本發(fā)明屬于腫瘤預(yù)后判斷領(lǐng)域，特別涉及一種轉(zhuǎn)錄因子HOXB9第27位乙?；稽c(diǎn)的特異性診斷性抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
：同源異形盒基因最初是在研究黑腹果蠅胚胎發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)的，該類基因的突變可導(dǎo)致真核生物某一器官異位生長(zhǎng)。人類HOX基因在結(jié)構(gòu)和功能上與果蠅的同源異型復(fù)合體高度同源，共有39個(gè)基因，根據(jù)序列的相似性及在染色體上的位置可以分為HOXA、HOXB、HOXC和HOXD四簇。HOXB9基因主要在胚胎發(fā)育晚期開放，主要控制體軸遠(yuǎn)端和神經(jīng)外胚層末端的發(fā)育，促進(jìn)細(xì)胞的分化和凋亡。異常表達(dá)的HOXB9正向調(diào)控肺癌、甲狀腺癌、乳腺癌、淋巴瘤等多種惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移。然而HOXB9在胃癌中卻被認(rèn)為是一種保護(hù)因素，HOXB9高表達(dá)是胃癌和結(jié)腸癌預(yù)后良好的一個(gè)重要的指標(biāo)。HOXB9在不同類型惡性腫瘤中發(fā)揮多面性的調(diào)節(jié)作用引起我們的關(guān)注。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)錄因子HOXB9第27位乙?；稽c(diǎn)的特異性診斷性抗體及其制備方法。通過本發(fā)明所述方法制備得到的抗體，可特異性的識(shí)別腫瘤標(biāo)本中HOXB9第27位氨基酸的乙?；牧?，從而判斷包括人食管癌、胃癌、肝癌、腎癌和結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的預(yù)后。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種轉(zhuǎn)錄因子HOXB9第27位乙?；稽c(diǎn)的特異性抗體的制備方法，包括以下步驟：1）人工合成SEDAPPAKFPSGQYAS序列多肽，并將K位點(diǎn)進(jìn)行乙酰化處理；2）利用步驟1）合成的多肽免疫兔獲得多克隆抗血清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）測(cè)定血清中抗體滴度，并對(duì)抗體進(jìn)行純化處理，即得到所述特異性抗體。進(jìn)一步的，步驟1）所述的K位點(diǎn)的乙?；幚硎褂玫囊阴；笧橘嚢彼嵋阴；?B（PCAF），是一個(gè)p53相關(guān)的轉(zhuǎn)錄共結(jié)合因子。我們是從一系列乙?；钢信懦鼵BP、P300、hMOF的作用，篩選出來的可以特異性乙?；疕OXB9第27位賴氨酸的酶。進(jìn)一步的，步驟2）中的免疫兔的具體過程為：分別于初次免疫28天后、42天后、56天后進(jìn)行三次加強(qiáng)免疫，用250μg27Ace-HOXB9多肽與等體積的弗氏不完全佐劑混勻，背部皮下多點(diǎn)注射；第三次加強(qiáng)免疫前取耳血，分離血清作為免疫后血清，采用ELISA測(cè)定血清中的抗體效價(jià)，當(dāng)抗體滴度達(dá)到106數(shù)量級(jí)時(shí)，頸動(dòng)脈放血，收集血清，即獲得所述的多克隆抗血清。進(jìn)一步的，步驟2）中所述的ELISA測(cè)定血清中抗體滴度，具體方法為：吸取適量0.1mol/L，pH9.5的碳酸緩沖液，稀釋步驟1）所述多肽至5mg/L，每孔50μl加入96孔板，4℃包被過夜；第二天移去包被液，稀釋緩沖液洗3次，每次5min；3％牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin，BSA），37℃封閉2h，依次與梯度稀釋的兔抗血清、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗，37℃分別反應(yīng)1h；稀釋緩沖液洗3次，每次5min；底物液避光顯色15min后，每孔加入50μl，2mol/L硫酸終止反應(yīng)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)儀讀取490nm吸光度值進(jìn)行分析。進(jìn)一步的，步驟2）中所述的抗體純化處理的具體方法為：取ProteinA珠子加入兔抗血清2ml中充分混合，室溫孵育2h，PBS洗三次；加入450μl的甘氨酸，靜置2min，洗脫至預(yù)先加有50μlTris緩沖液的管中，立即顛倒混勻，重復(fù)洗脫5管，即得到所述特異性抗體。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果為：1、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在HOXB9五個(gè)可乙酰化的賴氨酸位點(diǎn)中（K27,K117,K159,K167andK202），只有K27R突變顯著影響HOXB9被乙酰化，且篩選出PCAF特異性乙?；疕OXB9；2、本發(fā)明所制備得到的抗體可特異性識(shí)別腫瘤標(biāo)本中HOXB9第27位氨基酸的乙?；牧?，從而判斷包括人食管癌、胃癌、肝癌、腎癌和結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的預(yù)后；3、目前對(duì)于結(jié)腸癌的分子病理檢測(cè)主要是k-ras、b-Raf等分子，本項(xiàng)發(fā)明提供潛在的另一預(yù)測(cè)分子Ace-27HOXB9，而且不僅在結(jié)腸癌，在食管癌、胃癌、肝癌、腎癌中也有類似的預(yù)測(cè)作用，該分子在多種癌組織中預(yù)示良好預(yù)后的發(fā)現(xiàn)為其開展廣泛的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。附圖說明圖1為用乙?；贵wIP發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的HOXB9存在乙酰化修飾狀態(tài)；圖2為HOXB9乙酰化位點(diǎn)在第27位賴氨酸，其中（A）電離質(zhì)譜(m/z1384.3141)分析發(fā)現(xiàn)HOXB9乙?；稽c(diǎn)在第27位賴氨酸；（B）突變27位賴氨酸為精氨酸顯著降低HOXB9的乙酰化程度；（C）HKEK-293T細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)Flag-HOXB9突變體和PCAF后IP下拉Flag，再用乙?；贵w檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其乙?；潭蕊@著降低；（D）AcK27-HOXB9抗體特異性用Dotblot方法，以HOXB9乙?；?EDAPPA(AcK)FPSGQYAC)，三種濃度和HOXB9非乙?；?EDAPPAKFPSGQYAC)為對(duì)照；（E）免疫組織化學(xué)法在C57BL6小鼠一系列組織中檢測(cè)AcK27-HOXB9的表達(dá)水平。在肺、腦、腎、子宮和卵巢中均檢測(cè)到內(nèi)源性AcK27-HOXB9的表達(dá)；圖3為AcK27-HOXB9在人食管癌、胃癌、肝癌、腎癌和結(jié)腸癌中的表達(dá)水平示意圖；圖4為免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺腺癌患者27Ace-HOXB9的表達(dá)水平；圖5為免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)腸癌患者27Ace-HOXB9的表達(dá)水平。具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施例中所采用的材料：濃鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉、二甲苯、碳酸氫鈉、異丙醇、三氯甲烷、丙三醇、無水乙醇、甲醇、冰醋酸、葡萄糖、無水乙酸鈉、氯化鈣等購(gòu)自北京化工廠；對(duì)苯二酚、2-巰乙基磺酸鈉、多聚甲醛、二磷酸氯喹鹽、過硫酸銨、焦碳酸二乙酯(DEPC)、結(jié)晶紫、考馬斯亮藍(lán)R250、氯化鎂六水合物、氯化錳、氯化鈉、硼酸、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、脫氧膽酸鈉、硝普鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)、原釩酸鈉鹽、HEPES、二甲基亞砜(DMSO)、戊巴比妥鈉、二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán)、CHAPS、Tris、Tween-20、NP-40、TritonX-100、dNTP、氯霉素(Cam)等購(gòu)自Sigma公司；氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)等購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司。實(shí)施例1用乙?；禺愋钥贵w下拉，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)HOXB9是一種乙?；鞍祝鐖D1所示，接下來從4種乙?；钢泻Y選出PCAF特異性乙酰化HOXB9，而非其它三種酶（CBP,P300和hMOF），如圖1B所示。通過共轉(zhuǎn)FLAG-HOXB9和FLAG-PCAF，之后通過LC-MS/MS分析，我們發(fā)現(xiàn)在HOXB9五個(gè)可乙?；馁嚢彼嵛稽c(diǎn)中(K27,K117,K159,K167andK202)，只有K27R突變顯著影響HOXB9被PCAF乙?；?，如圖2A和2B所示。一種轉(zhuǎn)錄因子HOXB9第27位乙?；稽c(diǎn)的特異性抗體的制備方法，包括以下步驟：1）人工合成SEDAPPAKFPSGQYAS序列多肽，并將K位點(diǎn)進(jìn)行乙?；幚恚凰鲂蛄杏缮虾＜敼竞铣?；2）利用步驟1）合成的多肽免疫兔獲得多克隆抗血清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）測(cè)定血清中抗體滴度，并對(duì)抗體進(jìn)行純化處理，即得到所述特異性抗體。進(jìn)一步的，步驟1）所述的K位點(diǎn)的乙酰化處理使用的乙?；笧镻CAF。進(jìn)一步的，步驟2）中的免疫兔的具體過程為：分別于初次免疫28天后、42天后、56天后進(jìn)行三次加強(qiáng)免疫，用250μg27Ace-HOXB9多肽與等體積的弗氏不完全佐劑混勻，背部皮下多點(diǎn)注射；第三次加強(qiáng)免疫前取耳血，分離血清作為免疫后血清，采用ELISA測(cè)定血清中的抗體效價(jià)，當(dāng)抗體滴度達(dá)到106數(shù)量級(jí)時(shí)，頸動(dòng)脈放血，收集血清，即獲得所述的多克隆抗血清。進(jìn)一步的，步驟2）中所述的ELISA測(cè)定血清中抗體滴度，具體方法為：吸取適量0.1mol/L，pH9.5的碳酸緩沖液，稀釋步驟1）所述多肽至5mg/L，每孔50μl加入96孔板，4℃包被過夜；第二天移去包被液，稀釋緩沖液（0.01mol/LPBS，0.05%Tween-20，pH7.0）洗3次，每次5min；3％牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin，BSA），37℃封閉2h，依次與梯度稀釋的兔抗血清（稀釋液為1％牛血清白蛋白）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗，37℃分別反應(yīng)1h；稀釋緩沖液洗3次，每次5min；底物液避光顯色15min后，每孔加入50μl，2mol/L硫酸終止反應(yīng)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)儀讀取490nm吸光度值進(jìn)行分析。進(jìn)一步的，步驟2）中所述的抗體純化處理的具體方法為：取ProteinA珠子加入兔抗血清2ml中充分混合，室溫孵育2h，PBS洗三次；加入450μl的甘氨酸（0.1mol/L，pH2.8），靜置2min，洗脫至預(yù)先加有50μlTris緩沖液（1mol/L，pH8.0）的管中，立即顛倒混勻，重復(fù)洗脫5管，即得到所述特異性抗體。通過Dotblotting方法檢測(cè)本實(shí)施例制備得到的兔抗27Ace-HOXB9多克隆抗體的有效性和特異性。實(shí)施例2在本實(shí)施例中收集北醫(yī)三院肺癌病理切片75例肺腺癌。收集齊全的病例資料：包括檔案號(hào)、姓名、性別、年齡、病理診斷（類型及分化程度）、TNM分級(jí)和生存期等。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)27Ace-HOXB9的表達(dá)水平，以中位數(shù)分界Kaplan-Meier分析高表達(dá)與低表達(dá)組之間的生存差異，具體檢測(cè)方法如下所述。結(jié)果如圖4顯示：低水平27Ace-HOXB9預(yù)示不良肺腺癌的預(yù)后。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)所得抗體的組織檢測(cè)有效性與特異性，具體步驟如下：1）石蠟切片免疫組織化學(xué)染色（Envision二步法）①石蠟切片脫蠟水化：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min；100%酒精Ⅰ、Ⅱ各5min；95%酒精Ⅰ、Ⅱ各5min；90%酒精5min；80%酒精5min，70%酒精5min；②3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下，10min；③自來水沖洗2min，蒸餾水沖洗2次；④抗原修復(fù)（抗原修復(fù)液分為pH6.0）：水浴鍋煮沸10min，之后自然冷卻到室溫；⑤PBS緩沖液沖洗3次，每次3min；⑥加一抗4℃冰箱中過夜；以PBS代替一抗做陰性對(duì)照；⑦PBS緩沖液沖洗3次，每次3min；⑧滴加相應(yīng)二抗，室溫孵育30min；⑨PBS緩沖液沖洗3次，每次3min；⑩DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片；鏡檢。WesternBlot檢測(cè)1）聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）①膠的制備配制所需濃度的下層分離膠，混勻后灌膠，并在膠面上小心加入蒸餾水，待膠自然凝結(jié)后將未凝的蒸餾水傾出，將配置好的5%濃縮膠倒入上層，迅速插入梳子，待凝結(jié)后小心拔出梳子，備用。②樣品的制備將蛋白質(zhì)樣品（根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)要求取合適蛋白量上樣）與上樣緩沖液（5×）在離心管中混合，沸水加熱5min，最大轉(zhuǎn)數(shù)離心10s。③電泳將配好的膠正確裝入電泳槽中，倒入電泳液。用微量移液器將蛋白質(zhì)樣品加入樣品孔底部，避免帶入氣泡，氣泡易使樣品混入到相鄰的樣品孔中。將電極插頭與適當(dāng)?shù)碾姌O相連。濃縮膠中電泳電壓80V，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，調(diào)節(jié)電壓使之恒定在120V。染料的前沿遷移至分離膠的底部時(shí)關(guān)閉電源。④轉(zhuǎn)膜SDS-PAGE結(jié)束后，從電泳槽中取出凝結(jié)玻璃板。輕輕撬開玻璃板，凝膠會(huì)貼在其中的一塊玻板上。取下凝膠，放入電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡5min后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將塑料支架平放，注意黑片（負(fù)極）在下，依次放置海綿墊、3層厚濾紙、凝膠、轉(zhuǎn)印膜（PVDF膜）、3層厚濾紙、海綿墊，趕走各層間氣泡，夾好支架，在冰浴中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，200mA，約2h（PVDF膜需先經(jīng)甲醇浸透，電轉(zhuǎn)液平衡10min后方可使用）。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將膜剪去右上角作為標(biāo)記。2）抗原抗體反應(yīng)①封閉：拆卸轉(zhuǎn)移裝置，將濾紙揭下，用鑷子或戴手套將膜放入容器中。5%牛奶（TBST配置）室溫振搖封閉1h。②加一抗：用封閉液按最佳比例稀釋一抗，與PVDF膜室溫孵育1h或4℃過夜。洗滌：TBS-T洗滌3次，每次10min。③加二抗：用封閉液以1:5000稀釋HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG或山羊抗兔IgG，與PVDF膜在室溫下孵育1h。洗滌：TBS-T洗滌3次，每次10min。3）辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白（ECL反應(yīng)）取等體積WesternBlotLuminolReagent試劑A液、B液混合（按每平方厘米轉(zhuǎn)印膜0.125ml混合液計(jì)算）。將轉(zhuǎn)印膜輕輕接觸濾紙吸干液體，有蛋白質(zhì)的一面朝上放在保鮮膜上，然后將A、B混合液加到轉(zhuǎn)印膜上，反應(yīng)1min，提起轉(zhuǎn)印膜，輕輕接觸濾紙吸干液體。用保鮮膜覆蓋轉(zhuǎn)印膜，有蛋白質(zhì)的一面朝上，表面要注意平整，用透明膠帶將保鮮膜覆蓋的轉(zhuǎn)印膜固定在顯影盒中，使用超敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。裂解液RIPAbuffer：Tris-HCl(pH=7.4)25mMKCl150mMEDTA5mM脫氧膽酸鈉0.5%SDS0.1%NP-401%Cocktail（MERCK）1×PBS-TDS裂解液：PBS1×TritonX-1001%EDTA1mM脫氧膽酸鈉0.5%SDS0.1%Cocktail（MERCK）1×SDSPAGE膠主要試劑及配方儲(chǔ)存液：1.0MTris-HCl(pH6.8)：稱取12.11gTris堿溶于80ml雙蒸水中，加入濃鹽酸調(diào)pH至6.8，加雙蒸水定容至100ml。1.5MTris-HCl(pH8.8)：稱取45.4gTris堿溶解于200ml雙蒸水中，加入濃鹽酸調(diào)pH至8.8，加雙蒸水定容至250ml。10%SDS：稱取10gSDS溶于90ml雙蒸水，用1MHCl調(diào)pH至7.2，加雙蒸水定容至100ml。30%丙烯酰胺：稱取29g丙烯酰胺（Fluka公司）及1gN,N-亞甲雙丙烯酰胺加入60ml雙蒸水中，37℃助溶，加雙蒸水至100ml，驗(yàn)證其pH≤7.0，4℃避光保存。10%過硫酸胺(AP)：稱取1g過硫酸胺溶于10ml雙蒸水中，分裝，4℃保存。實(shí)施例3本實(shí)施例收集北醫(yī)三院肺癌病理切片90例結(jié)腸癌。收集齊全的病例資料：包括檔案號(hào)、姓名、性別、年齡、病理診斷（類型及分化程度）、TNM分級(jí)和生存期等。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)27Ace-HOXB9的表達(dá)水平，Kaplan-Meier分析高表達(dá)與低表達(dá)組之間的生存差異。具體檢測(cè)方法如實(shí)施例2所示，結(jié)果如圖5顯示：低水平27Ace-HOXB9預(yù)示結(jié)腸癌的不良預(yù)后。當(dāng)前第1頁1 2 3