一種治療肝癌的增效納米藥物組合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種治療肝癌的增效納米藥物組合物及其制備方法。更具體地講，本發(fā)明通過采用生物技術(shù)手段干預(yù)細胞自噬或調(diào)控氧化壓力，增強對肝癌細胞的殺傷效果；該組合物可作為肝癌治療藥物的輔料或添加劑。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)報道,肝細胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma)是目前世界上第六大流行性癌癥，統(tǒng)計顯示，每年約有50萬人被診斷為肝細胞性肝癌(Forner A, Llovet JM, BruixJ.Hepatocellular carcinoma.Lancet.2012;379:1245-55.do1:10.1016/S0140-6736(11)61347-0S0140-6736 (11) 61347-0)。盡管包括手術(shù)治療、化療和放射性治療在內(nèi)的多種治療手段已廣泛應(yīng)用于肝細胞性肝癌的治療，但由于肝細胞系肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的高發(fā)生率以及低生存率，導(dǎo)致肝細胞性肝癌成為世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的第三大原因(Li F，GuoZj Wang H.1nfluencing elements and treatment strategies associated with therelapse of hepatocellular carcinoma after surgery.Hepatogastroenterology.2013;60:1148-55.do1:10.5754/hgel21124)。因此，開發(fā)有效的治療藥物與方法迫在眉睫。
[0003]研究顯示，納米技術(shù)廣泛應(yīng)用于增強藥物和基因等多種治療制劑有效遞送。納米顆粒裝備靶向肝臟組織上過表達的受體，可實現(xiàn)藥物的肝臟靶向治療(Mishra N，YadavNP，Rai VKj Sinha P,Yadav KSj Jain S，et al.Efficient hepatic delivery ofdrugs:novel strategies and their significance.B1med Res Int.2013;2013:382184.do1:10.1155/2013/382184;Duan F，Lam MG.Delivery approaches of gene therapy inhepatocellular carcinoma.Anticancer Res.2013;33:4711-8.do1:33/11/4711)。 樹枝狀大分子具有乙二胺內(nèi)核和重復(fù)的酰胺-胺分枝，具備良好的裝載DNA和蛋白質(zhì)的能力，是目前藥物遞送材料中最具發(fā)展前景的載體(Xu Qj Wang CHj Pack DW.Polymericcarriers for gene delivery: chitosan and poly (amidoamine)dendrimers.CurrPharm Des.2010; 16:2350-68.do 1: BSP/CPD/E-Pub/000132)。已有研究證實表皮生長因子與樹枝狀大分子形成的偶聯(lián)物可有效地實現(xiàn)基因向肝癌細胞的靶向遞送(YuH，Nie Y，Dohmen C，Li Y, Wagner E.Epidermal growth factor—PEG funct1nalizedPAMAM-pentaethylenehexamine dendron for targeted gene delivery produced byclick chemistry.B1macromolecules.2011;12:2039-47.do1:10.1021/bml01464n)。
[0004]細胞自噬(autophagy)是原核和真核生物中進化保守的對細胞內(nèi)物質(zhì)進行周轉(zhuǎn)的重要過程，負責講解細胞內(nèi)長壽蛋白及損傷的細胞器等，是維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要手段(Levine B, Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease.Cell2008; 132:27-42.) 0細胞自噬的主要特征是雙層膜結(jié)構(gòu)的形成，其發(fā)生與mTORCl的抑制，自噬相關(guān)蛋白(Atgs)的表達及相關(guān)信號通路的激活密切相關(guān)(Corradetti MN, GuanKL.Upstream of the mammalian target of rapamycin:do all roads pass throughmT0R?0ncogene2006;25:6347-6360.He C，Kl1nsky DJ.Regulat1n mechanisms andsignaling pathways of autophagy.Annu Rev Genet 2009;43:67-93.)。細胞自嗷(autophagy)又叫II型程序性死亡(type II programmed cell death)，是真核生物體內(nèi)常見的“自我消化”(cellular degradat1n)的現(xiàn)象，能分解細胞內(nèi)受損或多余的細胞器和蛋白產(chǎn)生核苷酸，氨基酸等小分子物質(zhì)供細胞合成新的蛋白質(zhì)，并能維持細胞內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定。近年來隨著分子生物學及基因技術(shù)的發(fā)展和對細胞自噬的深入認識，發(fā)現(xiàn)其與多種疾病，尤其是腫瘤的發(fā)展關(guān)系密切。根據(jù)細胞內(nèi)底物運送到溶酶體腔內(nèi)方式的不同，哺乳動物細胞自卩遼可分為三種方式:大自曬(macroautophagy)、小自卩遼(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自卩遼(chaperone-mediated autophagy, CMA)。主要概述的大自卩遼(以下簡稱自曬)與腫瘤發(fā)展及治療關(guān)系最為密切(Sridhar S, Botbol Y, Macian F, et al.Autophagyand disease:always two sides to a problem.J Pathol.2012;226(2):255-73.)。自噬是胞漿大分子物質(zhì)和細胞器在雙層膜包囊泡中大量降解的生物學過程。該過程大致能分為4個階段:1.在饑餓、缺氧、藥物干擾等某些因素的刺激下，自噬泡的雙層膜結(jié)構(gòu)開始逐漸形成并包圍在被降解物的周圍；2.自噬泡完全成型并將要被降解的物質(zhì)完全隔離于細胞質(zhì)；3.自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體；4.自噬溶酶體最終被溶酶體中的水解酶溶解，降解產(chǎn)物可以在細胞內(nèi)再循環(huán)利用。(Martinez-Borra J, Lopez-LarreaC.Autophagy and self-defense.Adv Exp Med B1l.2012; 738:169-84.)。自卩遼能對細胞對外部環(huán)境改變及各種刺激產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。細胞在生長條件下能發(fā)生較低水平的自噬，稱基礎(chǔ)自噬。然而，一旦受到外界的刺激，如饑餓、缺氧、高溫、高細胞密度或是生長因子剝奪等，細胞自噬的水平將會迅速上調(diào)。如在營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的情況下，細胞自噬能分解體內(nèi)壞死細胞器產(chǎn)生氨基酸等供細胞合成新的蛋白質(zhì)，維持細胞的存活(①Piacentini M, D’ElettoM，F(xiàn)alasca L，et al.Transglutaminase2at the crossroads between cell death andsurvival.Adv Enzymol Relat Areas Mol B1l.2011;78:197-246 ;② Cook KL, ShajahanAN, Clarke R.Autophagy and endocrine resistance in breast cancer.Expert RevAnticancer Ther.2011; 11 (8): 1283-94.；(3) Wirawan E, Vanden Berghe T，Lippens S，etal.Autophagy: for better or for worse.Cell Res.2012; 22(1):43-61.) 0
[0005]自噬能降解折疊錯誤的蛋白質(zhì)、損傷的細胞器等，延緩機體衰老的發(fā)生。研究表明，大量衰老性疾病，如神經(jīng)退行性疾病和惡性腫瘤都與細胞自噬密切相關(guān)(① Martinez-Borra J,Lopez-Larrea C.Autophagy and self-defense.Adv Exp MedB1l.2012;738:169-84.;② Caballero B，Coto-Montes A.An insight into the roleof autophagy in cell responses in the aging and neurodegenerative brain.Histol Histopathol.2012;27(3):263-75.；③ Mendelsohn AR, Larrick JW.Rapamycinas an antiaging therapeutic?: targeting mammalian target of rapamycin totreat Hutchinson—Gilford progeria andneurodegenerative diseases.Rejuvenat1nRes.2011:14(4):437-41.)。
[0006]細胞自噬在生物體的發(fā)育和分化過程中起了重要作用。據(jù)報道，自噬基因缺失或者突變的線蟲生長發(fā)育缺陷、衰老加速并縮短壽命；并且自噬也參與果蠅變態(tài)的發(fā)生。此外自嗷在哺乳動物成年個體組織器官發(fā)育和分化中也起了重要作用(Mizushima N, KomatsuM.Autophagy:renovat1n of cells and tissues.Cell.2011;147 (4):728-41.)。
[0007]此外作為程序性細胞死亡的一種，細胞自噬能通過多種途徑直接或是間接導(dǎo)致細胞死亡。(Denton D, Nicolson S，Kumar S.Cell death by autophagy:facts and apparentartefacts.Cell Death Differ.2012;19(1):87-95.)。
[0008]細胞在一些特定的條件下，由于一系列因素的影響導(dǎo)致了各類基因突變從而導(dǎo)致的細胞各類遺傳性狀及功能改變。這類改變可能將具有正常功能和特性的細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹至蜒杆?、抗凋亡等惡性特征的細胞即癌細胞。研究表明，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展和自噬的關(guān)系極為密切。
[0009]一般來說，由于細胞自噬有利于細胞的存活，因此無論在正常細胞或是腫瘤細胞中，自噬都普遍被保留下來，并且在一般情況下都維持著基礎(chǔ)自噬。但是自噬究竟是抑制還是促進腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展目前尚沒有定論。自噬初期可以作為腫瘤發(fā)生的一種抑制因素，一些已知的腫瘤抑制因子，例如PTEN、TSC1和TSC2能激活自噬，并且對自噬的抑制可使蛋白降解減少，合成代謝增加，最終導(dǎo)致原癌細胞持續(xù)增殖。大多數(shù)腫瘤細胞(如肝、胰腺、乳腺癌等)盡管癌變前自噬能力各有不同，但是在癌變之后其自噬能力均減弱。自曬缺乏可引起自曬底物p62積聚，通過NF-k B信號途徑引起腫瘤形成(TrocoliA, Djavaher1-Mergny M.The complex interplay between autophagy and NF-k Bsignaling pathways in cancer cells.Am J Cancer Res.2011; 1 (5):629-49.)。然而在腫瘤生長到一定程度時，尤其是當腫瘤內(nèi)還沒有形成足夠的血管為其擴增提供營養(yǎng)時，腫瘤細胞也可以通過自噬來克服營養(yǎng)缺乏和低氧的環(huán)境得以生存。研究表明，在缺乏血清或氨基酸的情況下約3h，HeLa細胞中的自噬部分從4%上升到37%。這也說明了在營養(yǎng)缺乏等條件下自卩遼也是腫瘤細胞的一種自我保護的機制(Baldwin AS.Regulat1n of celldeath and autophagy by IKK and NF-