，Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示：Wasabi蛋白納米抗體對(duì)Wasabi蛋白有很好的特異性，且 具有很尚的效價(jià)。
[0028] (3)將得到的Wasabi蛋白納米抗體作為包被抗體，用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附的 方法檢測(cè)能準(zhǔn)確定量檢測(cè)Wasabi融合蛋白，該方法具有操作簡(jiǎn)便、高特異性、高靈敏度等 優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0029] 圖1是Western Blot檢測(cè)Wasabi蛋白多克隆抗體的特異性圖：1為20ug Wasabi 蛋白上樣量；2為5ug Wasabi蛋白上樣量。
[0030] 圖2是nest-PCRl產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖：M為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；1為nest-PCRl產(chǎn) 物。
[0031] 圖3是nest-PCR2產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖：M為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；1為nest-PCR2產(chǎn) 物即擴(kuò)增所得的VHH片段。
[0032] 圖4是Wasabi蛋白納米抗體文庫(kù)的多樣性鑒定圖：M為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；1-29是 Wasabi蛋白納米抗體文庫(kù)中隨機(jī)挑選的單克隆噬菌體PCR產(chǎn)物。
[0033] 圖5是Wasabi蛋白納米抗體1誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖：M為蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)； 1為未誘導(dǎo)全菌總蛋白；2為誘導(dǎo)全菌總蛋白；3為超聲上清；4為鎳柱純化后蛋白。
[0034] 圖6是Wasabi蛋白納米抗體2誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖：M為蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)； 1為誘導(dǎo)菌的超聲破碎上清，2為鎳柱純化后蛋白。
[0035] 圖7是Western Blot檢測(cè)Wasabi蛋白納米抗體1的特異性圖：M為蛋白分子標(biāo) 準(zhǔn)；1為5 μ g Wasabi蛋白上樣量；2為1 μ g Wasabi蛋白上樣量；3為0. 1 μ g Wasabi蛋白 上樣量。
[0036] 圖8是Western Blot檢測(cè)Wasabi蛋白納米抗體2的特異性圖：M為蛋白分子標(biāo) 準(zhǔn)；1為5 μ g Wasabi蛋白上樣量；2為1 μ g Wasabi蛋白上樣量；3為0. 1 μ g Wasabi蛋白 上樣量。
[0037] 圖9是Wasabi蛋白的Elisa光吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性范圍是l-100ng/ml。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0039] 實(shí)施例1 :Wasabi蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化。
[0040] (I)Wasabi蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：
[0041] 首先將pNCS-Wasabi中的Wasabi片段亞克隆至pET28a ;成功構(gòu)建好的 pET28a-Wasabi載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，獲得pET28a-Wasabi重組菌，挑選單 克隆于卡那霉素（50μg/ml)液體LB中，37°C培養(yǎng)過夜；然后以I :100接種于含卡那霉素 (50 μ g/ml)液體LB中，37°C培養(yǎng)L 5~2h，當(dāng)菌液OD6。。為0· 6~0· 8時(shí)，加入IPTG (工作 濃度為lmmol/L)，于恒溫?fù)u床中37°C誘導(dǎo)表達(dá)4h ;4°C，3000g離心菌液獲得菌體沉淀，可看 到菌體有明顯的綠色；菌體用裂解緩沖液（50mmol/L Tris-Hcl pH7.8,300mmol/L Nacl)重 懸，置于冰盒內(nèi)超聲破碎，12000rpm，IOmin離心收集上清。
[0042] (2)通過Ni-IDA親和層析的方法獲得純化的Wasabi蛋白：
[0043] 層析柱首先用菌體緩沖液清洗，加入Ni-IDA填充層析柱；將上述菌體