抗vegfr2人源納米抗體ntv1及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種VEGFR2納米抗體、該抗體 的制備方法以及該抗體在制備抗癌癥藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類(lèi)健康、威脅人類(lèi)生命的主要疾病之一，截止2012 年，全世界有超過(guò)820萬(wàn)人死于癌癥，世界衛(wèi)生組織和各國(guó)政府衛(wèi)生部門(mén)都把攻克癌癥列 為一項(xiàng)首要任務(wù)。但是腫瘤的治療仍然是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的難題，研究人員一直在尋找腫瘤治 療的新方向。通過(guò)研究腫瘤發(fā)現(xiàn)，血管生成是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的必要條件，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子受體（vascularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGFR)作為血管生成關(guān)鍵因 子VEGF的受體也成為抗腫瘤藥物的靶向的研究熱點(diǎn)。
[0003]腫瘤血管為腫瘤的生長(zhǎng)提供了充足的營(yíng)養(yǎng)供給，同時(shí)也促進(jìn)了癌細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn) 移。VEGF是主要作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加微血管通 透性、誘導(dǎo)血管生成等多種功能。已有研究證實(shí)VEGF的高表達(dá)與實(shí)體腫瘤的形成及其轉(zhuǎn) 移、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、動(dòng)脈硬化等疾病有著密切關(guān)系。VEGF通過(guò) 與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的特異性受體VEGFR結(jié)合來(lái)激活信號(hào)傳導(dǎo)。VEGFR家族的成員包括： VEGFRl、VEGFR2和VEGFR3。它們均為跨膜蛋白，由胞外的7個(gè)免疫球蛋白樣的功能域、胞內(nèi) 的酪氨酸激酶功能域和中間的一段跨膜序列組成。其中VEGFR2定位于人4qll_12,由1356 個(gè)氨基酸構(gòu)成，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及增加毛細(xì)血管通透性。研究已經(jīng)證實(shí)，腫 瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂與腫瘤微血管的滲透性主要是通過(guò)VEGF與VEGFR2的相互作用 而發(fā)生的。VEGFR2在健康的成人身體內(nèi)表達(dá)水平很低甚至不表達(dá)；而在許多腫瘤中，例如 乳腺癌、肺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、肝細(xì)胞癌、成血管細(xì)胞瘤、腦膠質(zhì)瘤等的腫瘤血管內(nèi) 皮細(xì)胞中是高表達(dá)的。另外，VEGFR2胞外區(qū)部分缺失實(shí)驗(yàn)證實(shí)：VEGF主要是通過(guò)與VEGFR2 胞外的I-III區(qū)特異性結(jié)合來(lái)發(fā)生信號(hào)傳導(dǎo)的。
[0004] 自從Kohler和Milstein發(fā)明雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體以來(lái)的幾十年中，抗體 已被廣泛應(yīng)用于臨床疾病的診斷和治療。目前治療性單克隆抗體藥物已經(jīng)成為生物制藥中 增長(zhǎng)最快的領(lǐng)域，單抗藥物以靶向性強(qiáng)、療效明確、副作用小等優(yōu)勢(shì)在自身免疫性疾病、癌 癥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。其中，抗腫瘤血管生成抗體具有靶向性、特異性、專(zhuān)一性等特性，能特異 性阻斷腫瘤血管的發(fā)生發(fā)展，降低對(duì)其他組織的殺傷作用。目前用于臨床的抗腫瘤血管生 成的抗體藥物貝伐單抗（bevacizumab，Avastin)于2004年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于非小細(xì)胞 肺癌的治療，并在其他腫瘤的治療中表現(xiàn)出良好的療效。然而，由于其對(duì)VEGFRl和VEGFR3 的也有抑制作用，全面阻斷了VEGF介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致患者出現(xiàn)高血壓、鼻出血、蛋 白尿等嚴(yán)重不良反應(yīng)。駱駝體內(nèi)天然存在缺失輕鏈的重鏈抗體，其可變區(qū)是最小的功能性 抗原結(jié)合片段。一般來(lái)說(shuō)，這類(lèi)抗體的相對(duì)分子質(zhì)量為15KDa，僅為常規(guī)抗體的1/10,其分 子高度為4. 8nm，直徑為2. 2nm，故稱(chēng)為納米抗體（nanobody)。納米抗體作為最小的功能性 抗原結(jié)合片段，獨(dú)特的生物學(xué)結(jié)構(gòu)特征賦予了它們?cè)S多優(yōu)勢(shì)，如穩(wěn)定性強(qiáng)、可溶性好、免疫 原性低、容易表達(dá)等等。納米抗體含有3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（complementaritydetermining regions，⑶Rs)。從納米抗體的立體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，較長(zhǎng)的⑶R3與相鄰的⑶Rl或⑶R2由二硫 鍵連接成環(huán)來(lái)穩(wěn)定構(gòu)象。傳統(tǒng)抗體Fab片段及單鏈抗體ScFv抗體的抗原結(jié)合區(qū)形成凹形 的或平面結(jié)構(gòu)，只能識(shí)別位于抗原表面的位點(diǎn)，而重鏈抗體的CDR3較長(zhǎng)，可形成穩(wěn)定的大 凸環(huán)結(jié)構(gòu)，深入具有裂縫凹陷結(jié)構(gòu)的抗原內(nèi)部，例如酶的活性位點(diǎn)、病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合位 點(diǎn)等。因此納米抗體具有更加廣泛的抗原結(jié)合力。其次，納米抗體的CDRl區(qū)和骨架區(qū)存在 半胱氨酸殘基（Cys)，可以和CDR3區(qū)中的Cys殘基形成二硫橋，增加了可變區(qū)的穩(wěn)定性和結(jié) 構(gòu)變化。另外，納米抗體具有分子量小、穿透力較強(qiáng)并且可以制備成多功能抗體或者攜帶化 藥等特點(diǎn)，使得這類(lèi)抗體在對(duì)實(shí)體瘤和需要穿過(guò)血腦屏障疾病的治療中具有顯著優(yōu)勢(shì)。除 此之外，隨機(jī)突變及噬菌體展示等技術(shù)的引入也使得納米抗體文庫(kù)的構(gòu)建及特異性納米抗 體的篩選過(guò)程變得更加便捷、高效。VEGFR2是最重要的藥物靶點(diǎn)之一，具有廣闊的研發(fā)前景 和重要的現(xiàn)實(shí)意義。然而，傳統(tǒng)抗體親和力成熟、蛋白表達(dá)純化和生物效應(yīng)的技術(shù)瓶頸嚴(yán)重 的限制了VEGFR2抗體藥物的研發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的之一是提供一種具有高親和力和良好抗腫 瘤活性的、高效、毒副作用低且易于生產(chǎn)的抗VEGFR2人源納米抗體。
[0006] 本發(fā)明另一方面的目的是提供一種制備上述抗體的方法。
[0007] 本發(fā)明又一方面的目的是提供上述抗體在制備用于治療抗腫瘤藥物中的用途。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0009] 本發(fā)明提供一種抗VEGFR2人源納米抗體，包括框架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)，其特征在 于，所述納米抗體具有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列。
[0010] 本發(fā)明還提供一種制備抗VEGFR2納米抗體的制備方法，包括以下步驟：
[0011] a.采用噬菌體展示技術(shù)篩選出與VEGFR2結(jié)合的納米抗體，并通過(guò)基因比對(duì)分析， 挑選出重復(fù)最高的序列；
[0012] b.將上一步篩選出的納米抗體重新構(gòu)建于表達(dá)載體中，并采用原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 表達(dá)，獲得商純度蛋白；以及
[0013] c.采用AlphaScreen技術(shù)從上一步篩選出的納米抗體中進(jìn)一步篩選出的親和力 最1?的抗體。
[0014] 下面對(duì)上述步驟進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
[0015]a.采用噬菌體展示技術(shù)篩選與VEGFR2結(jié)合的納米抗體
[0016] 優(yōu)選地，首先采用生物淘選技術(shù)篩選陽(yáng)性噬菌體，并將陽(yáng)性克隆在宿主菌TGl中 擴(kuò)增富集；然后進(jìn)行陽(yáng)性克隆DNA序列測(cè)定、基因比對(duì)分析，從中挑選出重復(fù)最高的序列。[0017] 更優(yōu)選地，首先采用液相淘選技術(shù)將抗原固定在磁珠表面，加入含有人源納米抗 體庫(kù)的結(jié)合液中，篩選陽(yáng)性噬菌體，并將陽(yáng)性克隆在宿主菌TGl中擴(kuò)增富集，優(yōu)選地，所述 擴(kuò)增進(jìn)行4輪；然后在最后兩輪淘選中隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行基因測(cè)序及基因比對(duì)分析， 從中挑選出重復(fù)次數(shù)最高的序列。
[0018]b.納米抗體的表達(dá)純化
[0019] 優(yōu)選地，將挑選出的序列應(yīng)用NotI和BamHI限制性?xún)?nèi)切酶及DNA重組技術(shù)將酶 切后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入攜帶6His-sum〇標(biāo)簽的酶切線性化的pET載體中，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒； 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，誘導(dǎo)表達(dá)；收集細(xì)菌沉淀，超聲法充分裂解細(xì)菌，取 上清，為粗提蛋白；粗提蛋白經(jīng)過(guò)鎳親和柱及分子篩柱，得到純化蛋白樣品；用電泳檢測(cè)目 的蛋白的表達(dá)，對(duì)出現(xiàn)頻率較高的克隆進(jìn)行原核系統(tǒng)表達(dá)純化。
[0020] c.納米抗體親和力篩選優(yōu)選地，采用AlphaScreen技術(shù)測(cè)定抗原和抗體間的相互 作用，進(jìn)一步篩選出的親和力最高的抗體。
[0021] 本發(fā)明還提供以上所述的抗VEGFR2人源納米抗體在制備用于抗癌癥藥物中的用 途。
[0022] 其中，所述癌癥包括乳腺癌、肺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、肝細(xì)胞癌、成血管細(xì)胞 瘤、腦膠質(zhì)瘤。
[0023] 本發(fā)明人通過(guò)深入研究VEGFR2乃至整個(gè)VEGFRs受體家族配體識(shí)別和受體活化的 機(jī)制，首次采用噬菌體展示技術(shù)篩選出富集人源化納米抗體并對(duì)其進(jìn)行基因測(cè)序及蛋白表 達(dá)純化；進(jìn)一步通過(guò)AlphaScreen技術(shù)篩選出與抗原具有較高結(jié)合力的納米抗體；得到了 具有更高親和力和良好抗腫瘤活性的人源納米抗體NTVl。通過(guò)表面等離子共振（SPR)技術(shù) 表征該抗體的動(dòng)力學(xué)行為；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力及抑制血管新生 活性。本發(fā)明表達(dá)并優(yōu)化獲得親和力高且穩(wěn)定均一的VEGFR2納米抗體蛋白，成功研發(fā)人源 抗VEGFR2納米抗體藥物，開(kāi)辟了靶向VEGFR2抗體的藥物研發(fā)的新領(lǐng)域，具有深遠(yuǎn)的社會(huì)意 義和廣闊的臨床應(yīng)用前景。并且，本發(fā)明為相關(guān)后續(xù)藥物研發(fā)提供了基礎(chǔ)，可以據(jù)此研發(fā)攜 帶化藥或者融合Fc的抗體以增加療效。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1:顯示NTV(1-4)四種納米抗體氨基酸序列比對(duì)。將抗體的基因序列翻譯成氨 基酸序列，進(jìn)行多序列比對(duì)。未標(biāo)記的是互補(bǔ)決定區(qū)，標(biāo)記的是框架區(qū)。
[0025] 圖2:顯示NTV(l-4)蛋白的表達(dá)純化。10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)蛋白純度， 標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)在凝膠左側(cè)。從左到右分別為NTVl、NTV2、NTV3、NTV4。
[0026]圖 3=AlphaScreen檢測(cè)VEGFR2D3 和NTV(1-4)之間的反應(yīng)。（A)AlphaScreen反 應(yīng)示意圖，（B_E)NTV1、NTV2、NTV3、NTV4 與VEGFR2D3 反應(yīng)的AlphaScreen檢測(cè)結(jié)果。圖 4: SPR分析NTVl和VEGFR2D3反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。
[0027] 圖5 :NTV1對(duì)人臍靜脈細(xì)胞增殖的效應(yīng)。
[0028] 圖6 :NTV1體外抑制HUVEC血管形成效應(yīng)。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例所用實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)材料信息如下：
[0030] 試劑及試劑盒
[0031] 質(zhì)粒小提試劑盒 百泰克
[0032]PCR產(chǎn)物回收試劑盒 百泰克
[0033] 瓊脂糖凝膠回收試劑盒 百泰克
[0034] 瓊脂糖生工
[0035]蛋白胨sigma
[0036] 酵母提取物sigma
[0037]Tris-basesigma
[0038]生物素 sigma
[0039]咪唑 sigma
[0040]內(nèi)切酶BamHlNEB
[0041]內(nèi)切酶NotlNEB
[0042]T4DNA連接酶Fermentas
[0043]Q5~HighFidelityDNApolymeraseNEB
[0044]麥芽糖 sigma
[0045]嗤菌體展不庫(kù)HuSdLTMCreativeBioLabs
[0046]輔助嗤菌體M13K07helperphageGEHealthcare
[0047]磁珠DyiUlbeads拉MyOne?StreptavidinCllifetechnologies
[0048]IPTG 生工
[0049]PEG8000 sigma
[0050]SDSsigma
[0051]Tween-20 國(guó)藥
[0052]BiotinCAPtureKitSeriesSGEHealthcare
[0053]AlphascreenHistidineDetectionKitPerkinElmer
[0054] 儀器設(shè)備
[0055]AKTAFPLC系統(tǒng)（GE)
[0056]NanoVuespectrophotometer(GE)
[0057]centrifuges5415R(Eppendorf)
[0058]SorvallRC12BPcentrifuge(Thermo)
[0059]avantiJ-26xp(BECKMANCOULTER)
[0060]Incubator/shakerfor2Lbacterialcultures(Thermo)
[0061] 層析冷柜（北京德天佑）
[0062]PCR machines(Eppendorf)
[006