本發(fā)明涉及抗CD3單域抗體（sdAb）及其氨基酸、核苷酸編碼序列。本發(fā)明還涉及包含該核苷酸編碼序列的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：自1975年單克隆抗體技術(shù)問世之后，抗原特異性的抗體已改變了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的多個(gè)方面。除了作為重要性的研究工具，單克隆抗體的可用性為發(fā)展人類疾病的診斷和新療法開辟了道路。然而，單克隆抗體在應(yīng)用范圍上有技術(shù)上的限制和缺點(diǎn)，例如基于哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)較昂貴。在過去的幾十年，一系列的新技術(shù)和方法用于改善傳統(tǒng)抗體的性能，尤其是在腫瘤治療中。例如，給現(xiàn)有抗體加有毒的化合物，包括放射性同位素被鏈接到單克隆抗體。然而，甚至直到今天，臨床使用單克隆抗體量仍然很少。另一個(gè)提高腫瘤殺滅效率的方法是使用雙特異性的抗體，將免疫細(xì)胞引到腫瘤細(xì)胞，從而殺死腫瘤細(xì)胞。而最常用的是使用抗CD3抗體將T細(xì)胞引到腫瘤細(xì)胞。它是通過同時(shí)綁定CD3和腫瘤細(xì)胞的表面抗原(TAA)，這種雙特異性抗體可以能夠觸發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞溶解。CD3（群集分化3）T細(xì)胞受體有助于激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞。它是由四個(gè)不同的鏈組成的一種復(fù)雜的蛋白質(zhì)。在哺乳動(dòng)物中，包含CD3γ鏈、CD3δ鏈和兩個(gè)CD3ε鏈。很多雙特異性抗體使用單鏈抗體。單鏈抗體是從傳統(tǒng)的IgG分子得到的完整的最小的抗原結(jié)合片段。不幸的是，細(xì)菌表達(dá)的scFvs產(chǎn)量很低。駱駝和羊駝包含一種獨(dú)特類型的抗體，這類抗體缺乏輕鏈。因?yàn)楸瘸Ｒ?guī)抗體缺失CH1，這些所謂的重鏈抗體有較低的分子量。這類免疫球蛋白可變的重鏈簡(jiǎn)稱VHH，以區(qū)別于經(jīng)典的重鏈可變區(qū)。因此，單個(gè)域VHH是最小可用完整抗原結(jié)合15kDa片段，被稱為納米抗體。納米抗體與Fab、Fv或單鏈抗體相比，有一些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如更穩(wěn)定、更易于在細(xì)菌表達(dá)。現(xiàn)有技術(shù)中抗CD3抗體形式單一并且不能滿足實(shí)際需求，因此有必要開發(fā)出更多的抗CD3抗體，從而為生產(chǎn)和設(shè)計(jì)功能蛋白提供更多的選擇。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明一方面涉及一種抗CD3單域抗體，其氨基酸序列選自SEQIDNO.1和SEQIDNO.3。本發(fā)明另一方面涉及一種編碼本發(fā)明的抗CD3單域抗體的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，該核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本發(fā)明再一個(gè)方面涉及一種表達(dá)載體，其包含本發(fā)明的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及包含該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞是大腸桿菌。本發(fā)明還涉及一種雙特異性抗體，其包含本發(fā)明所述的任一CD3單域抗體。本發(fā)明提供的抗CD3單域抗體拮抗人CD3εN-末端部分，這些抗體可以用于比如CD3的測(cè)定，以及其他需要CD3的功能蛋白，例如雙特異性抗體。附圖說明圖1是sdAb噬菌體展示庫的骨架圖。圖2顯示了血清效價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖3.淋巴細(xì)胞分離的總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。M泳道，DNA標(biāo)記物MarkerIII；第1-3泳道，分離自第一次抽血的淋巴細(xì)胞的總RNA；第4-7泳道，分離自第二次抽血的淋巴細(xì)胞的總RNA；第8-10泳道，分離自第三次抽血的淋巴細(xì)胞的總RNA。圖4.純化的VHHPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。M泳道，DNA標(biāo)記物MarkerIII；第1-8泳道，使用8對(duì)引物從第一次抽血的PBMC得到的純化的VHHPCR產(chǎn)物；第9-16泳道，使用8對(duì)引物從第二次抽血的PBMC得到的純化的VHHPCR產(chǎn)物；第17-24泳道，使用8對(duì)引物從第三次抽血的PBMC得到的純化的VHHPCR產(chǎn)物。圖5.sdAb噬菌體展示庫的插入率。使用M13R(-48)和M13F(-47)引物通過PCR擴(kuò)增96個(gè)隨機(jī)選取的文庫克隆。具有~1100bpDNA條帶的克隆具有VHH插入物。具體實(shí)施方式本發(fā)明現(xiàn)將結(jié)合以下實(shí)驗(yàn)及附圖進(jìn)一步闡釋，需要說明的是，這些實(shí)驗(yàn)例及附圖不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。1策略本發(fā)明通過噬菌體展示技術(shù)開發(fā)出了抗CD3的單域抗體，并且進(jìn)行了以下步驟：動(dòng)物免疫和免疫響應(yīng)測(cè)試、sdAb噬菌體展示庫的構(gòu)建、噬菌體展示淘選以及FASEBA篩選和FACS驗(yàn)證。2材料抗原蛋白：CD3-His蛋白(MP-5)抗原細(xì)胞系:Jurkat靶標(biāo)細(xì)胞,KPCN對(duì)照細(xì)胞TRIzol?Reagent(Ambion,Cat.No.:15596-026)PrimeScriptTM1stStrandcDNA合成試劑盒(Takara,Cat.No.:6110A)SfiI酶(NEB,Cat.No.:R0123S)宿主菌:E.coliSS320氨芐青霉素,100mg/ml異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),1MPBS:137mMNaCl,2.7mMKCl,4.3mMNa2HPO4,1.4mMKH2PO4,pH7.4ELISA微滴定板(Corning,Cat.No.:9018)包被緩沖液:0.05MNaHCO3,pH9.6封閉緩沖液(PBST):PBS緩沖液,pH7.4,加入5%脫脂奶粉洗滌緩沖液:PBS緩沖液,pH7.4,,加入0.05%Tween20M13KO7輔助噬菌體(NEB,Cat.No.:N0315S)HRP/抗M13單克隆抗體(GEHealthcare,Cat.No.:27-9421-01)羊抗駝IgG[HRP](NovusBiological,Cat.No.:NB7242)兔抗駝IgG[HRP](GenScript)FACSCalibur(BDBioscience,SanJose,CA)Flowjo:Flowjo7.6.1Minsoftware2×YT:16g胰蛋白胨,10g酵母提取物,5gNaCl溶解于1LddH2O.OctetRED96(ForteBio)SuperStreptavidin(SSA)DipandReadTMBiosensors(ForteBio)10mM甘氨酸-HCl,pH2.03方法3.1動(dòng)物免疫和免疫響應(yīng)測(cè)試3.1.1動(dòng)物免疫將CD3-His免疫原與佐劑或PBS混合并注射到美洲駝（llama）。在整個(gè)項(xiàng)目過程中，動(dòng)物被免疫五次。分別在免疫之前以及第4次和第5次免疫之后采集外周血樣品。梯度分離法分離出淋巴細(xì)胞。細(xì)胞中加入RNAlater并儲(chǔ)存于-80°C。離心加入了抗凝劑的血液得到血清，并儲(chǔ)存于-80°C。3.1.2免疫響應(yīng)測(cè)試使用血清樣品通過ELISA評(píng)價(jià)針對(duì)固定的免疫原的免疫響應(yīng)。評(píng)價(jià)了免疫前以及第4次和第5次免疫后的血清。抗原(CD3-His和CD34-Fc)分別稀釋于4μg/ml的包被緩沖液中。使用稀釋的抗原對(duì)微滴定板包被過夜，4°C。隨后，以洗滌緩沖液洗滌微滴定板3次，再于37°C用封閉緩沖液封閉2小時(shí)。再用洗滌緩沖液洗滌微滴定板4次。將一系列稀釋的血清加入板上，在37°C孵育2小時(shí)。隨后用洗滌緩沖液洗滌微滴定板4次。加入羊抗駝IgG[HRP]或兔抗駝IgG[HRP]，在37°C孵育1小時(shí)。洗滌后，反應(yīng)物中加入TMB底物反應(yīng)10分鐘，隨后加入1MHCl終止反應(yīng)。MK3分光計(jì)測(cè)定每孔在450nm的吸收值。3.2sdAb噬菌體展示庫的構(gòu)建3.2.1RNA提取根據(jù)TRIzol試劑手冊(cè)從分離的淋巴細(xì)胞（見3.1.1）中提取總RNA。凝膠電泳法以及OD260/280法對(duì)總RNA進(jìn)行定性和定量。3.2.2RT-PCR和VHH擴(kuò)增根據(jù)PrimeScriptTM1stStrandcDNA合成試劑盒的手冊(cè)使用oligo(dT)20引物將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)四個(gè)正義和兩個(gè)反義特異性簡(jiǎn)并引物來擴(kuò)增VHH片段，引入兩個(gè)SfiI限制性位點(diǎn)。根據(jù)GenScript標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）擴(kuò)增VHH片段。3.2.3展示庫擴(kuò)展使用不同引物對(duì)擴(kuò)增獲得VHHPCR產(chǎn)物。使用SfiI消化該P(yáng)CR產(chǎn)物并且通過凝膠純化。凝膠純化的片段被插入到GenScript自有的噬菌粒載體（圖1）中。構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性展示庫以優(yōu)化連接和轉(zhuǎn)化條件。優(yōu)化的連接和轉(zhuǎn)化條件被用來開發(fā)實(shí)際展示庫。一小部分轉(zhuǎn)化細(xì)胞被稀釋并劃線于具有100μg/ml氨芐青霉素的2×YT平板上。對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)算以計(jì)算文庫大小。隨機(jī)挑取陽性克隆并測(cè)序，以評(píng)估文庫的質(zhì)量。其余轉(zhuǎn)化細(xì)胞被劃線于具有100μg/ml氨芐青霉素和2%葡萄糖的?15cm2×YT平板上。從平板上刮去菌苔。小部分細(xì)胞被用于文庫質(zhì)粒分離。其余加入甘油，保存于-80°C備用。3.3噬菌體庫淘選3.3.1生物淘選使用GenScript開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)λ鶚?gòu)建的sdAb噬菌體庫進(jìn)行CD3-His蛋白的淘選。含有7.4×108個(gè)克隆（CFU）的大sdAb噬菌體展示庫被用于該篩選。文庫生長(zhǎng)于對(duì)數(shù)期，用M13KO7輔助噬菌體回收，并在具有100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素的2×YT培養(yǎng)板中于振蕩器上在30°C擴(kuò)增過夜。用PEG/NaCl使噬菌體沉淀，并重懸于PBS中，儲(chǔ)存于-80°C。為進(jìn)行噬菌體淘選，將微孔板(Pierce,Prod#15100)包被CD3-His，這是通過將它們以100μg/ml在PBS(pH7.0)中于4°C孵育過夜而實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，噬菌體顆粒被與含有2%脫脂奶粉的PBS封閉緩沖液在室溫下孵育1小時(shí)以阻斷非特異性結(jié)合。在用PBS漂洗3次后，將噬菌體顆粒加入微孔中，并在振蕩器上于室溫孵育1小時(shí)。孵育之后，通過用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）漂洗小孔6次隨后再用PBS漂洗2次來洗去未結(jié)合的以及非特異性結(jié)合的噬菌體。結(jié)合的噬菌體立即被用來在37°C感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coliTG1細(xì)胞（OD600約為0.5）1小時(shí)。每個(gè)淘選循環(huán)之后，將被感染的細(xì)胞與10%甘油混合，隨后儲(chǔ)存于-80°C。在進(jìn)行下一個(gè)循環(huán)的淘選時(shí)，將10ml的感染的E.coliTG1細(xì)胞儲(chǔ)液加入30ml含有200μg/ml氨芐青霉素和2%葡萄糖的培養(yǎng)基中，并生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期。培養(yǎng)物用M13KO7輔助噬菌體回收，擴(kuò)增并沉淀噬菌體，以用于下一輪篩選。如上所述重復(fù)常規(guī)噬菌體展示淘選。3.3.2噬菌體ELISA單個(gè)的輸出噬菌體克隆生長(zhǎng)于96深孔平板中并通過噬菌體ELISA篩選以確認(rèn)CD3-His特異性克隆。使用2μg/mlCD3-His包被96孔平板（在包被緩沖液中于4°C孵育過夜），以含有2%脫脂奶粉的PBS封閉。每孔加入約50μl的來自過夜細(xì)胞培養(yǎng)物的噬菌體上清液，并在4°C孵育2小時(shí)，隨后用PBST洗滌四次。未結(jié)合的sdAb噬菌體通過與HRP標(biāo)記的抗M13單抗在37°C孵育1小時(shí)來檢測(cè)。用PBST再洗滌孔四次，每個(gè)孔中加入底物溶液。在450nm處測(cè)定吸收值。3.4FASEBA篩選和FACS驗(yàn)證3.4.1FASEBA篩選和親和分級(jí)擴(kuò)增輸出噬菌體的編碼sdAb片段的DNA并插入到pFASEBA載體中以篩選出先導(dǎo)抗體。在96深孔平板中接種單個(gè)的FASEBA文庫克隆并誘導(dǎo)表達(dá)。進(jìn)行ELISA篩選以分離特異性識(shí)別CD3-His蛋白的sdAb，并且選擇用于Octet的親和分級(jí)的表達(dá)培養(yǎng)基。在OctetRED96儀器（ForteBio）上進(jìn)行解離速率篩選（Off-ratescreening）。所有測(cè)試都在30°C進(jìn)行。表達(dá)培養(yǎng)基中的sdAb-SASA蛋白被捕獲至包被BSA的生物傳感器并與CD3蛋白在溶液（1xPBS,pH7.4,0.05%Tween-20）中一起孵育。其中一種濃度（100nM）的CD3被用于解離速率分級(jí)。基線和解離步驟僅在緩沖液（1xPBS,pH7.4,0.05%Tween-20）中進(jìn)行。使用Fortebio數(shù)據(jù)處理軟件以動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析模式通過1:1Langmuir結(jié)合模式來測(cè)定結(jié)合動(dòng)力學(xué)。與CD3以高親和力相互作用的結(jié)合物被篩選出并進(jìn)行DNA測(cè)序。3.4.2FACS驗(yàn)證為了篩選出結(jié)合Jurkat細(xì)胞而不結(jié)合KPCN細(xì)胞的sdAb，對(duì)培養(yǎng)物上清液進(jìn)行流式細(xì)胞分析。Jurkat細(xì)胞和KPCN細(xì)胞生長(zhǎng)至70-80%融合率時(shí)通過離心來收集細(xì)胞。每孔接種約4×105個(gè)細(xì)胞，以PBS洗滌2次。向細(xì)胞中加入200μl的培養(yǎng)物上清液并在室溫下孵育1小時(shí)。用PBS洗滌后，向細(xì)胞中加入抗體以檢測(cè)結(jié)合的sdAb。30分鐘孵育后，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，并將細(xì)胞重懸于PBS。使用FACSCalibur(BDBioscience,SanJose,CA)和Flowjo軟件分析細(xì)胞的sdAb結(jié)合。4.結(jié)果4.1免疫響應(yīng)測(cè)試圖2顯示了血清效價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。免疫后第一次和第二次測(cè)試血清的效價(jià)比免疫前血清高得多。免疫后第一次和第二次測(cè)試血清的效價(jià)之間沒有觀察到顯著差異。4.2sdAb噬菌體展示庫構(gòu)建4.2.1總RNA提取從所有獲得淋巴細(xì)胞中分離出約449μg總RNA（圖3），約一半的總RNA被用來構(gòu)建高質(zhì)量文庫。4.2.2RT-PCR和VHH擴(kuò)增根據(jù)GenScript的SOP使用8對(duì)引物（4個(gè)正義引物x2個(gè)反義引物）進(jìn)行RT-PCR。使用不同引物對(duì)獲得的產(chǎn)物被混合在一起并進(jìn)行凝膠純化（圖4）。一共獲得約24μg純VHHPCR產(chǎn)物。一般的PCR產(chǎn)物被用于文庫構(gòu)建。4.2.3文庫擴(kuò)展至少7.4×107個(gè)轉(zhuǎn)化子可從一組電轉(zhuǎn)化中獲得，所以平行地進(jìn)行了10次轉(zhuǎn)化，以獲得最終的文庫。文庫大小約~7.4×108為。根據(jù)菌落篩選，插入率為97.92%(94/96)（圖5）。一共測(cè)序了72個(gè)克隆，64個(gè)克隆位于框內(nèi)。沒有一個(gè)具有相同的氨基酸序列（數(shù)據(jù)未示出），表明sdAb文庫具有高度的多樣性。4.3噬菌體文庫淘選進(jìn)行了兩輪淘選和噬菌體ELISA，表1列出了相關(guān)細(xì)節(jié)。表1.淘選和噬菌體ELISA實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)信息輪次輸入(pfu)輸出(pfu)噬菌體ELISA陽性率1st2.0×10113.0×105~5%2nd3.5×10109.7×107~51%4.4FASEBA篩選和FACS驗(yàn)證4.4.1FASEBA篩選和親和分級(jí)擴(kuò)增第二輪輸出噬菌體的編碼sdAb片段的DNA，并插入pFASEBA載體中以通過ELISA篩選先導(dǎo)抗體。通過FASEBAELISA篩選得到32個(gè)克隆。該32個(gè)克隆都進(jìn)行DNA測(cè)序，并進(jìn)行與CD3的結(jié)合測(cè)試，隨后通過OctetRED96進(jìn)行解離速率分析。結(jié)合FACS的結(jié)果（4.4.2），利用FortteBio數(shù)據(jù)分析軟件選擇出曲線中低解離部分的單獨(dú)克隆。表2顯示了所選擇的sdAb克隆的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。表2.sdAb克隆的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)SampleID序列號(hào)koff(1/s)A30238SEQIDNO.14.23E-05A30230SEQIDNO.32.66E-054.4.2FACS驗(yàn)證通過FACS來驗(yàn)證陽性培養(yǎng)物（來自4.4.1）上清液的Jurkat細(xì)胞結(jié)合，KPCN用作陰性對(duì)照細(xì)胞系。結(jié)合親和分級(jí)的結(jié)果（4.4.1），結(jié)合MFI列于表3。表3.培養(yǎng)物上清液與Jurkat細(xì)胞和KPCN細(xì)胞*的結(jié)合MFISampleA30230A30238NC-sdAbTG1Jurkat細(xì)胞210.03249.03115.03132.03KPCN細(xì)胞49.950.15154.5*:NC-sdAb(相同形式的非相關(guān)性sdAb)的培養(yǎng)物上清液被設(shè)置為陰性對(duì)照，TG1的培養(yǎng)物上清液被設(shè)置為背景對(duì)照。SEQUENCELISTING<110>中山大學(xué)<120>抗CD3單域抗體<130>16500CN<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>117<212>PRT<213>人工序列<400>1GlnValLysLeuGluGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyArgThrPheAspThrMet202530GlyTrpPheArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluPheValAlaAla354045ValArgTrpSerSerGlyAsnThrTyrTyrGlyAsnThrValLysGly505560ArgPheThrIleSerArgAspThrAlaThrAsnThrValTyrLeuGlu65707580MetAsnSerLeuLysHisGluAspAlaAlaValTyrTyrCysAlaAla859095ArgLeuAlaGlyArgGlyAlaAlaAspHisTrpGlyGlnGlyThrGln100105110ValThrValSerSer115<210>2<211>351<212>DNA<213>人工序列<400>2caggtaaagctggaggagtctgggggaggattggtgcaggctgggggctccctgagactc60tcctgtgcagcctctggacgcaccttcgataccatgggctggttccgccaggctccaggg120aaggagcgtgagtttgtagcagcggttagatggagtagtggtaatacatactatggaaac180accgtgaagggccgattcaccatctccagagacactgccacgaacacggtgtatctggaa240atgaacagtctgaaacatgaggacgcggccgtttattactgtgcagcccgattggctggt300aggggcgcggctgaccactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca351<210>3<211>117<212>PRT<213>人工序列<400>3GlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlu151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyArgThrPheAspThrMet202530GlyTrpPheArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluPheValAlaAla354045ValArgTrpSerSerGlyAsnThrTyrTyrGlyAsnThrValLysGly505560ArgPheThrIleSerArgAspThrAlaThrAsnThrValTyrLeuGln65707580MetAsnSerLeuLysHisGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaAla859095ArgLeuAlaGlyArgGlyAlaAlaAspHisTrpGlyGlnGlyThrGln100105110ValThrValSerSer115<210>4<211>351<212>DNA<213>人工序列<400>4caggtacagctggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctggggagtctctgagactc60tcctgtgcagcctctggacgcaccttcgataccatgggctggttccgccaggctccaggg120aaggagcgtgagtttgtagcagcggttagatggagtagtggcaatacatactatggaaac180accgtgaagggccgattcaccatctccagagacactgccacgaacacggtgtatctgcaa240atgaacagtctgaaacatgaggacacggccgtttattactgtgcggcccgattggctggt300aggggcgcggctgaccactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca351當(dāng)前第1頁1 2 3