發(fā)明領(lǐng)域

本公開(kāi)涉及改良的免疫球蛋白和免疫球蛋白結(jié)合物。

背景

單克隆抗體具有巨大的實(shí)驗(yàn)和治療用途。具有工程化位點(diǎn)特異性熒光或結(jié)合性質(zhì)的抗體衍生物已被開(kāi)發(fā)并使用了許多年。最近，抗體也已被發(fā)展為治療劑，目前呈現(xiàn)最快增長(zhǎng)的藥物類別[1]?？贵w是通過(guò)二硫鍵結(jié)合在一起的兩條輕鏈和兩條重鏈的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)?？勺儏^(qū)指定結(jié)合到特定抗原，恒定區(qū)部分通過(guò)結(jié)合到免疫細(xì)胞表面的Fc受體引起效應(yīng)子功能。由于在各種疾病治療中的潛力，抗體目前構(gòu)成最快速增長(zhǎng)的人類治療劑種類(Carter.Nature Reviews Immunology.2006,6(5),343)。自從2001，它們的市場(chǎng)已以35％的平均年生長(zhǎng)率增長(zhǎng)，這是所有生物技術(shù)藥物分類中最高的速率(S.Aggarwal.Nature.BioTech.2007,25(10)1097)。

抗體結(jié)合物的工程化已進(jìn)一步增加了抗體應(yīng)用的多樣性。在許多實(shí)驗(yàn)室技術(shù)中，酶或熒光探針與抗體結(jié)合以實(shí)現(xiàn)測(cè)定功能，例如抗原豐度的定量。在靶向治療的情況下，毒素小分子連接到特異地結(jié)合患病細(xì)胞上的生物標(biāo)記的抗體[2‐4]。已進(jìn)行了抗體結(jié)合的各種方法，例如連接到表面賴氨酸[5]、連接到Fc碳水化合物[6]或連接到部分還原的鏈間二硫化物[7]。

抗體結(jié)合到工程化表面半胱氨酸依然是非常有吸引力的選擇，因?yàn)榇蠖鄶?shù)抗體不具有半胱氨酸，除了在鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵中消耗的半胱氨酸。小分子可在通過(guò)巰基反應(yīng)化學(xué)如馬來(lái)酰亞胺連接在半胱氨酸置換的特異位點(diǎn)[8‐14]。在C_H1和C_H3結(jié)構(gòu)域的工程化已有利避免可變區(qū)的抗原結(jié)合和C_H2效應(yīng)子功能的干擾。已考慮了通過(guò)工程化半胱氨酸的成功抗體結(jié)合的不同標(biāo)準(zhǔn)。例如，在其中實(shí)現(xiàn)突變的抗體結(jié)構(gòu)域、突變位點(diǎn)的暴露、將被置換的氨基酸是將要考慮的幾個(gè)變量。已發(fā)展了鑒定適于半胱氨酸工程改造和結(jié)合的位點(diǎn)的高通量篩選方法[15]。與抗體半胱氨酸變體相關(guān)的兩個(gè)最常見(jiàn)的問(wèn)題是寡聚化和弱標(biāo)記。然而，沒(méi)有預(yù)測(cè)是否抗體半胱氨酸變體將是穩(wěn)定的和有效結(jié)合的通用工具。此外，半胱氨酸變體目前只為C_L、C_H1和C_H3結(jié)構(gòu)域存在[8,9,11,12,15]。

因此，存在另外的可用于產(chǎn)生穩(wěn)定免疫球蛋白結(jié)合物的免疫球蛋白半胱氨酸變體的需要。

概述

本文描述滿足該需要的改良的免疫球蛋白和免疫球蛋白結(jié)合物，其顯示降低的交聯(lián)。

因此一方面包括免疫球蛋白結(jié)合物，其包括在選自7(V_H)、20(V_L)、22(V_L)、25(V_H)、125(C_H1)、248(C_H2)、254(C_H2)、286(C_H2)、298(C_H2)和326(C_H2)的殘基處具有至少一個(gè)突變的免疫球蛋白，其中至少一個(gè)突變是用半胱氨酸殘基和原子或分子的置換，其中原子或分子結(jié)合到半胱氨酸殘基。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)突變是在選自7(V_H)、20(V_L)、22(V_L)和125(C_H1)的殘基處。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)突變是在選自248(C_H2)和326(C_H2)的殘基處。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)突變是在選自25(V_H)和286(C_H2)的殘基處。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)突變是在選自254(C_H2)和298(V_H)的殘基處。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物包括人C_H1結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物包括人C_H2結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物包括人C_H3結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物包括人C_L結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物包括人V_H結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物包括人V_L結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物進(jìn)一步包括具有至少兩個(gè)活性位點(diǎn)的連接分子，其中第一個(gè)活性位點(diǎn)結(jié)合到免疫球蛋白的半胱氨酸殘基，第二個(gè)活性位點(diǎn)結(jié)合到原子或分子。在與前述具有連接分子的實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，連接分子選自腙、二硫化物、肽、螯合劑和馬來(lái)酰亞胺。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，原子或分子選自放射性核素、化學(xué)治療劑、微生物毒素、植物毒素、聚合物、碳水化合物、細(xì)胞因子、熒光標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、酶‐底物標(biāo)記、酶、肽、肽模擬物、核苷酸、siRNA、微小RNA、RNA模擬物和適配體。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，原子或分子選自⁹⁰Y、¹³¹I、⁶⁷Cu、¹⁷⁷Lu、²¹³Bi、²¹¹At、加利車霉素、倍癌霉素、美登木素生物堿(maytanisoid)、奧利斯汀(auristatin)、蒽環(huán)類化合物(anthracyclin)、假單胞菌外毒素A、白喉毒素、篦麻毒素、聚乙二醇、羥乙基淀粉和甘露糖(mannosyl)殘基。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，原子或分子降低未突變免疫球蛋白的免疫原性。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，原子或分子增加未突變免疫球蛋白的免疫原性。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物進(jìn)一步包括抗原結(jié)合活性并且該活性是未突變免疫球蛋白抗原結(jié)合活性的至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％或至少130％。

另一個(gè)方面包括修飾或分離的免疫球蛋白，其包括在選自7(V_H)、20(V_L)、22(V_L)、25(V_H)、125(C_H1)、248(C_H2)、254(C_H2)、286(C_H2)和326(C_H2)殘基處的至少一個(gè)突變，其中至少一個(gè)突變是用半胱氨酸殘基的置換。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)突變是在選自7(V_H)、20(V_L)、22(V_L)和125(C_H1)的殘基處。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)突變是在選自248(C_H2)和326(C_H2)的殘基處。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)突變是在選自25(V_H)和286(C_H2)的殘基處。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)突變是在殘基254(C_H2)處。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾或分離的免疫球蛋白包括人C_H1結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾或分離的免疫球蛋白包括人C_H2結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾或分離的免疫球蛋白包括人C_H3結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾或分離的免疫球蛋白包括人C_L結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾或分離的免疫球蛋白包括人V_H結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾或分離的免疫球蛋白包括人V_L結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白進(jìn)一步包括抗原結(jié)合活性并且該活性是未突變免疫球蛋白抗原結(jié)合活性的至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％或至少130％。

另一個(gè)方面包括分離的或重組的多核苷酸，其編碼前述修飾的免疫球蛋白方面和前述實(shí)施方式的任意和所有組合的免疫球蛋白。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸在載體中。在某些實(shí)施方式中，載體是表達(dá)載體。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，可誘導(dǎo)啟動(dòng)子可操作地連接到多核苷酸上。另一方面包括具有前述實(shí)施方式中任何一種的載體的宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞能表達(dá)由多核苷酸編碼的免疫球蛋白。

另一個(gè)方面包括生產(chǎn)免疫球蛋白的方法，所述方法包括提供包含前述方面的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和將培養(yǎng)基置于免疫球蛋白被表達(dá)的條件下。在某些實(shí)施方式中，方法包括分離表達(dá)的免疫球蛋白的另外步驟。

另一個(gè)方面包括生產(chǎn)免疫球蛋白結(jié)合物的方法，包括提供前述修飾的免疫球蛋白方面和前述實(shí)施方式的任意和所有組合的免疫球蛋白，用還原劑還原一個(gè)或多個(gè)置換的半胱氨酸殘基以形成還原的半胱氨酸殘基，和用原子或分子溫育免疫球蛋白，其中所述原子或分子與還原的半胱氨酸殘基反應(yīng)，以形成免疫球蛋白結(jié)合物。

另一個(gè)方面包括降低免疫球蛋白結(jié)合物的高濃藥物制劑中免疫球蛋白表面暴露的半胱氨酸之間交聯(lián)的方法，所述方法包括提供免疫球蛋白，用半胱氨酸殘基置換選自7(V_H)、20(V_L)、22(V_L)和125(C_H1)的殘基，用還原劑還原一個(gè)或多個(gè)置換的半胱氨酸殘基以形成還原的半胱氨酸殘基，用原子或分子溫育免疫球蛋白，其中所述分子與還原的半胱氨酸殘基反應(yīng)，以形成免疫球蛋白結(jié)合物，和產(chǎn)生免疫球蛋白結(jié)合物的高濃液體制劑，其中所述免疫球蛋白結(jié)合物濃度為至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括人C_H1結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括人C_H2結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括人C_H3結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括人C_L結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括人V_H結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括人V_L結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物包括抗原結(jié)合活性并且該活性是未突變免疫球蛋白抗原結(jié)合活性的至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％或至少130％。

另一個(gè)方面包括前述免疫球蛋白結(jié)合物方面和前述實(shí)施方式的任意和所有組合在制備包含高濃液體制劑的藥物中的用途，其中所述免疫球蛋白結(jié)合物為至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些實(shí)施方式中，該藥物的用途是用于治療自身免疫疾病、免疫學(xué)疾病、傳染病、炎性疾病、神經(jīng)學(xué)疾病以及包括癌癥在內(nèi)的腫瘤學(xué)和瘤性疾病。在某些實(shí)施方式中，該藥物的用途是用于治療充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、紅斑痤瘡、痤瘡、濕疹、心肌炎和心肌的其他病癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、脊椎病、滑液成纖維細(xì)胞和骨髓基質(zhì)；骨丟失；佩吉特病、破骨細(xì)胞瘤；乳腺癌；廢用性骨量減少、營(yíng)養(yǎng)不良、牙周病、高歇病、朗格罕細(xì)胞組織細(xì)胞增多癥、脊髓損傷、急性膿毒性關(guān)節(jié)炎、骨軟化癥、庫(kù)興綜合征、單骨纖維性骨發(fā)育不良、多骨纖維性骨發(fā)育不良、牙周重建和骨折；肉樣瘤??；溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、腎癌和直腸癌；骨轉(zhuǎn)移、骨痛處理和體液惡性高鈣血癥、強(qiáng)直性脊柱炎和其他脊椎關(guān)節(jié)??；移植排斥、病毒性感染、血液學(xué)瘤形成和瘤樣病癥，例如，何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤/慢性淋巴細(xì)胞白血病、蕈樣霉菌病、套細(xì)胞淋巴瘤、巨濾泡性淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤、毛細(xì)胞白血病和淋巴漿細(xì)胞性白血病)、淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞的腫瘤，其包括B細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤和T細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK細(xì)胞的腫瘤，其包括外周T細(xì)胞白血病、成人T細(xì)胞白血病/T細(xì)胞淋巴瘤和大粒狀淋巴細(xì)胞白血病、朗格罕細(xì)胞組織細(xì)胞增多癥、骨髓瘤形成諸如急性骨髓性白血病，包括成熟的AML、沒(méi)有分化的AML、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性骨髓單核細(xì)胞性白血病和急性單核細(xì)胞性白血病、骨髓增生異常綜合征和慢性骨髓增生疾病，包括慢性骨髓性白血病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，例如，腦瘤(神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、室管膜瘤和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)、實(shí)體瘤(鼻咽癌、基底細(xì)胞癌、胰腺癌、膽管癌、卡波西肉瘤、睪丸癌、子宮癌、陰道癌或?qū)m頸癌、卵巢癌、原發(fā)性肝癌或子宮內(nèi)膜癌、和血管系統(tǒng)的腫瘤(血管肉瘤和血管外皮細(xì)胞瘤)、骨質(zhì)疏松癥、肝炎、HIV、AIDS、(脊)椎關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病(IBD)、膿毒病和敗血癥性休克、克羅恩病、牛皮癬、硬皮病(schleraderma)、移植物抗宿主病(GVHD)、異源胰島移植物排斥、血液學(xué)惡性腫瘤，諸如多發(fā)性骨髓瘤(MM)、骨髓增生異常綜合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、與腫瘤相關(guān)的炎癥、周圍神經(jīng)損傷或脫髓鞘病。在某些實(shí)施方式中，該藥物的用途是用于治療菌斑牛皮癬、潰瘍性大腸炎、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、黃斑變性、呼吸道合胞病毒、克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、骨質(zhì)疏松癥、治療誘導(dǎo)的骨丟失、骨轉(zhuǎn)移、多發(fā)性骨髓瘤、阿爾茨海默病、青光眼和多發(fā)性硬化癥。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該藥物進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該制劑包括至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的免疫球蛋白結(jié)合物，是非寡聚化單體。在某些實(shí)施方式中，單體的百分比通過(guò)非還原SDS‐PAGE分析測(cè)量。

另一個(gè)方面包括前述免疫球蛋白結(jié)合物方面和前述實(shí)施方式的任意和所有組合作為非寡聚化藥物活性成分的用途。

另一個(gè)方面包括前述免疫球蛋白結(jié)合物方面和前述實(shí)施方式的任意和所有組合作為診斷工具的用途。

另一個(gè)方面包括前述免疫球蛋白結(jié)合物方面和前述實(shí)施方式的任意和所有組合作為高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物的用途。另一個(gè)方面包括免疫球蛋白結(jié)合物作為高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物的用途，其中免疫球蛋白結(jié)合物包括在殘基440(C_H3)具有至少一個(gè)突變的免疫球蛋白，其中至少一個(gè)突變是用半胱氨酸殘基和原子或分子的置換，其中所述原子或分子結(jié)合到半胱氨酸殘基。

另一方面包括藥物組合物，其包括前述免疫球蛋白結(jié)合物方面和前述實(shí)施方式的任意和所有組合的免疫球蛋白結(jié)合物以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物濃度為至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是非寡聚化單體。

另一個(gè)方面包括選擇用于突變?yōu)榘腚装彼岬拿庖咔虻鞍椎臍埢姆椒?，包括?jì)算免疫球蛋白表面上的第一氨基酸殘基的空間聚集傾向，計(jì)算第一殘基緊鄰區(qū)域內(nèi)(immediate proximity)免疫球蛋白的多個(gè)殘基的空間聚集傾向，和如果第一氨基酸殘基的空間聚集傾向等于0和‐0.11的值或位于0和‐0.11的值之間，和如果多個(gè)殘基具有小于0的空間聚集傾向，選擇用于突變?yōu)榘腚装彼岬牡谝话被釟埢Ｔ谀承?shí)施方式中，多個(gè)殘基在第一殘基的內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，多個(gè)殘基在第一殘基的內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，多個(gè)殘基在第一殘基的內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，多個(gè)殘基在第一殘基的內(nèi)。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，計(jì)算殘基的空間聚集傾向包括計(jì)算具有以所述殘基中的原子為中心的半徑的球形區(qū)域的所述空間聚集傾向。在某些實(shí)施方式中，球形區(qū)域的半徑為至少

另一個(gè)方面包括修飾或分離的免疫球蛋白，其包括至少一個(gè)表面暴露的殘基向半胱氨酸的突變，其中殘基的空間聚集傾向等于0和‐0.11的值或位于0和‐0.11的值之間，并且其中第一殘基緊鄰區(qū)域內(nèi)免疫球蛋白的多個(gè)殘基的空間聚集傾向具有小于0的空間聚集傾向。在某些實(shí)施方式中，多個(gè)殘基在第一殘基的內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，多個(gè)殘基在第一殘基的內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，多個(gè)殘基在第一殘基的內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，多個(gè)殘基在第一殘基的內(nèi)。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，針對(duì)具有以所述殘基中的原子為中心的半徑的球形區(qū)域計(jì)算所述空間聚集傾向。在某些實(shí)施方式中，半徑為至少

另一個(gè)方面包括選擇突變?yōu)榘腚装彼岬拿庖咔虻鞍椎臍埢姆椒?，包括選擇免疫球蛋白的多個(gè)氨基酸殘基，其中多個(gè)殘基暴露在免疫球蛋白的表面，將多個(gè)殘基中的一個(gè)殘基突變?yōu)榘腚装彼釟埢?，將半胱氨酸殘基結(jié)合到原子或分子以形成免疫球蛋白結(jié)合物，測(cè)試免疫球蛋白結(jié)合物的交聯(lián)傾向和賦予免疫球蛋白結(jié)合物交聯(lián)傾向值，和如果交聯(lián)傾向值是I或II選擇用于突變?yōu)榘腚装彼岬臍埢Ｔ谀承?shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括如果小于5％的免疫球蛋白結(jié)合物形成二聚體并且沒(méi)有免疫球蛋白結(jié)合物形成三聚體，賦予免疫球蛋白結(jié)合物交聯(lián)傾向值II，其中二聚體和三聚體的形成通過(guò)比較型非還原和還原SDS‐PAGE測(cè)量。在某些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括如果小于1％的免疫球蛋白結(jié)合物形成二聚體，賦予免疫球蛋白結(jié)合物交聯(lián)傾向值I，其中二聚體的形成通過(guò)比較型非還原和還原SDS‐PAGE測(cè)量。

貫穿說(shuō)明書可發(fā)現(xiàn)本發(fā)明另外的方面和實(shí)施方式。

優(yōu)選實(shí)施方式的詳述

本公開(kāi)涉及改良的免疫球蛋白和免疫球蛋白結(jié)合物，其顯示降低的交聯(lián)。在某些實(shí)施方式中，本公開(kāi)的免疫球蛋白在特定殘基處通過(guò)半胱氨酸置換被修飾。本公開(kāi)提供修飾的免疫球蛋白和免疫球蛋白結(jié)合物，制備這樣的免疫球蛋白和免疫球蛋白結(jié)合物、包含這樣的免疫球蛋白的多價(jià)或多特異性分子的方法以及包含本公開(kāi)的免疫球蛋白、免疫球蛋白結(jié)合物或雙特異性分子的藥物組合物。

定義

本文所談及的術(shù)語(yǔ)“抗體”或“免疫球蛋白”包括整個(gè)抗體和其任何抗原結(jié)合片段(即，“結(jié)合抗原部分”)或單鏈。天然存在的“抗體”是包含通過(guò)二硫鍵相互連接的至少兩個(gè)重鏈(H)和兩個(gè)輕鏈(L)的糖蛋白。每個(gè)重鏈由重鏈可變區(qū)(本文縮寫為V_H)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域C_H1、C_H2和C_H3組成。每個(gè)輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為V_L)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域C_L組成。V_H和V_L區(qū)能被進(jìn)一步細(xì)分成稱作互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高度可變區(qū)，散布著稱作框架區(qū)(FR)的更保守的區(qū)域。每個(gè)V_H和V_L由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，以下面的順序從氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。抗體的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，其包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。

本文所談及的術(shù)語(yǔ)“抗體結(jié)合物”或“免疫球蛋白結(jié)合物”包括化學(xué)或生物連接到原子或分子的任何免疫球蛋白、抗原結(jié)合片段或其單鏈。原子或分子可包括，例如細(xì)胞毒素、放射劑、抗腫瘤藥或治療劑?？贵w結(jié)合物保留免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段的免疫反應(yīng)性，即，抗體結(jié)合物的免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段具有與原子或分子結(jié)合之前免疫球蛋白的抗原結(jié)合活性的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％或至少130％。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)稱“抗原部分”)是指全長(zhǎng)抗體或保留特異性結(jié)合抗原能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段以及重鏈或輕鏈的恒定區(qū)的至少一部分。已經(jīng)顯示，抗體結(jié)合抗原的功能可以通過(guò)全長(zhǎng)抗體的片段執(zhí)行。在術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)包含的結(jié)合片段的實(shí)例包括Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；F(ab)2片段，包括由鉸鏈區(qū)上的二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；Fd片段，由V_H和C_H1結(jié)構(gòu)域組成；和Fv片段，由抗體單臂的V_L和V_H結(jié)構(gòu)域組成。

此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，V_L和V_H，由分開(kāi)的基因編碼，但是它們可采用重組方法通過(guò)合成連接體進(jìn)行連接，所述合成連接體能使它們形成單條蛋白鏈，其中V_L和V_H區(qū)域成對(duì)以形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見(jiàn)，例如Bird et al.,1988 Science 242:423‐426；和Huston et al.,1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879‐5883)。這種單鏈抗體也意欲包括在術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”之內(nèi)。這些抗體片段利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)技術(shù)獲得，并且片段被篩選用于以與完整抗體相同的方式使用。

如本文所用，“分離的”抗體或免疫球蛋白是指基本上不含其它成分的抗體或免疫球蛋白，其中這樣的抗體或免疫球蛋白是天然發(fā)現(xiàn)的。此外，分離的抗體或免疫球蛋白可基本上不含其它細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)品。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體成分”是指單分子組成的抗體分子制備物。單克隆抗體組成一般顯示對(duì)特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“人抗體”意欲包括具有可變區(qū)的抗體，其中框架和CDR區(qū)域來(lái)自人來(lái)源的序列。此外，如果抗體包含恒定區(qū)，恒定區(qū)也來(lái)自這樣的人序列，例如，人種系序列、或突變形式的人種系序列或抗體，其包含從人框架序列分析導(dǎo)出的共有框架序列，如Knappik,et al.(2000.J Mol Biol 296,57‐86)中所述的。

本公開(kāi)的人抗體可包括不是由人序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過(guò)體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或者通過(guò)體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。然而，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“人抗體”沒(méi)有意欲包括這樣的抗體，其中來(lái)自另一哺乳動(dòng)物種類諸如小鼠的種系的CDR序列已經(jīng)被接枝到人框架序列。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“人結(jié)構(gòu)域”意欲包括來(lái)自人來(lái)源的序列的免疫球蛋白恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，人來(lái)源的序列例如，人種系序列、或突變形式的人種系序列或抗體，其包含從人框架序列分析導(dǎo)出的共有框架序列，如Knappik,et al.(2000.J Mol Biol296,57‐86)中所述的。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重組人抗體”包括通過(guò)重組方式制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，諸如，從對(duì)于人免疫球蛋白基因來(lái)說(shuō)是轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動(dòng)物(例如小鼠)或由其制備的雜交瘤分離的抗體，從轉(zhuǎn)化以表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞例如從轉(zhuǎn)染瘤分離的抗體，從重組、組合人抗體文庫(kù)分離的抗體，以及通過(guò)涉及將人免疫球蛋白基因——序列——的全部或一部分拼接到其它DNA序列的任何其它方式制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有可變區(qū)，其中框架和CDR區(qū)域來(lái)自人種系免疫球蛋白序列。在某些實(shí)施方式中，然而，這樣的重組人抗體可經(jīng)歷體外誘變(或者，當(dāng)使用對(duì)人Ig序列是轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物時(shí)，體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，并且因此重組抗體的V_H和V_L區(qū)域的氨基酸序列是這樣的序列，其當(dāng)來(lái)自人種系V_H和V_L序列或涉及人種系V_H和V_L序列時(shí)，可不天然存在于體內(nèi)人抗體種系儲(chǔ)庫(kù)之內(nèi)。

“嵌合抗體”是這樣的抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其部分被改變、替代或交換，從而抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))被連接到不同或改變的種類的恒定區(qū)、效應(yīng)功能和/或種類、或者賦予嵌合抗體新特性的完全不同的分子，例如，酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子、藥物等；或者(b)可變區(qū)或其部分用具有不同或改變的抗原特異性的可變區(qū)改變、替代或交換。例如，小鼠抗體可通過(guò)用包含本文公開(kāi)的修飾的人免疫球蛋白的恒定區(qū)替代其恒定區(qū)而進(jìn)行修飾。由于用人恒定區(qū)替代，嵌合抗體可保留其特異性同時(shí)相比原小鼠抗體或者沒(méi)有本文公開(kāi)的修飾的嵌合抗體整體上具有降低的人中抗原性和降低的聚集。

“人源化”抗體是保留非人抗體的反應(yīng)性同時(shí)具有較少的人中免疫原性的抗體。這可例如通過(guò)保留非人CDR區(qū)域并用其人對(duì)應(yīng)物替代抗體剩余部分(即恒定區(qū)以及可變區(qū)的框架部分)來(lái)實(shí)現(xiàn)。參見(jiàn)例如Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851‐6855,1984；Morrison and Oi,Adv.Immunol.,44:65‐92,1988；Verhoeyen et al.,Science,239:1534‐1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28:489‐498,1991；和Padlan,Molec.Immun.,31:169‐217,1994。人工程化技術(shù)的其它實(shí)例包括但不限于US 5,766,886中公開(kāi)的Xoma技術(shù)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“連接體”、“連接體單元”或“連接”指包括共價(jià)鍵或共價(jià)地將抗體連接到藥物或其它分子的原子鏈的化學(xué)部分。連接體包括二價(jià)基如烷基二基(alkyldiyl)、亞芳基、雜亞芳基(heteroarylene)，部分如：‐‐(CR₂)_nO(CR₂)_n‐‐，烷氧基的重復(fù)單元(例如聚亞乙氧基(polyethylenoxy)、PEG、聚亞甲氧基(polymethyleneoxy))和烷氨基(例如聚乙烯氨基(polyethyleneamino)、Jeffamine(聚環(huán)氧烯烴衍生產(chǎn)品).TM.)；和二元酸酯和酰胺包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二甘醇酸酯(diglycolate)、丙二酸酯和己酰胺。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”指可共價(jià)地連接到抗體的任何部分，并且其作用是：(i)提供可檢測(cè)的信號(hào)；(ii)與第二標(biāo)記相互作用以修飾由第一或第二標(biāo)記提供的可檢測(cè)的信號(hào)，例如FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)；(iii)穩(wěn)定相互作用或增加與抗原或配體結(jié)合的親和性；(iv)通過(guò)電荷、疏水性、形狀或其它物理參數(shù)影響遷移率，例如電泳遷移率，或細(xì)胞滲透性，或(v)提供捕獲部分，以調(diào)節(jié)配體親和性、抗體/抗原結(jié)合或離子絡(luò)合。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“人性化(Humaneering)”是指將非人抗體轉(zhuǎn)化成工程化人抗體的方法(參見(jiàn)例如KaloBios的Humaneering^TM技術(shù))。

如本文所用，“同種型”是指由具有本文公開(kāi)的易聚集基序(并且因此順從于本文公開(kāi)的降低聚集的修飾)的重鏈恒定區(qū)基因提供的任何抗體種類(例如，IgM、IgE、IgG如IgG1或IgG2)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“親和性”是指在單個(gè)抗原位點(diǎn)抗體和抗原之間相互作用的強(qiáng)度。在每個(gè)抗原位點(diǎn)內(nèi)，抗體“臂”的可變區(qū)通過(guò)弱的非共價(jià)力與抗原在許多位點(diǎn)相互作用；相互作用越多，親和性越強(qiáng)。本文公開(kāi)的修飾優(yōu)選地不降低本文公開(kāi)的免疫球蛋白或抗體的親和性或者親和性被降低少于30％、少于20％、少于10％、或少于5％。如本文所用，當(dāng)測(cè)定本文公開(kāi)的修飾是否降低親和性時(shí)，在具有該修飾的免疫球蛋白或抗體與缺乏該修飾但包括任何不相關(guān)突變的相同免疫球蛋白之間進(jìn)行比較。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“對(duì)象(subject)”包括任何人或非人動(dòng)物。

術(shù)語(yǔ)“非人動(dòng)物”包括所有脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，諸如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類、爬行類等。

術(shù)語(yǔ)“化學(xué)治療劑”如本文所用指在癌癥治療中有用的化合物?；瘜W(xué)治療劑的例子包括埃羅替尼(TARCEVA(TM)，Genentech/OSI Pharm.)、硼替佐米(Bortezomib)(VELCADE(TM)，Millenium Pharm.)、氟維司群(FASLODEX(TM)，Astrazeneca)、舒尼替尼(SU11248，Pfizer)、來(lái)曲唑(FEMARA(TM)，Novartis)、甲磺酸伊馬替尼(GLEEVEC(TM)，Novartis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、奧沙利鉑(Eloxatin(TM)，Sanofi)、5‐FU(5‐氟尿嘧啶)、甲酰四氫葉酸、雷帕霉素(Sirolimus，RAPAMUNE(TM)，Wyeth)、拉帕替尼(Lapatinib)(GSK572016，GlaxoSmithKline)、法尼醇蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑(Lonafarnib)(SCH 66336)、索拉非尼(BAY43‐9006，Bayer Labs.)和吉非替尼(Gefitinib)(IRESSA(TM),Astrazeneca)、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)、烷化劑如塞替派和CYTOXAN(TM)環(huán)磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸鹽如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶如苯并多巴(benzodopa)、卡巴醌、meturedopa和uredopa；ethylenimines和methylamelamines包括六甲蜜胺、三亞乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺和trimethylomelamine；聚乙酸(尤其是番荔枝內(nèi)酯(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜樹(shù)堿(包括合成的類似物托泊替坎)；苔蘚抑素；callystatin；CC‐1065(包括其阿多來(lái)新、卡折來(lái)新和比折來(lái)新合成類似物)；cryptophycins(特別是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他??；倍癌霉素(包括合成類似物，KW‐2189和CB 1‐TM1)；軟珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉堿(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥、鹽酸氧化氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖、新氮芥(novembichin)、膽固醇苯乙酸氮芥、潑尼莫司汀、曲磷胺(trofosfamide)、烏拉莫司??；亞硝基脲(nitrosureas)如卡莫司汀、chlorozotocin、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和ranimnustine；抗生素如烯二炔類抗生素(例如，加利車霉素，尤其是加利車霉素γ1I和加利車霉素ωI1(Angew Chem Intl.Ed.Engl.(1994)33:183‐186)；達(dá)內(nèi)霉素(dynemicin)，包括達(dá)內(nèi)霉素A；雙磷酸鹽，如氯屈膦酸鹽(clodronate)；埃斯波霉素；以及新制癌菌素發(fā)色團(tuán)和相關(guān)的色蛋白烯二炔類抗生素生色團(tuán))、aclacinomysins、放射菌素、氨茴霉素、偶氮絲氨酸、博萊霉素、放線菌素c、卡柔比星(carabicin)、洋紅霉素、嗜癌素、色霉素(chromomycinis)、更生霉素、柔紅霉素、地托比星、6‐重氮‐5‐氧代‐L‐正亮氨酸、ADRIAMYCIN(TM)多柔比星(包括嗎啉代‐多柔比星、氰嗎啉代‐多柔比星、2‐吡咯代‐多柔比星和去氧阿霉素(deoxydoxorubicin))、表柔比星、依索比星、伊達(dá)比星、麻西羅霉素、絲裂霉素類如絲裂霉素C、麥考酚酸、諾拉霉素、表柔比星、培洛霉素、紫菜霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈脲菌素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝物如甲氨蝶呤和5‐氟尿嘧啶(5‐FU)；葉酸類似物如二甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物如氟達(dá)拉濱、6‐巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥(niǎo)嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱、阿扎胞苷、6‐氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素類如卡普睪酮、丙酸甲雄烷酮、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺的如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充劑如甲酰四氫葉酸(frolinic acid)；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺配糖物(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依達(dá)曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋銨；埃博霉素(epothilone)；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；lonidainine；美登木素生物堿(maytansinoids)如美坦辛和安絲菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；噴司他??；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2‐乙肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼；PSK(TM)多糖復(fù)合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生；根霉素；西佐喃(sizofuran)；鍺螺胺；替奴佐酸；三亞胺醌；2,2',2”‐三氯三乙胺；單端孢霉烯類(尤其是T‐2毒素、verracurin A、桿孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦；長(zhǎng)春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司?。欢甯事洞?；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷("Ara‐C")；環(huán)磷酰胺；塞替派；紫杉烷，例如，TAXOL(TM)紫杉醇(Bristol‐Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANETM無(wú)克列莫佛、紫杉醇的白蛋白‐工程化納米顆粒制劑(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)和TAXOTERE(TM)多西紫杉醇(Rhone‐Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZAR(TM)吉西他濱；6‐巰鳥(niǎo)嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物如順鉑和和卡鉑；長(zhǎng)春堿；鉑；依托泊甙(VP‐16)；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿；NAVELBINE(TM)長(zhǎng)春瑞濱；諾消靈(novantrone)；替尼泊甙；依達(dá)曲沙；道諾霉素；氨基蝶呤；希羅達(dá)；伊班膦酸鹽；CPT‐11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DMFO)；類維生素A如維生素A酸；卡培他濱；和上述任意的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。

該“化學(xué)治療劑”定義中還包括：(i)起調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤作用的抗激素劑如抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)，包括，例如，他莫昔芬(包括NOLVADEX(TM)他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4‐羥三苯氧胺、曲沃昔芬、鹽酸雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮和FARESTON托瑞米芬；(ii)抑制芳香酶的芳香酶抑制劑，其調(diào)節(jié)腎上腺中雌激素產(chǎn)生，如，例如，4(5)‐咪唑類、氨魯米特、MEGASE(TM)醋酸甲地孕酮、AROMASIN(TM)依西美坦、福美坦(formestanie)、法倔唑、RIVISOR(TM)伏氯唑、FEMARA(TM)來(lái)曲唑和ARIMIDEX(TM)阿那曲唑；(iii)抗雄激素類如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他濱(1,3‐二氧戊烷核苷胞嘧啶類似物)；(iv)芳香酶抑制劑；(v)蛋白激酶抑制劑；(vi)脂類激酶抑制劑；(vii)反義寡核苷酸，特別是在牽涉異常細(xì)胞增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中抑制基因表達(dá)的那些反義寡核苷酸，如，例如，PKC‐α、Ralf和H‐Ras；(viii)核酶如VEGF表達(dá)抑制劑(例如，ANGIOZYME(TM)核酶)和HER2表達(dá)抑制劑；(ix)疫苗如基因治療疫苗，例如，ALLOVECTIN(TM)疫苗、LEUVECTIN(TM)疫苗和VAXID(TM)疫苗；PROLEUKIN(TM)rIL‐2；LURTOTECAN(TM)拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑；ABARELIX(TM)rmRH；(x)抗血管生成劑如貝伐單抗(bevacizumab)(AVASTIN(TM)、Genentech)；和(xi)上述任意的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”是由一個(gè)細(xì)胞群釋放的蛋白的總稱，其作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一個(gè)細(xì)胞。這樣的細(xì)胞因子的例子是淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子中包括生長(zhǎng)激素如人生長(zhǎng)激素、N‐甲硫氨酰人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原(prorelaxin)；糖蛋白激素如促濾泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH)；肝臟生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；催乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子‐α和‐β；苗勒管抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；血栓形成素(TPO)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子如NGF‐β；血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFs)如TGF‐α和TGF‐β；胰島素樣生長(zhǎng)因子‐I和‐II；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子；干擾素如干擾素‐α、‐β和‐γ；集落刺激因子(CSFs)如巨噬細(xì)胞‐CSF(M‐CSF)；粒細(xì)胞‐巨噬細(xì)胞‐CSF(GM‐CSF)；和粒細(xì)胞‐CSF(G‐CSF)；白細(xì)胞介素(ILs)如IL‐1、IL‐1α、IL‐2、IL‐3、IL‐4、IL‐5、IL‐6、IL‐7、IL‐8、IL‐9、IL‐10、IL‐11、IL‐12；腫瘤壞死因子如TNF‐α或TNF‐β；和包括LIF和kit配體(KL)在內(nèi)的其它多肽因子。如本文所述，術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括來(lái)自天然來(lái)源或來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白和天然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)上活性的等同物。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“優(yōu)化的”意指核苷酸序列已經(jīng)被改變以利用生產(chǎn)細(xì)胞或有機(jī)體中優(yōu)選的密碼子編碼氨基酸序列，生產(chǎn)細(xì)胞或有機(jī)體一般為真核細(xì)胞，例如畢赤酵母(Pichia)細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或人細(xì)胞。優(yōu)化的核苷酸序列被工程改造以完全或盡可能多地保留由起始核苷酸序列原始編碼的氨基酸序列，其也被稱為“親本”序列。本文也預(yù)期了這些序列在其它真核細(xì)胞中的優(yōu)化表達(dá)。由優(yōu)化的核苷酸序列編碼的氨基酸序列也被稱為被優(yōu)化的。

如本文所用，“抗原結(jié)合活性”指免疫球蛋白或免疫球蛋白結(jié)合物對(duì)其靶抗原的結(jié)合特異性。例如，抗原結(jié)合活性通過(guò)基于細(xì)胞的生物測(cè)定(例如報(bào)告基因測(cè)定)、ELISA、表面等離子共振(Biacore)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它技術(shù)測(cè)量。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“交聯(lián)傾向(cross‐linking propensity)”(CLP)指含有用半胱氨酸置換的突變的修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白結(jié)合物在置換的半胱氨酸殘基處在不同的免疫球蛋白之間交聯(lián)的傾向。例如，CLP可通過(guò)寡聚化水平測(cè)定，寡聚化水平通過(guò)非還原SDS‐PAGE、尺寸排阻層析、具有尺寸排阻層析的靜態(tài)或動(dòng)態(tài)激光散射、或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它技術(shù)測(cè)量。I類包括是單體的并在標(biāo)記之后保持穩(wěn)定的變體。II類的變體在標(biāo)記之前和之后含有小百分比的二聚體。III類變體具有更明顯的寡聚化傾向，包括形成一些三聚體。IV類變體具有更高的寡聚化傾向，如較三聚體更大的聚集體的存在所證明的，尤其是標(biāo)記之后。V類包括與IV類的變體相似的高寡聚化傾向的變體，具有另外的結(jié)構(gòu)異常如純化的濃縮樣品的片段化或染色。

術(shù)語(yǔ)“表位(epitope)”意指能特異性結(jié)合抗體的蛋白質(zhì)決定子。表位通常由分子諸如氨基酸或糖側(cè)鏈的化學(xué)活性表面小組組成并且通常具有特異性的三維結(jié)構(gòu)特性以及特異性的電荷特性。構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于與前者而不是后者的結(jié)合在變性溶劑的存在下被丟失。

術(shù)語(yǔ)“保守修飾的變體”適用于氨基酸和核酸序列兩者。關(guān)于特定核酸序列，保守修飾的變體是指那些核酸，其編碼相同或基本相同的氨基酸序列，或者其中核酸不將氨基酸序列編碼成基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，大量功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密碼子規(guī)定的每個(gè)位置，密碼子可被改變成所述的相應(yīng)密碼子中任何一個(gè)而不改變所編碼的多肽。這種核酸變異是“沉默變異”，其是保守修飾的變異的一種。本文編碼多肽的每個(gè)核酸序列也描述該核酸的每個(gè)可能的沉默變異。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，核酸中的各個(gè)密碼子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密碼子)都可被修飾以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的各個(gè)沉默變異在各個(gè)所述序列中是隱式的。

對(duì)于多肽序列，“保守修飾的變體”包括多肽序列的各個(gè)置換、缺失或添加，其導(dǎo)致氨基酸用化學(xué)上類似的氨基酸的置換。提供功能類似的氨基酸的保守置換表在本領(lǐng)域中是熟知的。這種保守修飾的變體是除本公開(kāi)的多態(tài)變體、種間同系物和等位基因之外的，并且沒(méi)有排除本公開(kāi)的多態(tài)變體、種間同系物和等位基因。下列八組包含互相為保守置換的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、絲氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見(jiàn)例如，Creighton,Proteins(1984))。

在兩個(gè)或多個(gè)核酸或多肽序列的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“同一的(identical)”或％“同一性(identity)”是指相同的兩個(gè)或多個(gè)序列或子序列。如采用下列序列比較算法之一或者通過(guò)手工比對(duì)和視覺(jué)觀察所測(cè)，當(dāng)在比較窗或指定區(qū)上比較和比對(duì)最大對(duì)應(yīng)時(shí)，如果兩個(gè)序列具有指定百分?jǐn)?shù)的相同氨基酸殘基或核苷酸(即在指定區(qū)域，或者，當(dāng)未指定時(shí)，在整個(gè)序列上，60％同一性，任選地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，兩個(gè)序列是“基本同一的”。任選地，在長(zhǎng)度為至少大約50個(gè)核苷酸(或10個(gè)氨基酸)的區(qū)域上，或者更優(yōu)選地在長(zhǎng)度為100至500或1000或更多個(gè)核苷酸(或20、50、200或更多個(gè)氨基酸)的區(qū)域上存在同一性。

對(duì)于序列比較，一般地一個(gè)序列作為參考序列，測(cè)試序列與其比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參考序列輸入計(jì)算機(jī)，指定子序列坐標(biāo)，如果必要的話，并且指定序列算法程序參數(shù)。可以使用默認(rèn)程序參數(shù)，或者可以指定可選的參數(shù)。序列比較算法然后基于程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列的序列同一性百分?jǐn)?shù)。當(dāng)比較兩個(gè)序列的同一性時(shí)，序列沒(méi)有必要是鄰接的，但是任何空位將隨其攜帶一個(gè)將會(huì)降低整體百分?jǐn)?shù)同一性的罰分。對(duì)于blastn，默認(rèn)參數(shù)是空位開(kāi)放罰分＝5和空位延伸罰分＝2。對(duì)于blastp，默認(rèn)參數(shù)是空位開(kāi)放罰分＝11和空位延伸罰分＝1。

如本文所用，“比較窗(comparison window)”包括參考任意數(shù)目的鄰接位置的區(qū)段，其包括但不限于20至600個(gè)，通常約50至約200個(gè)，更通常地約100至約150個(gè)鄰接位置，其中可以將一個(gè)序列與相同數(shù)目的鄰接位置的參考序列在兩個(gè)序列最佳比對(duì)后進(jìn)行比較。用于比較的序列比對(duì)方法在本領(lǐng)域中是熟知的。用于比較的序列的最佳比對(duì)可以例如通過(guò)下列進(jìn)行：Smith and Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法；Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970的同源性比對(duì)算法；Pearson and Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:2444,1988的搜索相似性方法；這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)；或者手工比對(duì)和視覺(jué)觀察(參見(jiàn)，例如Brent et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(ringbou ed.,2003))。

適于測(cè)定序列同一性百分?jǐn)?shù)和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法的兩個(gè)實(shí)例是BLAST和BLAST 2.0算法，其被分別描述在Altschul et al.,Nuc.Acids Res.25:3389‐3402,1977；和Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403‐410,1990。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過(guò)National Center for Biotechnology Information(國(guó)家生物技術(shù)信息中心)公開(kāi)獲得。該算法涉及首先通過(guò)在查詢序列中識(shí)別長(zhǎng)度W的短字串識(shí)別高得分序列對(duì)(HSPs)，其當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字串對(duì)齊時(shí)或者匹配或者滿足一些正值閥分值T。T被稱為相鄰字串分值閥(Altschul et al.,同上)。這些初始相鄰字串命中(hit)作為啟動(dòng)搜尋以尋找包含它們的更長(zhǎng)HSPs的種子。字串命中沿著各個(gè)序列在兩個(gè)方向延伸直到可以增加累積對(duì)齊分值。對(duì)于核苷酸序列，采用參數(shù)M(對(duì)于一對(duì)匹配殘基，賞分值是>0)和N(對(duì)于錯(cuò)配殘基，罰分值總是<0)計(jì)算累計(jì)分值。對(duì)于氨基酸序列，得分矩陣被用于計(jì)算累計(jì)分值。當(dāng)下列情況時(shí)各方向上字串命中的延長(zhǎng)停止：累積對(duì)齊分值從其獲得的最大值下降量X；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)得分殘基對(duì)齊累積，累計(jì)分值達(dá)到零或以下；或者達(dá)到任意序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對(duì)的靈敏度和速度。BLASTN程序(對(duì)于核苷酸序列)采用默認(rèn)字長(zhǎng)(W)11，期望值(E)或10，M＝5，N＝‐4以及兩條鏈的比較。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序采用默認(rèn)字長(zhǎng)3，期望值(E)10，BLOSUM62得分矩陣(參見(jiàn)Henikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915,1989)對(duì)齊(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝‐4以及兩條鏈的比較。

BLAST算法也執(zhí)行兩序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見(jiàn)，例如Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873‐5787,1993)。BLAST算法所提供的相似性的一種度量是最小加和概率(P(N))，其提供了兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的匹配將偶然發(fā)生的概率表示。例如，如果測(cè)試核酸和參考核酸的比較中最小加和概率小于約0.2，更優(yōu)選地小于約0.01以及最優(yōu)選地小于約0.001，核酸被認(rèn)為與參考序列相似。

除了上面提到的序列同一性百分?jǐn)?shù)，兩個(gè)核酸或多肽基本同一的另一表示是由第一核酸編碼的多肽與針對(duì)由第二核酸編碼的多肽引起的抗體免疫學(xué)交叉反應(yīng)，如下所述。因此，舉例來(lái)說(shuō)，在兩肽區(qū)別僅在于保守置換的情況下，多肽與第二多肽一般基本上同一。兩核酸序列基本同一的另一表示是兩分子或它們的互補(bǔ)體在嚴(yán)格條件下相互雜交，如下所述。兩核酸序列基本同一的又一表示是可用相同的引物擴(kuò)增序列。

術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸(例如DNA)區(qū)段之間的功能關(guān)系。一般地，它是指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和轉(zhuǎn)錄序列的功能關(guān)系。舉例來(lái)說(shuō)，如果它刺激或調(diào)節(jié)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞或其他表達(dá)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄的話，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列被可操作地連接到編碼序列。一般，被可操作地連接到轉(zhuǎn)錄序列的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與轉(zhuǎn)錄序列在物理上是鄰接的，即它們是順式作用的。然而，一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列如增強(qiáng)子不需要與它們?cè)鰪?qiáng)其轉(zhuǎn)錄的編碼序列物理鄰接或位于其附近。

術(shù)語(yǔ)“載體”意欲指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)另一多核苷酸的多核苷酸分子，該另一多核苷酸與該多核苷酸分子連接。一種載體是“質(zhì)粒”，其是指另外的DNA區(qū)段可被連接到其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種載體是病毒載體，其中另外的DNA區(qū)段可被連接到病毒基因組。某些載體能在它們被引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動(dòng)物載體)可在引入到宿主細(xì)胞中后被整合到宿主細(xì)胞的基因組，并且因此與宿主基因組一起被復(fù)制。此外，某些載體能指導(dǎo)與它們可操作連接的基因表達(dá)。這樣的載體在本文被稱為“重組表達(dá)載體”(或者簡(jiǎn)單地，“表達(dá)載體”)。一般而言，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體通常是以質(zhì)粒的形式。在本說(shuō)明書中，當(dāng)質(zhì)粒是最常用的載體形式時(shí)，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可交換使用。然而，本公開(kāi)意欲包括這種其他形式的表達(dá)載體，諸如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)，其起到等同的功能。

術(shù)語(yǔ)“重組宿主細(xì)胞”(或者簡(jiǎn)單地，“宿主細(xì)胞”)是指已引入重組表達(dá)載體的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，這樣的術(shù)語(yǔ)意欲不僅指特定對(duì)象細(xì)胞而且指這種細(xì)胞的后代。因?yàn)槟承┬揎椨捎谕蛔兓颦h(huán)境影響可發(fā)生在后代中，這種后代事實(shí)上可能與親代細(xì)胞不相同，但仍被包括在如本文所用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”的范圍內(nèi)。

術(shù)語(yǔ)“靶抗原”是指針對(duì)其引起或另外產(chǎn)生(例如通過(guò)噬菌體展示)親代免疫球蛋白的抗原。

術(shù)語(yǔ)“未突變的免疫球蛋白”是指不包括至少一個(gè)用半胱氨酸殘基置換的突變的免疫球蛋白。如本文所用，未突變的免疫球蛋白可以是為了比較具有和不具有突變的免疫球蛋白的寡聚傾向或結(jié)合效率的目的的假設(shè)構(gòu)建物。舉例來(lái)說(shuō)，包含人源化突變以及用于結(jié)合目的的突變?yōu)榘腚装彼岬氖罂瓶贵w不是未突變的免疫球蛋白。未突變的免疫球蛋白將是具有人源化突變但不突變?yōu)榘腚装彼岬目贵w。在突變意欲起到包括提供結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的一個(gè)以上目的的情況下，未突變的免疫球蛋白不包括這樣的突變。

術(shù)語(yǔ)“聚集基序(aggregation motif)”是指根據(jù)下列方法歸類在一起的一組殘基。首先，識(shí)別SAP(半徑)大于0.15的殘基。然后識(shí)別在SAP(半徑)大于0.15的各個(gè)殘基的之內(nèi)的所有殘基。那么基序是SAP(半徑)大于0.15的殘基以及SAP(半徑)大于0.0在SAP(半徑)大于0.15的殘基的之內(nèi)的所有殘基。任何這種具有共同至少一個(gè)殘基的基序被反復(fù)合并成較大的基序直到?jīng)]有具有共同殘基的剩余基序。這些剩余基序或者殘基組構(gòu)成聚集基序。

在免疫球蛋白殘基以本文的編號(hào)被指代的情況下，殘基編號(hào)是指當(dāng)目標(biāo)免疫球蛋白序列與人IgG1免疫球蛋白比對(duì)時(shí)IgG1分子中相應(yīng)殘基的Kabat編號(hào)。通過(guò)參考的方式，人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定結(jié)構(gòu)域被比對(duì)：

C_H1結(jié)構(gòu)域

鉸鏈

C_H2結(jié)構(gòu)域

C_H3結(jié)構(gòu)域

C_L結(jié)構(gòu)域

V_H和V_L結(jié)構(gòu)域的比對(duì)可在Ewert、Honegger和Plüchthun,Methods 34(2004)184‐199中找到。

本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)合物

本發(fā)明涉及免疫球蛋白結(jié)合物，其包括具有至少一個(gè)免疫球蛋白表面的殘基突變的免疫球蛋白，其中該突變是用半胱氨酸殘基的置換。將置換的半胱氨酸殘基結(jié)合到原子或分子，所述分子或原子可以是，例如，細(xì)胞毒性劑(例如毒素如多柔比星或百日咳毒素)、熒光團(tuán)如熒光染料象熒光素或羅丹明、用于成像或放射治療的金屬的螯合劑、肽基或非肽基標(biāo)記或檢測(cè)標(biāo)簽、或清除修飾劑如聚乙二醇的各種同分異構(gòu)體、結(jié)合到第三組分的肽、或另一個(gè)碳水化合物或親脂劑。在另外的實(shí)施方式中，該分子可以是酶、肽、肽模擬物、核苷酸如RNA分子、包括siRNA、微小RNA和RNA模擬物、或適配體。

標(biāo)記的免疫球蛋白結(jié)合物

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的修飾的免疫球蛋白可與任何標(biāo)記部分結(jié)合，該標(biāo)記部分可通過(guò)反應(yīng)性半胱氨酸巰基共價(jià)地結(jié)合到免疫球蛋白(Singh et al(2002)Anal.Biochem.304:147‐15；Harlow E.and Lane,D.(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Lundblad R.L.(1991)Chemical Reagents for Protein Modification,2nd ed.CRC Press,Boca Raton,Fla.)。結(jié)合的標(biāo)記可起作用，例如：(i)提供可檢測(cè)的信號(hào)；(ii)與第二標(biāo)記相互作用以修飾由第一或第二標(biāo)記提供的可檢測(cè)的信號(hào)，例如以產(chǎn)生FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)；(iii)穩(wěn)定相互作用或增加與抗原或配體結(jié)合的親和性；(iv)通過(guò)電荷、疏水性、形狀或其它物理參數(shù)影響遷移率，例如電泳遷移率，或細(xì)胞滲透性，或(v)提供捕獲部分，以調(diào)節(jié)配體親和性、抗體/抗原結(jié)合或離子絡(luò)合。

標(biāo)記的免疫球蛋白結(jié)合物在診斷測(cè)定中是有用的，例如，用于檢測(cè)特定細(xì)胞、組織或血清中目的抗原的表達(dá)。為了診斷應(yīng)用，免疫球蛋白將通常用可檢測(cè)的部分標(biāo)記。許多標(biāo)記是可利用的，它們大體上可被分成以下示例性的類別：

(a)放射性同位素(放射性核素)，如³H、¹¹C、¹⁴C、¹⁸F、³²P、³⁵S、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹³³Xe、¹⁷⁷Lu、²¹¹At或²¹³Bi。放射性同位素標(biāo)記的免疫球蛋白在靶向受體的成像試驗(yàn)中是有用的。利用Current Protocols in Immunology,Volumes 1 and 2,Coligen et al,Ed.Wiley‐Interscience,New York,N.Y.,Pubs.(1991)中描述的技術(shù)，免疫球蛋白可用配體試劑標(biāo)記，該試劑結(jié)合、螯合或另外絡(luò)合放射性同位素金屬，在那里該試劑與免疫球蛋白的工程化半胱氨酸巰基反應(yīng)?？山j(luò)合金屬離子的螯合配體包括DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA和TETA(Macrocyclics,Dallas,Tex.)。放射性核素可通過(guò)與本發(fā)明的抗體‐藥物結(jié)合物的絡(luò)合而被靶向(Wu et al(2005)Nature Biotechnology 23(9):1137‐1146)。

適于作為用于成像試驗(yàn)的免疫球蛋白標(biāo)記的金屬‐螯合物絡(luò)合物被公開(kāi)：美國(guó)專利號(hào)5,342,606；5,428,155；5,316,757；5,480,990；5,462,725；5,428,139；5,385,893；5,739,294；5,750,660；5,834,456；Hnatowich et al(1983)J.Immunol.Methods 65:147‐157；Meares et al(1984)Anal.Biochem.142:68‐78；Mirzadeh et al(1990)Bioconjugate Chem.1:59‐65；Meares et al(1990)J.Cancer 1990,Suppl.10:21‐26；Izard et al(1992)Bioconjugate Chem.3:346‐350；Nikula et al(1995)Nucl.Med.Biol.22:387‐90；Camera et al(1993)Nucl.Med.Biol.20:955‐62；Kukis et al(1998)J.Nucl.Med.39:2105‐2110；Verel et al(2003)J.Nucl.Med.44:1663‐1670；Camera et al(1994)J.Nucl.Med.21:640‐646；Ruegg et al(1990)Cancer Res.50:4221‐4226；Verel et al(2003)J.Nucl.Med.44:1663‐1670；Lee et al(2001)Cancer Res.61:4474‐4482；Mitchell,et al(2003)J.Nucl.Med.44:1105‐1112；Kobayashi et al(1999)Bioconjugate Chem.10:103‐111；Miederer et al(2004)J.Nucl.Med.45:129‐137；DeNardo et al(1998)Clinical Cancer Research4:2483‐90；Blend et al(2003)Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals18:355‐363；Nikula et al(1999)J.Nucl.Med.40:166‐76；Kobayashi et al(1998)J.Nucl.Med.39:829‐36；Mardirossian et al(1993)Nucl.Med.Biol.20:65‐74；Roselli et al(1999)Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals,14:209‐20。

(b)熒光標(biāo)記如稀土螯合物(銪螯合物)、熒光素種類——包括FITC、5‐羧基熒光素、6‐羧基熒光素；包括TAMRA在內(nèi)的羅丹明種類；丹酰；麗絲胺；花青；藻紅蛋白；德克薩斯紅；和其類似物。利用，例如，上述Current Protocols in Immunology中公開(kāi)的技術(shù)，熒光標(biāo)記可被結(jié)合到免疫球蛋白。熒光染料和熒光標(biāo)記試劑包括從Invitrogen/Molecular Probes(Eugene,Oreg.)和Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,Ill.)商業(yè)上可獲得的那些熒光染料和熒光標(biāo)記試劑。

c)各種酶‐底物標(biāo)記是可獲得的或公開(kāi)的(美國(guó)專利號(hào)4,275,149)。酶通常催化生色底物的化學(xué)改變，利用各種技術(shù)該改變可被測(cè)量。例如，酶可催化底物的顏色改變，該顏色改變可通過(guò)分光光度方法測(cè)量?？蛇x地，酶可改變底物的熒光或化學(xué)發(fā)光。上面描述了定量熒光變化的技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光底物通過(guò)化學(xué)反應(yīng)變得電子激活并可然后發(fā)光，光可被測(cè)量(例如利用化學(xué)發(fā)光儀(chemiluminometer))或?qū)⒛芰抗┙o熒光接受器。酶標(biāo)記的例子包括螢光素酶(例如，熒火蟲(chóng)熒光素酶和細(xì)菌螢光素酶；美國(guó)專利號(hào)4,737,456)、螢光素、2,3‐二氫鄰苯二甲酰肼、蘋果酸脫氫酶、脲酶、過(guò)氧化物酶如辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、β‐半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖‐6‐磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過(guò)氧化物酶、微過(guò)氧化物酶和類似物。將酶與抗體結(jié)合的技術(shù)公開(kāi)在O'Sullivan et al(1981)"Methods for the Preparation of Enzyme‐Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay",于Methods in Enzym.(ed J.Langone&H.Van Vunakis),Academic Press,New York,73:147‐166中。

酶‐底物聯(lián)合的例子包括，例如：(i)以過(guò)氧化氫酶作為底物的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，其中過(guò)氧化氫酶氧化染料前體(例如，鄰苯二胺(OPD)或3,3',5,5'‐四甲基聯(lián)苯胺(TMB))；(ii)以對(duì)硝基苯基磷酸作為生色底物的堿性磷酸酶(AP)；和(iii)β‐D‐半乳糖苷酶(β‐D‐Gal)與生色底物(例如，p‐硝基苯基‐β‐D‐半乳糖苷酶)或熒光底物4‐甲基傘形基(methyl umbellifery)‐β‐D‐半乳糖苷酶。許多其它酶‐底物聯(lián)合對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是可獲得的。為了總覽，參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,275,149和4,318,980。

標(biāo)記可直接與本發(fā)明的修飾的免疫球蛋白結(jié)合。例如，免疫球蛋白可與生物素結(jié)合，上述標(biāo)記的任意三種寬類別可與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素結(jié)合，反之亦然。生物素選擇性地結(jié)合到鏈霉抗生物素，因此，該標(biāo)記可與免疫球蛋白以間接的方式結(jié)合?？蛇x地，為了獲得標(biāo)記與免疫球蛋白變體的間接結(jié)合，將免疫球蛋白變體與小的半抗原(例如，地高辛)結(jié)合，上述標(biāo)記的不同種類之一與抗半抗原多肽變體(例如，抗地高辛抗體)結(jié)合。因此，可獲得標(biāo)記與免疫球蛋白變體的間接結(jié)合(Hermanson,G.(1996)，于Bioconjugate Techniques Academic Press,San Diego).

本發(fā)明的修飾的免疫球蛋白和免疫球蛋白結(jié)合物可用于任何已知的測(cè)定方法，如ELISA、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定、直接和間接夾心測(cè)定、和免疫沉淀測(cè)定(Zola,(1987)單克隆抗體：技術(shù)手冊(cè)(Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques),pp.147‐158,CRC Press,Inc.)。

檢測(cè)標(biāo)記可用于定位、可視化和定量結(jié)合或識(shí)別事項(xiàng)。本發(fā)明的標(biāo)記的免疫球蛋白結(jié)合物可檢測(cè)細(xì)胞表面受體?？蓹z測(cè)的標(biāo)記的免疫球蛋白結(jié)合物的另一個(gè)用途是基于小珠的免疫捕獲的方法，包括將小珠與熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合和檢測(cè)結(jié)合配體之后的光信號(hào)。相似的結(jié)合檢測(cè)方法學(xué)利用表面等離子共振(SPR)效應(yīng)來(lái)測(cè)量和檢測(cè)抗體‐抗原相互作用。

檢測(cè)標(biāo)記如熒光染料和化學(xué)發(fā)光染料(Briggs et al(1997)"Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids,"J.Chem.Soc.,Perkin‐Trans.1:1051‐1058)提供可檢測(cè)的信號(hào)并通常應(yīng)用于標(biāo)記免疫球蛋白，優(yōu)選具有以下性質(zhì)：(i)標(biāo)記的免疫球蛋白應(yīng)產(chǎn)生具有低本底的非常高的信號(hào)，以便小量免疫球蛋白在無(wú)細(xì)胞和基于細(xì)胞的測(cè)定中可被敏感地檢測(cè)；和(ii)標(biāo)記的抗體應(yīng)是不感光的，以便熒光信號(hào)可被觀察、監(jiān)測(cè)和記錄，沒(méi)有顯著的光漂白。對(duì)于涉及標(biāo)記的抗體與膜或細(xì)胞表面的細(xì)胞表面結(jié)合的應(yīng)用，尤其是肝細(xì)胞，該標(biāo)記優(yōu)選(iii)具有好的水溶性以獲得有效的結(jié)合物濃度和檢測(cè)靈敏度，并且(iv)對(duì)活細(xì)胞是無(wú)毒的以不破壞正常的細(xì)胞代謝過(guò)程或引起早期細(xì)胞死亡。

細(xì)胞熒光強(qiáng)度的直接定量和熒光標(biāo)記的事項(xiàng)的計(jì)數(shù)，例如肽‐染料結(jié)合物的細(xì)胞表面結(jié)合可在系統(tǒng)(FMAT(TM)8100 HTS System,Applied Biosystems,Foster City,Calif.)上進(jìn)行，該系統(tǒng)自動(dòng)操作混合和讀取，用肝細(xì)胞或小珠的非放射性測(cè)定(Miraglia,"Homogeneous cell‐and bead‐based assays for throughput screening using fluorometric microvolume assay technology",(1999)J.of Biomolecular Screening 4:193‐204)。標(biāo)記的免疫球蛋白的用途還包括細(xì)胞表面受體結(jié)合測(cè)定、免疫捕獲測(cè)定、熒光聯(lián)免疫吸附測(cè)定(FLISA)、胱天蛋白酶‐分裂(Zheng,"Caspase‐3controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas‐mediated apoptosis in vivo",(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:618‐23；美國(guó)專利號(hào)6,372,907)、凋亡(Vermes,"A novel assay for apoptosis.Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V"(1995)J.Immunol.Methods 184:39‐51)和細(xì)胞毒性測(cè)定。微體積熒光數(shù)字圖像測(cè)定技術(shù)(Fluorometric microvolume assay technology)可用于通過(guò)靶向到細(xì)胞表面的分子鑒別上調(diào)和下調(diào)(Swartzman,"A homogeneous and multiplexed immunoassay for high‐throughput screening using fluorometric microvolume assay technology",(1999)Anal.Biochem.271:143‐51)。

標(biāo)記的本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)合物通過(guò)生物醫(yī)學(xué)和分子成像的各種方法和技術(shù)用作成像生物標(biāo)記和探針，如：(i)MRI(磁共振成像)；(ii)MicroCT(計(jì)算機(jī)控制斷層攝影術(shù))；(iii)SPECT(單光子發(fā)射型計(jì)算機(jī)體層攝影)；(iv)PET(正電子發(fā)射斷層攝影術(shù))Chen et al(2004)Bioconjugate Chem.15:41‐49；v)生物發(fā)光；(vi)熒光；和(vii)超聲。免疫閃爍成像是成像程序，其中將用放射性物質(zhì)標(biāo)記的抗體給予動(dòng)物或人類患者，獲取抗體在身體中定位的位點(diǎn)的圖片(美國(guó)專利號(hào)6,528,624)。成像生物標(biāo)記可被客觀地測(cè)量和評(píng)價(jià)為正常生物過(guò)程、致病過(guò)程或?qū)χ委煾深A(yù)的藥理學(xué)反應(yīng)的指示物。生物標(biāo)記可具有幾種類型：0型是疾病的自然史標(biāo)記并與已知的臨床指標(biāo)——例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的滑液炎癥的MRI評(píng)估——縱向地相關(guān)聯(lián)；I型標(biāo)記根據(jù)作用機(jī)制捕獲干預(yù)的效應(yīng)，即使該機(jī)制可能與臨床結(jié)果不相關(guān)；II型標(biāo)記充當(dāng)替代終點(diǎn)，在那里生物標(biāo)記的改變或來(lái)自生物標(biāo)記的信號(hào)預(yù)測(cè)臨床益處以“確認(rèn)”靶反應(yīng)，如通過(guò)CT測(cè)量的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的骨質(zhì)侵蝕。成像生物標(biāo)記因此可提供關(guān)于以下的藥物動(dòng)力(PD)治療信息：(i)靶蛋白的表達(dá)，(ii)治療劑與靶蛋白的結(jié)合，即選擇性，和(iii)清除和半衰期藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。體內(nèi)成像生物標(biāo)記相對(duì)于基于實(shí)驗(yàn)室的生物標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)包括：非創(chuàng)傷的治療、可以計(jì)量的、全身評(píng)估、重復(fù)給藥和評(píng)估，即多時(shí)間點(diǎn)，和從臨床前(小動(dòng)物)到臨床(人類)結(jié)果的潛在的可轉(zhuǎn)移的作用。對(duì)于一些應(yīng)用，生物成像置換或最小化臨床前研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的數(shù)量。

放射性核素成像標(biāo)記包括放射性核素如³H、¹¹C、¹⁴C、¹⁸F、³²P、³⁵S、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹³³Xe、¹⁷⁷Lu、²¹¹At或²¹³Bi。放射性核素金屬離子可與螯合連接體如DOTA絡(luò)合。連接體試劑如DOTA‐馬來(lái)酰亞胺(4‐馬來(lái)酰亞胺丁酰胺芐基(maleimidobutyramidobenzyl)‐DOTA)可通過(guò)由氯甲酸異丙酯(isopropylchloroformate)(Aldrich)激活的氨基芐基‐DOTA與4‐馬來(lái)酰亞胺丁酸(maleimidobutyric acid)(Fluka)反應(yīng)，之后是Axworthy et al(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(4):1802‐1807)的程序而被制備。DOTA‐馬來(lái)酰亞胺試劑與修飾的免疫球蛋白的游離半胱氨酸氨基酸反應(yīng)并在抗體上提供金屬絡(luò)合配體(Lewis et al(1998)Bioconj.Chem.9:72‐86)。螯合連接體標(biāo)記試劑如DOTA‐NHS(1,4,7,10‐四氮雜環(huán)十二烷‐1,4,7,10‐四乙酸單(N‐羥基琥珀酰亞胺酯)是商業(yè)上可獲得的(Macrocyclics,Dallas,Tex.)。具有放射性核素標(biāo)記的抗體的受體靶向成像可通過(guò)腫瘤組織中抗體的遞增的積累的檢測(cè)和定量而提供通路活化標(biāo)記(Albert et al(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8:1207‐1210)。溶酶體降解之后結(jié)合的放射金屬可保留在細(xì)胞內(nèi)。

肽標(biāo)記方法是眾所周知的。參見(jiàn)Haugland,2003,Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,Molecular Probes,Inc.；Brinkley,1992,Bioconjugate Chem.3:2；Garman,(1997)Non‐Radioactive Labelling:A Practical Approach,Academic Press,London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2；Glazer et al(1975)Chemical Modification of Proteins.Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology(T.S.Work and E.Work,Eds.)American Elsevier Publishing Co.,New York；Lundblad,R.L.and Noyes,C.M.(1984)Chemical Reagents for Protein Modification,Vols.I and II,CRC Press,New York；Pfleiderer,G.(1985)"Chemical Modification of Proteins",Modern Methods in Protein Chemistry,H.Tschesche,Ed.,Walter DeGryter,Berlin and New York；和Wong(1991)Chemistry of Protein Conjugation and Cross‐linking,CRC Press,Boca Raton,Fla.)；De Leon‐Rodriguez et al(2004)Chem.Eur.J.10:1149‐1155；Lewis et al(2001)Bioconjugate Chem.12:320‐324；Li et al(2002)Bioconjugate Chem.13:110‐115；Mier et al(2005)Bioconjugate Chem.16:240‐237。

用兩部分——位于足夠近的熒光報(bào)道分子和猝滅劑——標(biāo)記的肽和蛋白經(jīng)歷熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。報(bào)道基團(tuán)通常是熒光染料，其被一定波長(zhǎng)的光激發(fā)并將能量轉(zhuǎn)移給具有適當(dāng)斯托克斯位移(Stokes shift)的受體、或猝滅劑、基團(tuán)，用于以最大亮度發(fā)射。熒光染料包括具有延長(zhǎng)的芳香性的分子，如熒光素和羅丹明，和它們的衍生物。熒光報(bào)道分子可以部分或顯著地被未受損的肽中的猝滅劑部分淬滅。肽被肽酶或蛋白酶裂解之后，可檢測(cè)的熒光增加可被測(cè)量(Knight,C.(1995)"Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes",Methods in Enzymology,Academic Press,248:18‐34)。

本發(fā)明的標(biāo)記的抗體還可用作親和純化劑。在該過(guò)程中，利用本領(lǐng)域熟知的方法，將標(biāo)記的抗體固定在固相如葡聚糖凝膠樹(shù)脂或?yàn)V紙上。將固定的抗體與含有將被純化的抗原的樣品接觸，此后用合適的溶劑洗支持物，該溶劑將基本上去除樣品中除了將要純化的抗原外的所有物質(zhì)，該抗原結(jié)合到固定的多肽變體。最后，用另一種合適的溶劑如甘氨酸緩沖液，pH 5.0洗支持物，其將使抗原從多肽變體釋放。

標(biāo)記試劑通常具有反應(yīng)的功能性，其可(i)直接與修飾的免疫球蛋白的半胱氨酸巰基反應(yīng)以形成標(biāo)記的抗體，(ii)與連接體試劑反應(yīng)以形成連接體‐標(biāo)記中間體，或(iii)與連接體抗體反應(yīng)以形成標(biāo)記的抗體。標(biāo)記試劑的反應(yīng)功能性包括：馬來(lái)酰亞胺、鹵代乙?；?haloacetyl)、碘乙酰胺琥珀酰亞胺酯(iodoacetamide succinimidyl ester)(例如NHS、N‐羥基琥珀酰亞胺)、異硫氰酸酯、磺酰氯、2,6‐二氯三嗪基(dichlorotriazinyl)、五氟苯酯(pentafluorophenyl ester)和亞磷酰胺，盡管也可利用其它的官能團(tuán)。

示例性的反應(yīng)官能團(tuán)是可檢測(cè)標(biāo)記的羧基取代基的N‐羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)，例如生物素或熒光染料。標(biāo)記的NHS酯可被預(yù)先形成、分離、純化和/或鑒定，或它可在原位形成并與抗體的親核基團(tuán)反應(yīng)。通常，標(biāo)記的羧基形式由與碳二亞胺試劑例如二環(huán)己基碳二亞胺、二異丙基碳二亞胺或脲陽(yáng)離子，例如TSTU(O‐‐(N‐琥珀酰亞胺基)‐N,N,N',N'‐四甲基脲四氟硼酸酯(tetramethyluronium tetrafluoroborate)、HBTU(O‐苯并三唑(benzotriazol)‐1‐基)‐N,N,N',N'‐四甲基脲六氟磷酸酯(tetramethyluronium hexafluorophosphate))、或HATU(O‐(7‐偶氮苯并三唑(azabenzotriazol)‐1‐基)‐N,N,N',N'‐四甲基脲六氟磷酸酯)，激活劑，如1‐羥基苯并三唑(HOBt)和N‐羥基琥珀酰亞胺的一些組合而被活化以產(chǎn)生標(biāo)記的NHS酯。在一些情況下，標(biāo)記和抗體可通過(guò)標(biāo)記的原位激活和與抗體反應(yīng)而被偶聯(lián)以在一個(gè)步驟中形成標(biāo)記‐抗體結(jié)合物。其它激活和連結(jié)試劑包括TBTU(2‐(1H‐苯并三唑(benzotriazo)‐1‐基)‐1‐1,3,3‐四甲基脲六氟磷酸酯)、TFFH(N,N',N”,N”'‐四甲基脲2‐氟‐六氟磷酸酯)、PyBOP(苯并三唑‐1‐基‐氧‐三‐吡咯烷子基(pyrrolidino)‐磷六氟磷酸酯、EEDQ(2‐乙氧基‐1‐乙氧羰基‐1,2‐二氫‐喹啉)、DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)；DIPCDI(二異丙基碳二亞胺)、MSNT(1‐(三甲基苯‐2‐磺酰基)‐3‐硝基‐1H‐1,2,4‐三唑和芳基磺酰基鹵化物，例如三異丙基苯磺酰氯。

因此本發(fā)明的目的是提供如[0007]段中討論的免疫球蛋白結(jié)合物和它們的實(shí)施方式的任意和所有組合作為診斷工具的用途。

因此本發(fā)明的目的是提供如[0007]段中討論的免疫球蛋白結(jié)合物和它們的實(shí)施方式的任意和所有組合作為高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物的用途。

免疫球蛋白聚合物結(jié)合物

在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明還考慮免疫球蛋白結(jié)合物，其中免疫球蛋白與聚合物連接。通常，聚合物是水溶性的，以便免疫球蛋白組分在水性環(huán)境，如生理環(huán)境中不沉淀。合適的聚合物的例子是已被修飾具有單個(gè)反應(yīng)基的聚合物，如用于酰化的活性酯或用于烷基化的醛。以這種方式，聚合的程度可被控制。反應(yīng)性醛的例子是聚乙二醇丙醛、或單‐(C₁‐C₁₀)烷氧基、或其芳氧基衍生物(參見(jiàn)，例如，Harris,et al.,美國(guó)專利號(hào)5,252,714)。聚合物可分枝或不分枝。而且，聚合物的混合物可用于產(chǎn)生與抗體組分的結(jié)合物。

合適的水溶性聚合物沒(méi)有限制地包括，聚乙二醇(PEG)、單甲氧基‐PEG、單‐(C₁‐C₁₀)烷氧基‐PEG、芳氧基‐PEG、聚‐(N‐乙烯基吡咯烷酮)PEG、三氟代乙磺酰(tresyl)單甲氧基PEG、PEG丙醛、雙‐琥珀酰亞胺碳酸鹽PEG、丙二醇均聚物、聚丙烯氧化物/環(huán)氧乙烷共聚合物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇、葡聚糖、纖維素或其它基于碳水化合物的聚合物。合適的PEG可具有約600至約60,000的分子量，包括，例如，5,000、12,000、20,000和25,000。結(jié)合物還可包括這樣的水溶性聚合物的混合物。

作為例證，聚烷基氧化物(polyalkyl oxide)部分可被連接到免疫球蛋白組分的N‐端。PEG是一個(gè)合適的聚烷基氧化物。例如，免疫球蛋白可以用PEG修飾，稱作“聚乙二醇化”過(guò)程。免疫球蛋白的聚乙二醇化可通過(guò)本領(lǐng)域已知的聚乙二醇化反應(yīng)進(jìn)行(參見(jiàn)，例如，EP 0 154 316,Delgado et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249(1992)、Duncan and Spreafico,Clin.Pharmacokinet.27:290(1994),and Francis et al.,Int J Hematol 68:1(1998))。例如，聚乙二醇化可通過(guò)?；磻?yīng)或通過(guò)與反應(yīng)性聚乙二醇分子的烷基化反應(yīng)進(jìn)行。在可選的方法中，免疫球蛋白結(jié)合物通過(guò)凝結(jié)活化的PEG而形成，其中PEG的末端羥基或氨基已被活化的連接體替代(參見(jiàn)，例如，Karasiewicz et al.,美國(guó)專利號(hào)5,382,657)。

通過(guò)酰化的聚乙二醇化通常要求將PEG的活性酯衍生物與免疫球蛋白反應(yīng)。活化的PEG酯的例子是酯化到N‐羥基琥珀酰亞胺的PEG。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“?；卑庖咔虻鞍缀退苄跃酆衔镏g以下類型的連接：酰胺、氨基甲酸酯、氨基甲酸乙酯和類似物。通過(guò)?；苽渚垡叶伎笲CMA‐TACI免疫球蛋白的方法將通常包括以下步驟：(a)使免疫球蛋白與PEG(如PEG的醛衍生物的活性酯)在條件下反應(yīng)，借此一個(gè)或多個(gè)PEG基團(tuán)連接到免疫球蛋白，和(b)獲得反應(yīng)產(chǎn)物(或多個(gè))。一般而言，酰化反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件將根據(jù)已知參數(shù)和期望的結(jié)果而定。例如，PEG：抗體組分的比越大、聚乙二醇化抗體組分產(chǎn)物的百分比越大。

通過(guò)?；木垡叶蓟漠a(chǎn)物通常是聚乙二醇化免疫球蛋白產(chǎn)物，其中賴氨酸ε‐氨基通過(guò)酰基連接基團(tuán)被聚乙二醇化。連接鍵的例子是酰胺。通常，得到的免疫球蛋白組分將是至少95％單、雙或三聚乙二醇化，盡管一些具有較高聚乙二醇化程度的種類可根據(jù)反應(yīng)條件而形成。利用標(biāo)準(zhǔn)的純化方法，如透析、超濾、離子交換層析、親和層析等方法可將聚乙二醇化種類與未結(jié)合的免疫球蛋白組分分離。

通過(guò)烷基化的聚乙二醇化通常包括在存在還原劑的條件下使PEG的末端醛衍生物與免疫球蛋白組分反應(yīng)。PEG基團(tuán)可通過(guò)‐‐CH₂—NH基團(tuán)被連接到多肽。

通過(guò)還原性烷基化以產(chǎn)生單聚乙二醇產(chǎn)物的衍生利用衍生可利用的不同類型的主要氨基的差別反應(yīng)性。通常，該反應(yīng)在允許人們利用蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基的ε‐氨基與N‐端殘基的α‐氨基之間的pKa差別的pH進(jìn)行。通過(guò)這種選擇性的衍生，控制含有反應(yīng)基如醛的水溶性聚合物結(jié)合到蛋白質(zhì)。與聚合物的結(jié)合主要發(fā)生在沒(méi)有其它反應(yīng)基如賴氨酸側(cè)鏈氨基的顯著修飾的蛋白質(zhì)的N‐端。

產(chǎn)生單聚合物(monopolymer)抗體組分結(jié)合物分子基本上同源群體的還原性烷基化可包括以下步驟：(a)使抗體組分與活性PEG在還原性烷基化條件下在適于允許α‐氨基的選擇性修飾的pH在抗體組分的氨基端反應(yīng)，和(b)獲得反應(yīng)產(chǎn)物(或多個(gè))。用于還原性烷基化的還原劑應(yīng)在水溶液中穩(wěn)定和優(yōu)選能只還原在還原性烷基化的最初過(guò)程中形成的希夫堿。優(yōu)選的還原劑包括硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、二甲胺硼烷、三甲胺硼烷和吡啶硼烷。

對(duì)于單聚合物免疫球蛋白結(jié)合物的基本上同源的群體，還原性烷基化反應(yīng)條件是允許水溶性聚合物部分選擇性的連接到免疫球蛋白N端的那些條件。這樣的反應(yīng)條件通常提供在N端賴氨酸氨基和α‐氨基之間的pKa差異。該pH還影響聚合物與將使用的蛋白質(zhì)的比例。一般而言，如果pH較低，那么將期望聚合物對(duì)蛋白質(zhì)的較大過(guò)量，因?yàn)榛钚訬‐端α‐基團(tuán)越少，就需要越多的聚合物來(lái)達(dá)到最適條件。如果pH較高，那么聚合物：抗體組分不需要這樣大，因?yàn)楦嗟姆磻?yīng)基可利用。通常，pH將落入3至9或3至6的范圍。

產(chǎn)生包括多肽和水溶性聚合物部分的結(jié)合物的一般方法是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)，例如，Karasiewicz et al.,美國(guó)專利號(hào)5,382,657、Greenwald et al.,美國(guó)專利號(hào)5,738,846、Nieforth et al.,Clin.Pharmacol.Ther.59:636(1996)、Monkarsh et al.,Anal Biochem.247:434(1997))。

免疫球蛋白藥物結(jié)合物

在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括免疫球蛋白結(jié)合物，其中免疫球蛋白結(jié)合到藥物或細(xì)胞毒性部分。免疫球蛋白藥物結(jié)合物的藥物部分可，例如，包括具有細(xì)胞毒性效應(yīng)或抑制細(xì)胞效應(yīng)的任何化合物、部分或基團(tuán)。藥物部分沒(méi)有限制地包括：(i)化學(xué)治療劑，其可充當(dāng)微管蛋白抑制劑、有絲分裂抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑或DNA嵌入劑；(ii)蛋白毒素，其可起到酶的作用；和(iii)放射性同位素。

示例性的藥物部分包括但不限于美登木素生物堿、奧利斯汀、多拉司他汀、單端孢霉烯、CC1065、加利車霉素和其它烯二炔類抗生素、紫杉烷、蒽環(huán)類抗生素和其立體異構(gòu)體、同電子排列體、類似物或衍生物。

適于用作美登木素生物堿藥物部分的美坦辛化合物是本領(lǐng)域已知的，并可根據(jù)已知方法從天然來(lái)源分離、利用基因工程技術(shù)產(chǎn)生(參見(jiàn)Yu et al(2002)PROC.NAT.ACAD.SCI.(USA)99:7968‐7973)，或根據(jù)已知方法合成制備的美登醇和美登醇類似物。

示例性的美登木素生物堿藥物部分包括具有修飾的芳環(huán)，如：C‐19‐脫氯(dechloro)(美國(guó)專利號(hào)4,256,746)(由安絲菌素(ansamytocin)P2的氫化鋁鋰還原制備)；C‐20‐羥基(或C‐20‐去甲基(demethyl))+/‐C‐19‐脫氯(美國(guó)專利號(hào)4,361,650和4,307,016)(由利用鏈霉菌屬或放線菌屬的去甲基或利用LAH的脫氯制備)；和C‐20‐去甲氧基(demethoxy)、C‐20‐酰氧基(‐‐OCOR),+/‐脫氯(美國(guó)專利號(hào)4,294,757)(由利用酰氯的酰化制備)的那些美登木素生物堿藥物部分和在其它位置具有修飾的那些美登木素生物堿藥物部分。

示例性的美登木素生物堿藥物部分還包括具有如下修飾的那些：C‐9‐SH(美國(guó)專利號(hào)4,424,219)(由美登醇與H₂S或P₂S₅的反應(yīng)制備)；C‐14‐烷氧基甲基(去甲氧基/CH₂OR)(美國(guó)專利號(hào)4,331,598)；C‐14‐羥甲基或酰氧基甲基(CH₂OH或CH₂OAc)(美國(guó)專利號(hào)4,450,254)(由諾卡氏菌屬(Nocardia)制備)；C‐‐I 5‐羥基/酰氧基(美國(guó)專利號(hào)4,364,866)(由鏈霉菌屬轉(zhuǎn)化美登醇制備)；C‐15‐甲氧基(美國(guó)專利號(hào)4,313,946和4,315,929)(分離自Trewia nudlflora)；C‐18‐N‐去甲基(美國(guó)專利號(hào)4,362,663和4,322,348)(由用鏈霉菌屬去甲基美登醇制備)；和4,5‐脫氧(美國(guó)專利號(hào)4,371,533)(由美登醇的三氯化鈦/LAH還原制備)。已知美坦辛化合物上的許多位置用于作為連接位置，取決于連接的類型。例如，為了形成酯鍵，具有羥基的C‐3位、用羥甲基修飾的C‐14位、用羥基修飾的C‐15位和具有羥基的C‐20位都是合適的。

美坦辛化合物通過(guò)抑制微管蛋白、微管素的聚合，抑制有絲分裂過(guò)程中微管的形成而抑制細(xì)胞增殖(Remillard et al(1975)Science 189:1002‐1005)。美坦辛和美登木素生物堿是高細(xì)胞毒性的，但是它們?cè)诎┌Y治療中的臨床應(yīng)用已大大受限于它們嚴(yán)重的全身副作用，該副作用主要源于它們對(duì)腫瘤的選擇性差。由于對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸系統(tǒng)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，利用美坦辛的臨床試驗(yàn)已中斷了(Issel et al(1978)Can.Treatment.Rev.5:199‐207)。

美登木素生物堿藥物部分是免疫球蛋白藥物結(jié)合物中有吸引力的藥物部分，因?yàn)樗鼈儯?i)相對(duì)易于通過(guò)發(fā)酵或化學(xué)修飾、發(fā)酵產(chǎn)物的衍生而制備，(ii)順從于與適于通過(guò)非‐二硫化物連接體結(jié)合到抗體的官能團(tuán)的衍生化，(iii)在血漿中穩(wěn)定，和(iv)有效抵抗許多種腫瘤細(xì)胞系(US 2005/0169933；WO 2005/037992：美國(guó)專利號(hào)5,208,020)。

與其它藥物部分一樣，為本發(fā)明的化合物考慮了美登木素生物堿藥物部分的所有立體異構(gòu)體。

免疫球蛋白藥物結(jié)合物的藥物部分還包括多拉司他汀和它們的肽類似物和衍生物——奧利斯汀(美國(guó)專利號(hào)5,635,483；5,780,588)。多拉司他汀和奧利斯汀已顯示干擾微管動(dòng)力學(xué)、GTP水解和核分裂和細(xì)胞分裂(Woyke et al(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580‐3584)和具有抗癌癥(美國(guó)專利號(hào)5,663,149)和抗真菌活性(Pettit et al(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961‐2965)。各種形式的多拉司他汀或奧利斯汀藥物部分可通過(guò)肽藥物部分的N(氨基)端或C(羧基)端共價(jià)地連接到抗體(WO 02/088172；Doronina et al(2003)Nature Biotechnology 21(7):778‐784；Francisco et al(2003)Blood102(4):1458‐1465)。

示例性的奧利斯汀實(shí)施方式包括N端連接的單甲基奧利斯汀藥物部分DE和DF，公開(kāi)在WO 2005/081711；Senter et al,Proceedings of the American Association for Cancer Research,Volume 45,Abstract Number 623，2004年3月28日出現(xiàn)，其中每個(gè)公開(kāi)以其全部通過(guò)引用被清楚地并入。

通常，基于肽的藥物部分可通過(guò)在兩個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或肽片段之間形成肽鍵而制備。這樣的肽鍵可例如，根據(jù)液相合成方法(參見(jiàn)E.Schroder and K.Luibke,"The Peptids",volume 1,pp 76‐136,1965,Academic Press)被制備，該方法在肽化學(xué)領(lǐng)域是眾所周知的。

藥物部分包括加利車霉素、和其類似物和衍生物。抗生素的加利車霉素家族能在亞皮摩爾濃度引起雙鏈DNA斷裂。對(duì)于加利車霉素家族的結(jié)合物的制備，參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701,5,770,710；5,773,001；5,877,296?？衫玫募永嚸顾氐慕Y(jié)構(gòu)類似物包括但不限于γ₁^I、α₂^I、α₃^I、N‐acetyl‐γ₁^I、PSAG和θ^I₁(Hinman et al Cancer Research 53:3336‐3342(1993),Lode et al Cancer Research 58:2925‐2928(1998)。

蛋白毒素包括，例如，白喉A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A鏈(Vitetta et al(1987)Science,238:1098)、相思豆毒素(abrin)A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α‐次黃嘌呤、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP‐S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、石堿草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹(shù)毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢霉烯族化合物(tricothecenes)(WO93/21232)。

治療性放射性同位素包括，例如，²P、³³P、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、¹³¹In、¹⁵³Sm、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、²¹¹At、²¹²Bi、²¹²Pb、和Lu的放射性同位素。

放射性同位素或其它標(biāo)記可以以已知方法被摻入到結(jié)合物中(Fraker et al(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49‐57；"Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy"Chatal,CRC Press 1989)。碳14標(biāo)記的1‐異硫氰酸酯基苯基(isothiocyanatobenzyl)‐3‐甲基二乙烯三胺五乙酸(methyldiethylene triaminepentaacetic acid)(MX‐DTPA)是用于放射性核素與抗體結(jié)合的示例性的螯合劑(WO 94/11026)。

連接體

在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物包括具有至少兩個(gè)活性位點(diǎn)的連接分子。一個(gè)活性位點(diǎn)連接到免疫球蛋白的置換的半胱氨酸殘基，其它活性位點(diǎn)連接到原子或分子?！斑B接體”是雙功能或多功能部分，其可用于連接一個(gè)或多個(gè)藥物部分和免疫球蛋白單元以形成免疫球蛋白結(jié)合物。利用具有結(jié)合到藥物或其它分子和結(jié)合到免疫球蛋白的反應(yīng)功能性的連接體可方便地制備免疫球蛋白結(jié)合物。具有半胱氨酸置換的修飾的免疫球蛋白的半胱氨酸巰基可與連接體試劑、藥物部分或藥物‐連接體中間體的官能團(tuán)形成鍵。

一方面，連接體具有活性位點(diǎn)，該活性位點(diǎn)具有與存在于抗體上的親核半胱氨酸反應(yīng)的親電子基團(tuán)?？贵w的半胱氨酸巰基與連接體上的親電子基團(tuán)反應(yīng)并與連接體形成共價(jià)鍵。有用的親電子基團(tuán)包括，但不限于馬來(lái)酰亞胺和鹵乙酰胺(haloacetamide)基團(tuán)。

根據(jù)Klussman,et al(2004),Bioconjugate Chemistry 15(4):765‐773的766頁(yè)的結(jié)合方法，本發(fā)明的修飾的免疫球蛋白與連接體試劑或藥物‐連接體中間體反應(yīng)，與親電子的官能團(tuán)如馬來(lái)酰亞胺或α‐鹵素羰基反應(yīng)。

連接體可包括氨基酸殘基。氨基酸單元，當(dāng)存在時(shí)，連接免疫球蛋白與本發(fā)明的免疫球蛋白藥物結(jié)合物的藥物部分。

氨基酸連接體可以是，例如，二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽單元。包括氨基酸單元的氨基酸殘基包括天然存在的那些氨基酸殘基，以及次要氨基酸(minor amino acids)和非天然存在的氨基酸類似物，如瓜氨酸。

氨基酸單元可被一種或多種酶——包括腫瘤相關(guān)的蛋白酶——酶促裂解，以釋放藥物部分。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，連接體可以是用于超過(guò)一個(gè)藥物部分通過(guò)分枝的、多功能連接體部分與抗體共價(jià)結(jié)合的樹(shù)枝型連接體(Sun et al(2002)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 12:2213‐2215；Sun et al(2003)Bioorganic&Medicinal Chemistry 11:1761‐1768)。樹(shù)枝連接體可增加藥物與抗體的摩爾比，即負(fù)載，這與免疫球蛋白藥物結(jié)合物的能力有關(guān)。因此，當(dāng)修飾的免疫球蛋白只具有一個(gè)活性半胱氨酸巰基時(shí)，許多藥物部分可通過(guò)樹(shù)枝連接體結(jié)合。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，連接體可被調(diào)節(jié)溶解度或反應(yīng)性的基團(tuán)置換。例如，依賴用于制備免疫球蛋白結(jié)合物的合成途徑，帶有電荷的取代基如磺酸鹽(‐‐SO₃^‐)或銨，可增加試劑的水溶性和促進(jìn)連接體試劑與免疫球蛋白或藥物部分的偶聯(lián)反應(yīng)，或促進(jìn)免疫球蛋白‐連接體中間體與藥物部分、或藥物‐連接體中間體與免疫球蛋白的偶聯(lián)反應(yīng)。

本發(fā)明的化合物清楚地考慮，但不限于用以下連接體試劑制備的免疫球蛋白結(jié)合物：BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC‐SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代‐EMCS、硫代‐GMBS、硫代‐KMUS、硫代‐MBS、硫代‐SIAB、硫代‐SMCC、和硫代‐SMPB、和SVSB(琥珀酰亞胺‐(4‐乙烯砜)苯甲酸鹽)，并包括雙馬來(lái)酰亞胺試劑：DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM(PEO)₃和BM(PEO)₄，它們商業(yè)上可購(gòu)自Pierce Biotechnology,Inc.,Customer Service Department,P.O.Box 117,Rockford,Ill.61105 U.S.A,U.S.A1‐800‐874‐3723,International+815‐968‐0747。參見(jiàn)2003‐2004 Applications Handbook and Catalog第467‐498頁(yè)。雙馬來(lái)酰亞胺試劑允許半胱氨酸的巰基以相繼或同時(shí)發(fā)生的方式與含有巰基的藥物部分、標(biāo)記或連接體中間體結(jié)合。除馬來(lái)酰亞胺外的其它官能團(tuán)——其與半胱氨酸的巰基、藥物部分、標(biāo)記或連接體中間體反應(yīng)——沒(méi)有限制地包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、異氰酸鹽和異硫氰酸鹽。

因此本發(fā)明的目的是提供免疫球蛋白結(jié)合物，其包括在選自7(V_H)、20(V_L)、22(V_L)、25(V_H)、125(C_H1)、248(C_H2)、254(C_H2)、286(C_H2)、298(C_H2)和326(C_H2)的殘基處具有至少一個(gè)突變的免疫球蛋白，其中至少一個(gè)突變是用半胱氨酸殘基和原子或分子的置換，其中原子或分子結(jié)合到半胱氨酸殘基。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)突變是在選自7(V_H)、20(V_L)、22(V_L)和125(C_H1)處的殘基。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)突變是在選自248(C_H2)和326(C_H2)處的殘基。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)突變是在選自25(V_H)和286(C_H2)處的殘基。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)突變是在選自254(C_H2)和298(V_H)處的殘基。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物包括人C_H1結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物包括人C_H2結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物包括人C_H3結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物包括人C_L結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物包括人V_H結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物包括人V_L結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物進(jìn)一步包括具有至少兩個(gè)活性位點(diǎn)的連接分子，其中第一個(gè)活性位點(diǎn)結(jié)合到免疫球蛋白的半胱氨酸殘基，第二個(gè)活性位點(diǎn)結(jié)合到原子或分子。在與前述具有連接分子的實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，連接分子選自腙、二硫化物、肽、螯合劑和馬來(lái)酰亞胺。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，原子或分子選自放射性核素、化學(xué)治療劑、微生物毒素、植物毒素、聚合物、碳水化合物、細(xì)胞因子、熒光標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、酶‐底物標(biāo)記、酶、肽、肽模擬物、核苷酸、siRNA、微小RNA、RNA模擬物和適配體。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，原子或分子選自⁹⁰Y、¹³¹I、⁶⁷Cu、¹⁷⁷Lu、²¹³Bi、²¹¹At、加利車霉素、倍癌霉素、美登木素生物堿、奧利斯汀、蒽環(huán)類化合物、假單胞菌外毒素A、白喉毒素、篦麻毒素、聚乙二醇、羥乙基淀粉和甘露糖基殘基。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，原子或分子降低未突變免疫球蛋白的免疫原性。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，原子或分子增加未突變免疫球蛋白的免疫原性。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物進(jìn)一步包括抗原結(jié)合活性并且該活性是未突變免疫球蛋白抗原結(jié)合活性的至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％或至少130％。

因此本發(fā)明的目的是提供修飾或分離的免疫球蛋白，其包括在選自7(V_H)、20(V_L)、22(V_L)、25(V_H)、125(C_H1)、248(C_H2)、254(C_H2)、286(C_H2)和326(C_H2)殘基處的至少一個(gè)突變，其中至少一個(gè)突變是用半胱氨酸殘基的置換。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)突變是在選自7(V_H)、20(V_L)、22(V_L)和125(C_H1)處的殘基。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)突變是在選自248(C_H2)和326(C_H2)處的殘基。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)突變是在選自25(V_H)和286(C_H2)處的殘基。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)突變是在殘基254(C_H2)處。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾或分離的免疫球蛋白包括人C_H1結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾或分離的免疫球蛋白包括人C_H2結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾或分離的免疫球蛋白包括人C_H3結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾或分離的免疫球蛋白包括人C_L結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾或分離的免疫球蛋白包括人V_H結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾或分離的免疫球蛋白包括人V_L結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白進(jìn)一步包括抗原結(jié)合活性并且該活性是未突變免疫球蛋白抗原結(jié)合活性的至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％或至少130％。

免疫球蛋白藥物結(jié)合物的制備

一方面，本發(fā)明包括生產(chǎn)免疫球蛋白結(jié)合物的方法。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)、條件和試劑，免疫球蛋白藥物結(jié)合物可通過(guò)幾個(gè)途徑制備，包括：(1)修飾的免疫球蛋白的半胱氨酸基團(tuán)與連接體試劑反應(yīng)，以通過(guò)共價(jià)鍵形成免疫球蛋白‐連接體中間體，之后與活化的藥物部分反應(yīng)；和(2)藥物部分的親核基團(tuán)與連接體試劑反應(yīng)，以通過(guò)共價(jià)鍵形成藥物‐連接體中間體，之后與修飾的免疫球蛋白的半胱氨酸基團(tuán)反應(yīng)。結(jié)合方法(1)和(2)可利用多種修飾的免疫球蛋白、藥物部分和連接體以制備本發(fā)明的免疫球蛋白藥物結(jié)合物。

抗體半胱氨酸巰基是親核的并能與連接體試劑和藥物‐連接體中間體上的親電子基團(tuán)反應(yīng)以形成共價(jià)鍵，連接體試劑和藥物‐連接體中間體包括：(i)活性酯如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸鹽(haloformates)和酸性鹵化物；(ii)烷基和芐基鹵化物，如鹵乙酰胺(haloacetamides)；(iii)醛、酮、羧基和馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)；和(iv)通過(guò)硫化物交換的二硫化物，包括吡啶基二硫化物。藥物部分上的親核基團(tuán)包括，但不限于：能與連接體部分和連接體試劑上的親電子基團(tuán)反應(yīng)以形成共價(jià)鍵的胺、巰基、羥基、酰肼、肟、肼、氨硫脲、肼羧化物和芳酰肼基(arylhydrazide groups)。

美坦辛可以，例如轉(zhuǎn)化為May‐SSCH₃，其可被還原為游離的巰基May‐SH，并與修飾的抗體反應(yīng)(Chari et al(1992)Cancer Research 52:127‐131)以產(chǎn)生具有二硫化物連接體的美登木素生物堿‐抗體免疫結(jié)合物。具有二硫化物連接體的抗體‐美登木素生物堿結(jié)合物已被報(bào)道(WO 04/016801；美國(guó)專利號(hào)6,884,874；US2004/039176 A1；WO 03/068144；US 2004/001838 A1；美國(guó)專利號(hào)6,441,163、5,208,020、5,416,064；WO 01/024763)。二硫化物連接體SPP由連接體試劑N‐琥珀酰亞胺4‐(2‐吡啶基硫代(pyridylthio))戊酸酯構(gòu)成。

在某些條件下，通過(guò)用還原劑如DTT(Cleland's試劑、二硫蘇糖醇)或TCEP(三(2‐羧乙基)膦氫氯化物；Getz et al(1999)Anal.Biochem.Vol 273:73‐80；Soltec Ventures,Beverly,Mass.)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它還原劑處理，可以使修飾的免疫球蛋白有活性，用于與連接體試劑結(jié)合。

因此本發(fā)明的目的是提供生產(chǎn)免疫球蛋白結(jié)合物的方法，通過(guò)如下步驟進(jìn)行：提供如段落[0008]或[0019]和它們的實(shí)施方式的任意和所有組合中所討論的修飾或分離的免疫球蛋白，用還原劑還原一個(gè)或多個(gè)置換的半胱氨酸殘基以形成還原的半胱氨酸殘基的方法，和溫育免疫球蛋白和原子或分子，其中所述原子或分子與還原的半胱氨酸殘基反應(yīng)以形成免疫球蛋白結(jié)合物。

空間聚集傾向

一方面，本文的發(fā)明涉及選擇蛋白質(zhì)表面上的殘基以突變?yōu)榘腚装彼岬姆椒ê徒档托揎椀拿庖咔虻鞍谆蛎庖咔虻鞍捉Y(jié)合物的交聯(lián)的方法。本發(fā)明可用于產(chǎn)生具有降低的交聯(lián)傾向的免疫球蛋白和免疫球蛋白結(jié)合物，即，濃縮的溶液中的免疫球蛋白或免疫球蛋白結(jié)合物保持基本上單體形式而不是較高有序聚集的多聚體。本文的方法代表了評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)交聯(lián)傾向的計(jì)算方法的能力進(jìn)步。特別地，這些方法至少部分基于SAA(溶劑可及面積)的計(jì)算，其在本領(lǐng)域已知用于表征蛋白質(zhì)的表面。SAA給出與溶劑接觸的每個(gè)氨基酸或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的表面積。當(dāng)探針球在蛋白質(zhì)表面，即蛋白結(jié)構(gòu)模型的表面上翻滾時(shí)，可典型地通過(guò)計(jì)算探針球體的中心軌跡計(jì)算SAA。探針球體具有與水分子相同的半徑，下面描述的計(jì)算SAA的可選方法是本領(lǐng)域已知的并與本文描述的方法一致。盡管SAA對(duì)表征蛋白質(zhì)的表面非常有用，但是由于下面的缺點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)它不足以表征蛋白質(zhì)表面上潛在的易聚集的疏水碎片(patch)，

1.SAA不區(qū)分疏水和親水區(qū)域

2.SAA與殘基的疏水性不成正比(例如，MET具有較LEU更多的表面面積，但是較不疏水)

3.SAA沒(méi)有表明幾個(gè)疏水殘基是否是鄰近的，并因此能增強(qiáng)某一區(qū)域的疏水性。這些殘基在一級(jí)序列或三級(jí)結(jié)構(gòu)——即使它們?cè)谝患?jí)序列上很遠(yuǎn)——可為鄰近的。不管怎樣，它們能增強(qiáng)抗體表面上某一碎片的疏水性。

通過(guò)根據(jù)下面的公式計(jì)算暴露的氨基酸部分的疏水性產(chǎn)生本文描述的一個(gè)度量——有效SAA：

有效SAA的另外實(shí)施方式進(jìn)一步包括合計(jì)在一級(jí)蛋白質(zhì)序列中相鄰的至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)或至少六個(gè)(例如，二個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)等)氨基酸殘基的有效SAA。盡管有效SAA代表超過(guò)基本SAA的提高，但是它還是缺乏完全地說(shuō)明折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和說(shuō)明在蛋白質(zhì)序列中不相鄰的氨基酸可以是在蛋白質(zhì)折疊的二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)中互相靠近的事實(shí)的能力。這樣的蛋白質(zhì)折疊可形成易聚集區(qū)域，其不僅僅出現(xiàn)在一級(jí)結(jié)構(gòu)中，或只可通過(guò)更強(qiáng)大地分析折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)而被檢測(cè)。

本發(fā)明提供新的、更先進(jìn)的稱作空間聚集傾向的度量，其將突出蛋白質(zhì)表面上的某一碎片或區(qū)域的有效疏水性。針對(duì)在蛋白結(jié)構(gòu)模型的原子上或附近的限定的空間區(qū)域計(jì)算空間聚集傾向。

在該語(yǔ)境中，“限定的空間區(qū)域”是選擇的用以在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上或附近捕獲局部物理結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)環(huán)境的三維空間或體積。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，針對(duì)具有以蛋白質(zhì)中的原子(例如蛋白結(jié)構(gòu)模型中的原子)為中心的半徑R的球形區(qū)域計(jì)算空間聚集傾向。還可針對(duì)具有以化學(xué)鍵為中心或定位在接近結(jié)構(gòu)模型的空間中的半徑R的球形區(qū)域計(jì)算空間聚集傾向。相應(yīng)地，在另一實(shí)施方式中，可針對(duì)集中在原子附近，例如集中在空間上距特定原子或化學(xué)鍵的中心之間，更優(yōu)選地之間，更優(yōu)選地之間的點(diǎn)上的限定的空間區(qū)域計(jì)算SAP。

在某些實(shí)施方式中，選擇的半徑R在至之間。在特定的實(shí)施方式中，選擇的半徑是至少至少至少至少至少至少至少至少至少至少至少至少至少至少或至少在某些實(shí)施方式中，選擇的半徑在至之間，在至之間，或在至之間。在特定的實(shí)施方式中，選擇的半徑是或

在其他的實(shí)施方式中，計(jì)算空間聚集傾向的區(qū)域不是球形的。該區(qū)域的可能的形狀可進(jìn)一步包括立方體、圓柱體、圓錐體、橢圓的球狀體、錐體、半球或可用于封閉空間部分的任何其它形狀。在這樣的實(shí)施方式中，可使用除了半徑外的量度，例如從形狀的中心到面或頂點(diǎn)的距離選擇區(qū)域的大小。

在某個(gè)實(shí)施方式中，可使用SAP選擇蛋白質(zhì)尤其抗體或免疫球蛋白中的殘基，其可被半胱氨酸置換，而不增加蛋白質(zhì)交聯(lián)的傾向。本發(fā)明期望使識(shí)別可被半胱氨酸置換的殘基而不增加蛋白質(zhì)交聯(lián)傾向的過(guò)程流線化。

因此，一般地說(shuō)，針對(duì)蛋白質(zhì)中的特定原子計(jì)算空間聚集傾向的方法包括(a)識(shí)別代表該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型中的一個(gè)或多個(gè)原子，其中一個(gè)或多個(gè)原子位于以特定原子為中心或其附近的限定空間區(qū)域內(nèi)；(b)針對(duì)限定空間區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)原子中的每一個(gè)，計(jì)算原子的溶劑可及面積(SAA)與完全暴露的同一殘基中原子的SAA的比；(c)用一個(gè)或多個(gè)原子的原子疏水性乘以每個(gè)比；和(d)合計(jì)步驟(c)的乘積；借此該和是針對(duì)特定原子的SAP。

在相關(guān)的實(shí)施方式中，可根據(jù)不同的方法計(jì)算SAP，所述方法包括(a)識(shí)別代表蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基具有以特定原子為中心或其附近的限定空間區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)原子；(b)針對(duì)識(shí)別的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中的每一個(gè)，計(jì)算氨基酸中原子的溶劑可及面積(SAA)與完全暴露的同一殘基中原子的SAA的比；(c)用如通過(guò)氨基酸疏水性標(biāo)度(scale)所測(cè)定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的疏水性乘以每個(gè)比；和(d)對(duì)步驟(c)的乘積求和；借此該和是特定原子的SAP。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟(a)之前通過(guò)允許結(jié)構(gòu)模型與分子動(dòng)力學(xué)模擬中的溶劑相互作用來(lái)處理結(jié)構(gòu)模型。當(dāng)氨基酸被識(shí)別為具有限定的空間區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)原子時(shí)，可能需要至少一個(gè)原子專有地是氨基酸側(cè)鏈中的原子?？蛇x地，它可以是需要成為主鏈原子的原子。

在其它實(shí)施方式中，該方法可進(jìn)一步包括任選地在步驟(a)之前進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬和重復(fù)步驟(a)‐(d)，每次在許多時(shí)間步驟進(jìn)行進(jìn)一步的分子動(dòng)力學(xué)模擬，由此產(chǎn)生多個(gè)如步驟(d)中的和，和計(jì)算這些和的平均數(shù)；借此該計(jì)算的平均數(shù)是針對(duì)特定原子的SAP。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，使用經(jīng)分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算的值的平均數(shù)的本發(fā)明實(shí)施方式將是計(jì)算上更強(qiáng)化的。這樣的實(shí)施方式在某些情況下也將提供空間聚集傾向的更精確或高度分辨的圖。然而，本文討論的實(shí)驗(yàn)已顯示，當(dāng)不使用分子動(dòng)力學(xué)平均技術(shù)時(shí)，該方法仍然是高度準(zhǔn)確的。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，可針對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)例如蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)中的所有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)計(jì)算空間聚集傾向值，由此很快識(shí)別所有已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的疏水殘基和碎片。該方法允許大批蛋白質(zhì)的快速篩選以識(shí)別潛在的易聚集區(qū)域和/或蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)。

在優(yōu)選的應(yīng)用中，空間聚集傾向被描述

通過(guò)下面的公式：

SAP_原子＝Σ_{模擬平均值}(Σ_{原子的R內(nèi)的原子}((SAA‐R/SAA‐fe)*原子‐hb)

其中：

1)SAA‐R是在每個(gè)模擬快照(snapshot)上計(jì)算的半徑R內(nèi)側(cè)鏈原子的SAA。優(yōu)選地通過(guò)計(jì)算當(dāng)在蛋白質(zhì)表面上翻滾時(shí)探針球體中心的軌跡而在模擬模型中計(jì)算SAA。探針球體具有與水分子相同的半徑，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，計(jì)算SAA的其它方法將與這里描述的計(jì)算SAP的方法相一致。例如，可只在氨基酸側(cè)鏈原子上計(jì)算SAA。也可只在氨基酸主鏈原子(即肽主鏈的那些原子和結(jié)合的氫)上計(jì)算SAA?？蛇x地，可只在氨基酸主鏈原子上計(jì)算SAA，排除結(jié)合的氫；

2)SAA‐fe是在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)計(jì)算完全伸展的三肽‘Ala‐X‐Ala’構(gòu)象中中間殘基的側(cè)鏈SAA，獲得的完全暴露的殘基(說(shuō)的是氨基酸‘X’)的側(cè)鏈SAA；和

3)原子‐hb是如上所述使用Black和Mould(Black and Mould,Anal.Biochem.1991,193,72‐82)的疏水性標(biāo)度獲得的原子疏水性。該標(biāo)度被標(biāo)準(zhǔn)化以使甘氨酸疏水性為零。因此，在疏水性標(biāo)度上，疏水性比甘氨酸大的氨基酸為正并且疏水性比甘氨酸小的氨基酸為負(fù)。

“完全暴露的”殘基是三肽Ala‐X‐Ala完全伸展構(gòu)象中的殘基X。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，該排列被設(shè)計(jì)以至于在這樣的殘基X上的SAA的計(jì)算將產(chǎn)生可利用的最大溶劑可及面積。相應(yīng)地，考慮可在計(jì)算中使用除丙氨酸外的其它殘基而不完全破壞或改變結(jié)果。

如上所述，可將本發(fā)明的方法應(yīng)用于任何蛋白結(jié)構(gòu)模型，其包括利用上述相同公式的X射線結(jié)構(gòu)。

相似地，如果得不到X射線結(jié)構(gòu)，可將相同的空間聚集傾向參數(shù)應(yīng)用到通過(guò)同源建模產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)，并且SAP參數(shù)可利用上述相同公式計(jì)算。

在某些實(shí)施方式中，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)模型中的所有原子計(jì)算空間聚集傾向。在一些實(shí)施方式中，可對(duì)每個(gè)單個(gè)蛋白質(zhì)殘基或一小組殘基進(jìn)行原子空間聚集傾向值平均化。

SAP方法的用途

一方面，本發(fā)明可如上面所描述的用于識(shí)別蛋白質(zhì)中疏水的氨基酸殘基、區(qū)域或碎片。不想要保持于特定的閾值，認(rèn)為具有空間聚集傾向>0的原子或氨基酸殘基是疏水的或位于易聚集區(qū)域中。根據(jù)蛋白質(zhì)的類型、特定的結(jié)構(gòu)和其存在的溶劑，可期望使用稍微低于零的截止值，例如通過(guò)選擇具有大于‐0.1、‐0.15、‐0.2等的空間聚集傾向的原子或殘基，識(shí)別原子或殘基?？蛇x地，為了選擇最強(qiáng)的疏水性原子、殘基或碎片，可期望使用更嚴(yán)格的截止值，例如0、0.05、0.1、0.15、0.2等。此外，因?yàn)樗惴▽⒏叩臄?shù)給予碎片中心處的殘基，因此滿足截止值的殘基的3A、4A、5A、7.5A或10A內(nèi)的殘基也可被選擇用于突變成更小疏水性的殘基以降低聚集。在另一個(gè)實(shí)施方式中，僅僅選擇具有大于連續(xù)地(即沿著蛋白質(zhì)序列)或在優(yōu)選實(shí)施方式中，空間上(即在三維結(jié)構(gòu)中)在附近的原子或殘基的空間聚集傾向的原子或殘基可能是有利的。選擇疏水碎片中的原子或殘基的一個(gè)優(yōu)選的方法是將計(jì)算的空間聚集傾向值，例如使用彩色編碼或數(shù)字編碼，繪制到它們所衍生的蛋白結(jié)構(gòu)模型上，因此使在蛋白質(zhì)表面的空間聚集傾向中的差別可視化，并因此允許疏水碎片或殘基容易選擇。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用選擇用于半徑的兩個(gè)值分開(kāi)進(jìn)行空間聚集傾向的計(jì)算，這兩個(gè)值一個(gè)具有較高的分辨率，例如5A，一個(gè)具有較低的分辨率，例如10A。在這樣的實(shí)施方式中，可在具有較低分辨率圖的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上看到較大或較寬的疏水碎片。一旦在低分辨率圖上選擇感興趣的疏水碎片，可在較高分辨率的圖中更詳細(xì)地觀察那些碎片，這可在一些實(shí)施方式中允許本領(lǐng)域的技術(shù)人員更容易地或更準(zhǔn)確地選擇殘基以突變或修飾。例如，當(dāng)在較高分辨率的圖中觀察疏水碎片時(shí)，可期望為突變選擇具有最高SAP得分的殘基或是最疏水的殘基(例如根據(jù)Black和Mould,Anal.Biochem.1991,193,72‐82的標(biāo)度，碎片中最疏水的殘基)。

在具體的實(shí)施方式中，識(shí)別蛋白上的易聚集區(qū)域的方法包括：(a)將如根據(jù)本文描述的方法中的任何一個(gè)所計(jì)算的針對(duì)蛋白質(zhì)中原子的SAP繪制到結(jié)構(gòu)模型上；和(b)識(shí)別具有SAP>0的許多原子的蛋白質(zhì)內(nèi)的區(qū)域；其中易聚集區(qū)域包括：包含所述許多原子的氨基酸。在這樣的實(shí)施方式中，可針對(duì)蛋白質(zhì)中的所有原子或部分原子計(jì)算SAP。考慮一個(gè)人可只針對(duì)感興趣的特定殘基或許多組殘基計(jì)算SAP。

在相似的實(shí)施方式中，繪制原子的SAP得分(或者在氨基酸殘基上進(jìn)行平均的SAP得分)可能是有教益的。這種顯示沿著蛋白質(zhì)的原子或殘基的SAP得分的繪圖允許峰容易識(shí)別，這可表明用于代替的候選物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，將沿著蛋白質(zhì)中的原子或殘基的SAP得分繪制在曲線圖中，針對(duì)圖中的峰計(jì)算曲線下面積(AUC)。在這樣的實(shí)施方式中，具有較大AUC的峰代表較大或較疏水的易聚集區(qū)域。在特定的實(shí)施方式中，將期望選擇用于替代的一個(gè)或多個(gè)殘基，該殘基被識(shí)別為存在于峰中，或更優(yōu)選地在具有大AUC的峰中。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明可用于選擇用于突變?yōu)榘腚装彼岬拿庖咔虻鞍椎臍埢Ｈ绫疚乃?，?jì)算免疫球蛋白表面上第一氨基酸殘基的SAP值。如果SAP值是等于0和‐0.11的值或位于0和‐0.11的值之間，那么選擇第一氨基酸殘基用于突變?yōu)榘腚装彼帷Ｔ诹硗獾膶?shí)施方式中，計(jì)算第一殘基的臨近區(qū)域內(nèi)免疫球蛋白的多個(gè)殘基的SAP值。如果多個(gè)殘基具有小于0的SAP值，那么選擇第一殘基用于突變?yōu)榘腚装彼帷?/p>

免疫球蛋白變體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法制備，包括位點(diǎn)定向誘變和其它的重組DNA技術(shù)，例如參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5284760；5556747；5789166；6878531；5932419和6391548。

在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明可用于制備可結(jié)合到原子或分子的免疫球蛋白變體，這是通過(guò)用可用于將免疫球蛋白結(jié)合到原子或分子的天然氨基酸殘基、修飾的氨基酸殘基、稀有的氨基酸殘基、非天然氨基酸殘基或氨基酸類似物或衍生物替代通過(guò)本文描述的方法中的任何一個(gè)識(shí)別的免疫球蛋白表面上暴露的至少一個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，用半胱氨酸替代免疫球蛋白表面上暴露的氨基酸殘基。在其它實(shí)施方式中，用賴氨酸、天冬氨酸或吡咯賴氨酸(pyrorlysine)替代氨基酸殘基。

非天然氨基酸的合成是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并進(jìn)一步在，例如美國(guó)專利公布號(hào)2003‐0082575中被描述。一般而言，可使用將非天然的、修飾的或稀有的氨基酸合成或摻入進(jìn)蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的任何方法，包括但并不限于出版物L(fēng)iao J.Biotechnol Prog.2007 Jan‐Feb；23(1):28‐31；Rajesh,and Iqbal.Curr Pharm Biotechnol.2006 Aug；7(4):247‐59；Cardillo et al.Mini Rev Med Chem.2006Mar；6(3):293‐304；Wang et al.Annu Rev Biophys Biomol Struct.2006；35:225‐49；Chakraborty et al.,and Glycoconj J.2005 Mar；22(3):83‐93中描述或引用的那些方法。作為進(jìn)一步的例子，可使用Ambrx ReCODE^TM技術(shù)如本文描述的方法所示將非天然氨基酸或稀有氨基酸形成和摻入到蛋白質(zhì)中。

根據(jù)本發(fā)明的免疫球蛋白變體和免疫球蛋白結(jié)合物能顯示，例如，如通過(guò)非還原SDS‐PAGE所測(cè)定的提高的或改進(jìn)的穩(wěn)定性。

因此本發(fā)明的目的是提供分離的或重組的多核苷酸，其編碼如在段落[0008]和[0009]以及他們的實(shí)施方式的任意和所有組合中所討論的修飾免疫球蛋白。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸在載體中。在某些實(shí)施方式中，載體是表達(dá)載體。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操作地連接到多核苷酸上。另一方面包括具有前述實(shí)施方式中任何一種的載體的宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞能表達(dá)通過(guò)多核苷酸編碼的免疫球蛋白。

因此本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)生具有降低的交聯(lián)傾向的免疫球蛋白的方法，所述方法包括提供包含前述段落的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和將該培養(yǎng)基置于免疫球蛋白被表達(dá)的條件下。在某些實(shí)施方式中，方法包括分離表達(dá)的免疫球蛋白的另外步驟。

因此本發(fā)明的目的是提供選擇用于突變?yōu)榘腚装彼岬拿庖咔虻鞍椎臍埢姆椒?，包括?jì)算免疫球蛋白表面上的第一氨基酸殘基的空間聚集傾向，計(jì)算第一殘基緊鄰區(qū)域內(nèi)免疫球蛋白的多個(gè)殘基的空間聚集傾向，和如果第一氨基酸殘基的空間聚集傾向等于0和‐0.11的值或位于0和‐0.11的值之間，和如果多個(gè)殘基具有小于0的空間聚集傾向，選擇第一氨基酸殘基以突變?yōu)榘腚装彼?。在某些?shí)施方式中，多個(gè)殘基在第一殘基的內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，多個(gè)殘基在第一殘基的內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，多個(gè)殘基在第一殘基的內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，多個(gè)殘基在第一殘基的內(nèi)。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，計(jì)算殘基的空間聚集傾向包括針對(duì)具有以殘基中的原子為中心的半徑的球形區(qū)域計(jì)算空間聚集傾向。在某些實(shí)施方式中，球形區(qū)域的半徑為至少

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于根據(jù)本發(fā)明方法測(cè)定SAP的計(jì)算機(jī)編碼。在其它的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及致力于執(zhí)行本發(fā)明的方法的計(jì)算機(jī)、超級(jí)計(jì)算機(jī)或計(jì)算機(jī)集群。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于選擇突變?yōu)榘腚装彼岬牡鞍踪|(zhì)殘基的基于網(wǎng)絡(luò)的、基于服務(wù)器的或基于互聯(lián)網(wǎng)的服務(wù)，該服務(wù)包括接收來(lái)自用戶(例如通過(guò)互聯(lián)網(wǎng))的關(guān)于蛋白質(zhì)(例如蛋白結(jié)構(gòu)模型)的數(shù)據(jù)或從數(shù)據(jù)庫(kù)檢索這樣的數(shù)據(jù)，這樣服務(wù)提供者能產(chǎn)生、檢索或存取蛋白質(zhì)的靜態(tài)結(jié)構(gòu)，任選地包括蛋白質(zhì)的分子動(dòng)力學(xué)建模以提供蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，基于這樣產(chǎn)生的靜態(tài)或動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)測(cè)定針對(duì)蛋白質(zhì)的原子或殘基的SAP，和將SAP數(shù)據(jù)，例如，作為服務(wù)供給者用所述SAP數(shù)據(jù)繪制的結(jié)構(gòu)模型，返回給用戶。在一些實(shí)施方式中，用戶是人。在其它的實(shí)施方式中，用戶是計(jì)算機(jī)系統(tǒng)或自動(dòng)化的計(jì)算機(jī)算法。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供SAP計(jì)算系統(tǒng)，包括：用于將用于計(jì)算SAP的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)提供給用戶終端的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器；用于貯存關(guān)于計(jì)算方法、氨基酸疏水性等一般信息的數(shù)據(jù)庫(kù)和用于基于數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息和用戶通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)提供或傳輸?shù)男畔?zhí)行SAP計(jì)算的計(jì)算服務(wù)器。

在一些實(shí)施方式中，網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器和計(jì)算服務(wù)器是相同的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。在一些實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)是超級(jí)計(jì)算機(jī)、集群計(jì)算機(jī)或單個(gè)的工作站或服務(wù)器。在相關(guān)的實(shí)施方式中，SAP計(jì)算系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器進(jìn)一步包括用于控制全部操作的控制器、用于連接互聯(lián)網(wǎng)的網(wǎng)絡(luò)連接單元和用于將用于計(jì)算SAP的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)提供給通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)連接的用戶終端的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器單元。

此外，本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)一步涉及具有計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)的計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)產(chǎn)品，該產(chǎn)品含有用于執(zhí)行各種計(jì)算機(jī)執(zhí)行的操作的程序編碼，所述計(jì)算機(jī)執(zhí)行的操作例如計(jì)算針對(duì)結(jié)構(gòu)模型的SAP、計(jì)算SAA、計(jì)算有效SAA、操縱結(jié)構(gòu)模型、實(shí)施分子動(dòng)力學(xué)模擬、組織和儲(chǔ)存相關(guān)數(shù)據(jù)、或執(zhí)行本文描述的其它操作。計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)是能儲(chǔ)存數(shù)據(jù)的任何數(shù)據(jù)存儲(chǔ)設(shè)備，該數(shù)據(jù)此后能被計(jì)算機(jī)系統(tǒng)讀取。計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)的例子包括但并不限于硬盤、軟盤、閃存驅(qū)動(dòng)器、光盤(例如CD、DVD、HD‐DVD、藍(lán)光光盤等)和專門配置的硬件裝置諸如特定用途集成電路(ASICs)或可編程邏輯器件(PLDs)。還能將計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)作為包括在遍及偶聯(lián)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的載波中的數(shù)據(jù)信號(hào)而分布，以便使計(jì)算機(jī)可讀代碼以分布的形式儲(chǔ)存和執(zhí)行。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，上面描述的硬件和軟件組件是具有標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)和構(gòu)造的。上面描述的計(jì)算機(jī)、互聯(lián)網(wǎng)、服務(wù)器和服務(wù)相關(guān)的實(shí)施方式可進(jìn)一步應(yīng)用到SAA和有效SAA以及SAP。

包含免疫球蛋白和免疫球蛋白結(jié)合物的藥物組合物

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供組合物，例如藥物組合物，其含有與藥學(xué)上可接受的載體一起配制的、通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的一種或多種免疫球蛋白結(jié)合物。本發(fā)明的藥物組合物還能在聯(lián)合治療中施用，也即能與其它藥劑組合。例如，聯(lián)合治療能包括與至少一種其它抗癌藥劑組合的本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)合物。

如本文所用，“藥學(xué)上可接受的載體”包括生理學(xué)上相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲的和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，載體適于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腸胃外、脊椎或表皮施用(例如，通過(guò)注射或輸注)。根據(jù)給藥途徑，可將活性化合物，即本發(fā)明的免疫球蛋白或其變體，包在材料中以保護(hù)化合物免受酸的作用和可使化合物失活的其它天然條件。

本發(fā)明的藥物組合物可包括一種或多種藥學(xué)上可接受的鹽?！八帉W(xué)上可接受的鹽”指保留母體化合物的期望生物學(xué)活性和不賦予任何不期望的毒理學(xué)作用的鹽(參見(jiàn)，例如Berge,S.M.,et al.(1977)J.Pharm.Sci.66:1‐19)。這樣的鹽的例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括來(lái)自無(wú)毒的無(wú)機(jī)酸，諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等，以及來(lái)自無(wú)毒的有機(jī)酸諸如脂肪族一羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等的那些鹽。堿加成鹽包括來(lái)自堿土金屬，諸如鈉、鉀、鎂、鈣等，以及來(lái)自無(wú)毒的有機(jī)胺，諸如N,N'‐二芐乙烯二胺、N‐甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等的那些鹽。

本發(fā)明的藥物組合物還可包括藥學(xué)上可接受的抗氧化劑。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的實(shí)例包括：(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶的抗氧化劑，諸如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、棓酸丙酯、α‐生育酚等；和(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

可在本發(fā)明的藥物組合物中使用的合適的水性和非水性載體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物、植物油，諸如橄欖油，和可注射的有機(jī)酯，諸如油酸乙酯。例如，通過(guò)包衣材料，諸如卵磷脂的使用，通過(guò)分散的情況下需要的粒度的維持和通過(guò)表面活性劑的使用能維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。

這些組合物還可含有佐劑諸如防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑和分散劑?？赏ㄟ^(guò)滅菌操作和通過(guò)包含各種抗菌劑和抗真菌劑，例如對(duì)羥苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等確保阻止微生物的存在。還可期望將等滲劑，諸如糖、氯化鈉等包括進(jìn)組合物。此外，通過(guò)包含延遲吸收的藥劑諸如單硬脂酸鋁和明膠可帶來(lái)可注射的藥物形式的延長(zhǎng)的吸收。

藥學(xué)上可接受的載體包括無(wú)菌水溶液或分散液和用于無(wú)菌注射溶液或分散液的即時(shí)制備的無(wú)菌粉末。這些用于藥學(xué)活性物質(zhì)的介質(zhì)和劑的使用是本領(lǐng)域已知的。除了在任何常規(guī)的介質(zhì)或劑與活性化合物不相容的情況下，考慮其在本發(fā)明的藥物組合物中的使用。也能將補(bǔ)充的活性化合物摻入進(jìn)組合物。

示例性的制劑包括至少一種本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)合物和能包括較低濃度的穩(wěn)定劑，除了本文公開(kāi)的方法，其能用于阻止或減少免疫球蛋白的交聯(lián)。相應(yīng)地，在含有通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的免疫球蛋白結(jié)合物的藥物組合物的開(kāi)發(fā)中可使用用于阻止交聯(lián)的常規(guī)方法。例如，許多種穩(wěn)定或解聚化合物可根據(jù)它們的預(yù)期的用途和它們的生物學(xué)毒性包括在本發(fā)明的藥物組合物中。這樣的穩(wěn)定化合物可包括，例如環(huán)糊精及其衍生物(美國(guó)專利號(hào)5730969)、烷基葡糖苷組合物(美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/474,049)、蛋白伴侶分子的使用(例如LEA(Goyal et al.,Biochem J.2005,388(Pt 1):151‐7；美國(guó)專利號(hào)5688651的方法)、甜菜堿化合物(Xiao,Burn,Tolbert,Bioconjug Chem.2008 May 23)、表面活性劑(例如Pluronic F127、Pluronic F68、Tween 20(Wei et al.International Journal of Pharmaceutics.2007,338(1‐2):125‐132))和美國(guó)專利號(hào)5696090、5688651和6420122中描述的方法。

此外，使用不同種類的賦形劑的組合在制劑中穩(wěn)定蛋白質(zhì)，特別是抗體，例如(1)二糖(例如蔗糖、海藻糖)或多元醇(例如山梨醇、甘露醇)通過(guò)優(yōu)先的排除充當(dāng)穩(wěn)定劑并且還能在凍干期間充當(dāng)冷凍保護(hù)劑，(2)表面活性劑(例如Polysorbat 80、Polysorbat 20)通過(guò)最小化界面象液體/冰、液體/材料表面和/或液體/氣體界面上蛋白質(zhì)的相互作用起作用，和(3)緩沖液(例如磷酸鹽‐、檸檬酸鹽‐、組氨酸)有助于控制和維持制劑pH。因此，除了本發(fā)明的方法外可以使用這樣的二糖多元醇、表面活性劑和緩沖液以進(jìn)一步穩(wěn)定免疫球蛋白和防止它們的聚集。

治療組合物典型地在制造和貯存條件下必須是無(wú)菌的和穩(wěn)定的。能將組合物配制為溶液、微乳液、脂質(zhì)體或適于高藥物濃度的其它規(guī)則結(jié)構(gòu)。載體可以是含有，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散介質(zhì)。例如，通過(guò)包衣諸如卵磷脂的使用、通過(guò)分散的情況下需要的粒度的維持和通過(guò)表面活性劑的使用能維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況下，在組合物中包括等滲劑，例如糖，多元醇諸如甘露醇、山梨醇，或氯化鈉將是優(yōu)選的。通過(guò)將延遲吸收的劑，例如單硬脂酸鹽和明膠包括在組合物中能帶來(lái)可注射組合物的延長(zhǎng)的吸收。

能通過(guò)將活性化合物以需要的量摻入到具有如所需要的、上面列舉的一種成分或成分組合的適當(dāng)溶劑中，接下來(lái)通過(guò)滅菌微濾來(lái)制備無(wú)菌注射溶液。一般地，通過(guò)將活性化合物摻入進(jìn)含有基本的分散介質(zhì)和需要的來(lái)自上面列舉的那些其它成分的無(wú)菌載體中制備分散體。在用于無(wú)菌注射溶液制備的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，其產(chǎn)生活性成分加上任何另外期望的來(lái)自其先前無(wú)菌過(guò)濾的溶液的成分的粉末。

能與載體材料結(jié)合以產(chǎn)生單劑型的活性成分的量將根據(jù)被治療的受試者和特定的施用方式而變化。能與載體材料結(jié)合以產(chǎn)生單劑型的活性成分的量將通常是產(chǎn)生療效的組合物的量。一般地，100％中，這個(gè)量的范圍將是約0.01％至約99％的活性成分，優(yōu)選地約0.1％至約70％，最優(yōu)選地約1％至約30％的與藥學(xué)上可接受的載體組合的活性成分。

因此本發(fā)明的目的是提供降低免疫球蛋白結(jié)合物的高濃藥物制劑中免疫球蛋白表面暴露的半胱氨酸之間交聯(lián)的方法，所述方法包括提供免疫球蛋白，用半胱氨酸殘基置換選自7(VH)、20(VL)、22(VL)和125(CH1)的殘基，用還原劑還原一個(gè)或多個(gè)置換的半胱氨酸殘基以形成還原的半胱氨酸殘基，用原子或分子溫育免疫球蛋白，其中所述分子與還原的半胱氨酸殘基反應(yīng)，以形成免疫球蛋白結(jié)合物，和產(chǎn)生免疫球蛋白結(jié)合物的高濃液體制劑，其中所述免疫球蛋白結(jié)合物濃度為至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括人C_H1結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括人C_H2結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括人C_H3結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括人C_L結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括人V_H結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括人V_L結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物包括抗原結(jié)合活性并且該活性是未突變免疫球蛋白抗原結(jié)合活性的至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％或至少130％。

因此本發(fā)明的目的是提供修飾的免疫球蛋白制劑，其可由段落[0007]中討論的免疫球蛋白結(jié)合物和它們的實(shí)施方式中任意和所有組合構(gòu)成，其中所述免疫球蛋白結(jié)合物濃度為至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml或至少150mg/ml。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物濃度大于在相同條件下在濃縮的液體溶液中已知具有高寡聚化形式寡聚體傾向的免疫球蛋白結(jié)合物的濃度。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的免疫球蛋白結(jié)合物是非寡聚化單體。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該制劑包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該免疫球蛋白制劑包括至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的免疫球蛋白結(jié)合物，該免疫球蛋白結(jié)合物是非寡聚化單體。

因此本發(fā)明的目的是提供段落[0007]中討論的免疫球蛋白結(jié)合物和它們的實(shí)施方式中任意和所有組合作為非寡聚化藥物活性成分的用途。

因此本發(fā)明的目的是提供藥物組合物，其包括段落[0007]中討論的免疫球蛋白結(jié)合物和它們的實(shí)施方式中任意和所有組合和藥學(xué)上可接受的賦形劑。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物濃度為至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白結(jié)合物濃度大于在相同條件下在濃縮的液體溶液中已知具有高寡聚化形式寡聚體傾向的免疫球蛋白結(jié)合物的濃度。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的免疫球蛋白結(jié)合物是非寡聚化單體。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該免疫球蛋白制劑包括至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的免疫球蛋白結(jié)合物，該免疫球蛋白結(jié)合物是非寡聚化單體。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，寡聚化通過(guò)非還原SDS‐PAGE進(jìn)行測(cè)量。

調(diào)整劑量方案以提供最佳期望的反應(yīng)(例如治療反應(yīng))。例如，可施用單個(gè)大丸劑(bolus)，可隨著時(shí)間施用幾個(gè)分次劑量或可如治療情形的緊急度所指示的按比例地減少或增加劑量。配制以劑量單位形式的胃腸外組合物以使施用容易和劑量均勻是尤其有利的。如本文所用的劑量單位形式指適合用作用于將被治療的受試者的單一劑量的物理離散單位；每個(gè)單位含有計(jì)算的預(yù)定數(shù)量的活性化合物以與需要的藥物載體聯(lián)合地產(chǎn)生期望的療效。針對(duì)本發(fā)明的劑量單位形式的說(shuō)明受指示于并直接依賴于：(a)活性化合物的獨(dú)特特性和將要達(dá)到的特定療效，和(b)在復(fù)合這樣的活性化合物以在個(gè)體中獲得靈敏治療的領(lǐng)域中固有的限制。

對(duì)于免疫球蛋白結(jié)合物的施用，劑量范圍是每kg宿主體重約0.0001至100mg，更通常地0.01至5mg。例如劑量可以是0.3mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重或1‐10mg/kg范圍內(nèi)。示例性的治療方案需要每周一次、每?jī)芍芤淮巍⒚咳芤淮?、每四周一次、一個(gè)月一次、每3個(gè)月一次或每3至6個(gè)月一次施用。用于本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)合物的優(yōu)選劑量方案包括通過(guò)靜脈內(nèi)施用1mg/kg體重或3mg/kg體重，其中采用以下的給藥方案之一給予抗體：(i)每四周，進(jìn)行六個(gè)劑量，然后每三個(gè)月；(ii)每三周；(iii)3mg/kg體重一次，接下來(lái)每三周1mg/kg體重。

可選地，本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)合物作為持續(xù)釋放制劑施用，在這種情況下需要較少頻率的施用。劑量和頻率可根據(jù)患者施用的物質(zhì)的半衰期而變化。一般而言，人類抗體顯示最長(zhǎng)的半衰期，接下來(lái)是人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。劑量和頻率可根據(jù)治療是否是預(yù)防性的或治療性的而變化。在預(yù)防性應(yīng)用中，在長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)以相對(duì)不頻繁的間隔施用相對(duì)低的劑量。一些患者連續(xù)接受治療持續(xù)他們生命的剩余部分。在治療性應(yīng)用中，有時(shí)需要在相對(duì)短的間隔以相對(duì)高的劑量直到疾病的進(jìn)展被降低或終止，優(yōu)選地直至患者顯示疾病癥狀的部分或完全改善。之后，可給患者施用預(yù)防性方案。

本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分的實(shí)際劑量水平可變化以獲得活性成分的量，該量對(duì)達(dá)到針對(duì)特定患者、組合物和施用方式的期望的治療反應(yīng)是有效的，而對(duì)患者沒(méi)有毒性。選擇的劑量水平將依賴許多種藥物代謝動(dòng)力學(xué)因素，包括使用的本發(fā)明的特定組合物、或其酯、鹽或酰胺的活性、施用途徑、施用時(shí)間、正在使用的特定化合物的排泄速度、治療的持續(xù)時(shí)間、與使用的特定組合物聯(lián)合使用的其它藥物、化合物和/或材料、正被治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康狀態(tài)和以前的病史和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的類似因素。

本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)合物的“治療上有效的劑量”優(yōu)選地導(dǎo)致疾病癥狀嚴(yán)重性降低、無(wú)疾病癥狀周期的頻率和持續(xù)時(shí)間增加、或由于疾病折磨所致的損害或殘疾停止。例如，對(duì)于腫瘤的治療，相對(duì)于未治療的受試者，“治療上有效的劑量”優(yōu)選地抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或腫瘤生長(zhǎng)至少約20％，更優(yōu)選地至少約40％，甚至更優(yōu)選地至少約60％，更優(yōu)選地至少約80％。能在預(yù)示人類腫瘤中效力的動(dòng)物模型系統(tǒng)中評(píng)價(jià)化合物抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力。可選地，能通過(guò)熟練的實(shí)施者所知的試驗(yàn)檢查化合物抑制例如體外抑制的能力來(lái)評(píng)價(jià)組合物的這種性質(zhì)。治療有效量的治療化合物能減小腫瘤大小或另外改善受試者中的癥狀。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將能基于諸如受試者的大小、受試者癥狀的嚴(yán)重性和特定的組合物或選擇的施用途徑這樣的因素確定這樣的量。

能使用本領(lǐng)域已知的許多種方法中的一個(gè)或多個(gè)通過(guò)一個(gè)或多個(gè)施用途徑施用本發(fā)明的組合物。如熟練的技術(shù)人員所將理解的，施用的途徑和/或方式將根據(jù)期望的結(jié)果而變化。用于本發(fā)明的結(jié)合部分的優(yōu)選的施用途徑包括靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、真皮內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、皮下的、脊椎的或其它腸胃外的施用途徑，例如通過(guò)注射或輸注。短語(yǔ)“胃腸外施用”如本文所用指除了腸的和局部施用外的施用方式，通常通過(guò)注射，并且包括但不限于靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、動(dòng)脈內(nèi)的、鞘內(nèi)的、囊內(nèi)的、眶內(nèi)的、心內(nèi)的、真皮內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、經(jīng)氣管的、皮下的、表皮下的、關(guān)節(jié)內(nèi)的、囊下的、蛛網(wǎng)膜下的、脊柱內(nèi)的、硬膜外的和胸骨內(nèi)的注射和輸注。

可選地，能通過(guò)非胃腸外途徑諸如局部的、表皮的或粘膜的施用途徑施用本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)合物，例如鼻內(nèi)地、經(jīng)口地、陰道地、直腸地、舌下地或局部地。

能將活性化合物與載體一起制備，該載體將保護(hù)該化合物抵抗快速釋放，諸如受控釋放制劑，包括植入物、透皮貼片和微囊化遞送系統(tǒng)。能使用可生物降解的、生物相容的聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這樣的制劑的制備的許多方法是取得專利權(quán)的或通常是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。參見(jiàn)，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。

治療組合物能與本領(lǐng)域已知的醫(yī)療器材一起施用。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的治療組合物能與無(wú)針皮下注射裝置，諸如美國(guó)專利號(hào)5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公開(kāi)的裝置一起施用。眾所周知的植入物和在本發(fā)明中有用的模塊的例子包括：美國(guó)專利號(hào)4,487,603，其公開(kāi)了用于以控制的速度分配藥物的可植入微量輸注泵；美國(guó)專利號(hào)4,486,194，其公開(kāi)了用于通過(guò)皮膚施用藥物的治療裝置；美國(guó)專利號(hào)4,447,233，其公開(kāi)了用于以精確的輸注速度遞送藥物的藥物輸注泵；美國(guó)專利號(hào)4,447,224，其公開(kāi)了用于連續(xù)的藥物遞送的變速流可植入的輸液器；美國(guó)專利號(hào)4,439,196，其公開(kāi)了具有多腔小室的滲透性藥物遞送系統(tǒng)；和美國(guó)專利號(hào)4,475,196，其公開(kāi)了滲透性藥物遞送系統(tǒng)。

因此本發(fā)明的目的是提供段落[0007]中討論的免疫球蛋白結(jié)合物和它們的實(shí)施方式中任意和所有組合在包含高濃液體制劑的藥物的制備中的用途，其中所述免疫球蛋白結(jié)合物濃度為至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml或至少150mg/ml。在某些實(shí)施方式中，該藥物的用途是用于治療自身免疫疾病、免疫學(xué)疾病、傳染病、炎性疾病、神經(jīng)學(xué)疾病以及包括癌癥在內(nèi)的腫瘤學(xué)和瘤性疾病。在某些實(shí)施方式中，該藥物的用途是用于治療充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、紅斑痤瘡、痤瘡、濕疹、心肌炎和心肌的其他病癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、脊椎病、滑液成纖維細(xì)胞和骨髓基質(zhì)；骨丟失；佩吉特病、破骨細(xì)胞瘤；乳腺癌；廢用性骨量減少、營(yíng)養(yǎng)不良、牙周病、高歇病、朗格罕細(xì)胞組織細(xì)胞增多癥、脊髓損傷、急性膿毒性關(guān)節(jié)炎、骨軟化癥、庫(kù)興綜合征、單骨纖維性骨發(fā)育不良、多骨纖維性骨發(fā)育不良、牙周重建和骨折；肉樣瘤??；溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、腎癌和直腸癌；骨轉(zhuǎn)移、骨痛處理和體液惡性高鈣血癥、強(qiáng)直性脊柱炎和其他脊椎關(guān)節(jié)病；移植排斥、病毒性感染、血液學(xué)瘤形成和瘤樣病癥，例如，何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤/慢性淋巴細(xì)胞白血病、蕈樣霉菌病、套細(xì)胞淋巴瘤、巨濾泡性淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤、毛細(xì)胞白血病和淋巴漿細(xì)胞性白血病)、淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞的腫瘤，其包括B細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤、和T細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK細(xì)胞的腫瘤，其包括外周T細(xì)胞白血病、成人T細(xì)胞白血病/T細(xì)胞淋巴瘤和大粒狀淋巴細(xì)胞白血病、朗格罕細(xì)胞組織細(xì)胞增多癥、骨髓瘤形成諸如急性骨髓性白血病，包括成熟的AML、沒(méi)有分化的AML、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性骨髓單核細(xì)胞性白血病和急性單核細(xì)胞性白血病、骨髓增生異常綜合征和慢性骨髓增生疾病，包括慢性骨髓性白血病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，例如，腦瘤(神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、室管膜瘤和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)、實(shí)體瘤(鼻咽癌、基底細(xì)胞癌、胰腺癌、膽管癌、卡波西肉瘤、睪丸癌、子宮癌、陰道癌或?qū)m頸癌、卵巢癌、原發(fā)性肝癌或子宮內(nèi)膜癌、和血管系統(tǒng)的腫瘤(血管肉瘤和血管外皮細(xì)胞瘤)、骨質(zhì)疏松癥、肝炎、HIV、AIDS、(脊)椎關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病(IBD)、膿毒病和敗血癥性休克、克羅恩病、牛皮癬、硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、異源胰島移植物排斥、血液學(xué)惡性腫瘤，諸如多發(fā)性骨髓瘤(MM)、骨髓增生異常綜合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、與腫瘤相關(guān)的炎癥、周圍神經(jīng)損傷或脫髓鞘病。在某些實(shí)施方式中，該藥物的用途是用于治療菌斑牛皮癬、潰瘍性大腸炎、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、黃斑變性、呼吸道合胞病毒、克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、骨質(zhì)疏松癥、治療誘導(dǎo)的骨丟失、骨轉(zhuǎn)移、多發(fā)性骨髓瘤、阿爾茨海默病、青光眼和多發(fā)性硬化癥。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該藥物的用途進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該藥物中的免疫球蛋白結(jié)合物顯示至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的非寡聚化單體。在某些實(shí)施方式中，寡聚化通過(guò)非還原SDS‐PAGE進(jìn)行測(cè)量。

實(shí)施例

本文描述的實(shí)施例指本發(fā)明的具體的、非限制的實(shí)施方式。

實(shí)施例1：抗體半胱氨酸變體的設(shè)計(jì)、表達(dá)和結(jié)合

設(shè)計(jì)一組IgG1半胱氨酸變體，以便表示每個(gè)免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)域(表1)。根據(jù)抗體‐1的X線結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)變體1‐13。變體14選自另一個(gè)IgG1，抗體‐2的結(jié)構(gòu)，其通過(guò)抗體‐1的同源建模而構(gòu)建。所有位點(diǎn)暴露于抗體表面。極性殘基，如絲氨酸和蘇氨酸和精氨酸，或帶電荷的殘基，如賴氨酸，用半胱氨酸置換。輕鏈和重鏈基因被亞克隆到載體gWIZ(Genlantis)并工程化，用于通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá)?？贵w變體被重新合成(GeneArt)或通過(guò)定點(diǎn)誘變PCR產(chǎn)生并通過(guò)測(cè)序而驗(yàn)證。通過(guò)用聚乙烯亞胺(Polysciences)作為轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Freestyle HEK 293細(xì)胞(Invitrogen)，抗體野生型和變體以10‐100mg水平表達(dá)。轉(zhuǎn)染后7‐10天收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。將抗體在蛋白A柱(GE Healthcare)上純化，用50mM檸檬酸鹽緩沖液，pH 3.5洗脫，并以100mM Tris pH 7.0緩沖液更換緩沖液，用于熒光標(biāo)記。

抗體變體的表達(dá)和純化之后，工程化的表面半胱氨酸大部分被氧化。例如變體4和6都具有小于每抗體分子0.3個(gè)自由巰基，與具有工程化表面半胱氨酸的抗體的預(yù)期的2.0相反。我們比較了溫和的還原劑——TCEP(Tris[2‐羧乙基]膦氫氯化物)和較強(qiáng)的還原劑——DTT(二硫蘇糖醇)對(duì)來(lái)自I類的變體和來(lái)自IV類的變體的效果。最初，非寡聚化變體4顯示每抗體0.13個(gè)自由巰基，而高度寡聚化變體6具有每抗體0.25個(gè)自由巰基。在以下五種不同的條件中處理野生型的等分試樣、變體4和變體6：1)沒(méi)有還原劑，2)TCEP，10×，1小時(shí)，3)TCEP，20×，1小時(shí)，4)DTT，5×，15分鐘，和5)DTT，10×，15分鐘。去除還原劑之后，將樣品在非還原PAGE上分解并對(duì)自由巰基定量。野生型和變體的結(jié)果比較顯示，TCEP處理足以還原非寡聚化形式(變體4)中的半胱氨酸，對(duì)WT(野生型)幾乎沒(méi)有影響。然而，來(lái)自寡聚體(變體6)的半胱氨酸只在較苛刻的處理之后才被還原。甚至低水平的DTT處理導(dǎo)致WT和兩個(gè)變體抗體的片段化。表面半胱氨酸被引入的位點(diǎn)對(duì)脫帽(decap)工程化半胱氨酸以結(jié)合的能力具有深的影響。

嘗試不同的方法用于標(biāo)記之前工程化表面巰基的特異性還原。TCEP和DTT是使用的兩種試劑，利用Ellman’s試劑(Invitrogen)定量自由巰基的水平。我們發(fā)現(xiàn)L‐半胱氨酸在我們的位點(diǎn)特異性標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中作用最好，所以利用以下的兩步法方案。首先，將變體用100‐200倍過(guò)量的L‐半胱氨酸在37℃溫育4小時(shí)，之后通過(guò)緩沖液更換到50 mM Tris/EDTA。其次，將樣品用5‐10倍過(guò)量的Alexa488馬來(lái)酰亞胺染料(Invitrogen)在室溫溫育1小時(shí)或用10倍過(guò)量的芘馬來(lái)酰亞胺染料(Invitrogen)在室溫溫育12小時(shí)。去除游離染料之后，緩沖液更換到50mM磷酸鹽緩沖液pH 7.0中，根據(jù)制造廠商的方案(Invitrogen)將蛋白標(biāo)記的效率計(jì)算為每摩爾蛋白染料的摩爾(mol染料/mol蛋白)。

實(shí)施例2：工程化抗體半胱氨酸變體的鑒定

通過(guò)SDS‐PAGE分析未標(biāo)記和標(biāo)記的抗體樣品。利用7.5％、10％和12％的凝膠進(jìn)行非還原分析。12％的凝膠用于具有DTT的加熱樣品的還原分析。通常，每泳道加樣5‐10μg樣品。用考馬斯藍(lán)染色之前在UV燈下觀察熒光圖像。抗體消化通過(guò)GluC(1:20的重量酶/重量抗體，于25℃持續(xù)12‐24小時(shí))和鏈霉蛋白酶(1:20的重量酶/重量抗體，于37℃持續(xù)1hr)進(jìn)行。

非還原性凝膠顯示單體以及二聚體、三聚體的存在，在一些情況下，甚至存在較高級(jí)的寡聚體。還原性凝膠顯示根據(jù)表面半胱氨酸被工程化的地方，輕鏈或重鏈專有的標(biāo)記。分析標(biāo)記和未標(biāo)記的變體1‐6的抗原結(jié)合特異性。變體保持野生型的80％和130％內(nèi)的活性，標(biāo)記之后一些活性喪失。未標(biāo)記的變體1保持野生型活性的大約110％，而標(biāo)記的變體1保持大約80％。未標(biāo)記的變體2保持野生型活性的大約105％，而標(biāo)記的變體2保持略小于100％的活性。未標(biāo)記和標(biāo)記的變體3均保持野生型活性的大約110％。未標(biāo)記的變體4保持野生型活性的大約125％，而標(biāo)記的變體4保持大約95％的活性。未標(biāo)記的變體5保持野生型活性的大約120％，而標(biāo)記的變體6保持大約100％的活性。最后，未標(biāo)記的變體6保持野生型活性的大約115％，而標(biāo)記的變體6保持大約90％的活性。類似于未標(biāo)記的負(fù)體，標(biāo)記的變體6顯示高的寡聚化傾向。

大多數(shù)變體在接近每摩爾抗體2.0摩爾染料(每抗體分子兩個(gè)相同的半胱氨酸)的最佳效率被標(biāo)記。高于2.0的標(biāo)記效率是不期望的，因?yàn)檫@將提示鏈內(nèi)二硫化物的部分分裂和標(biāo)記。具有高寡聚化傾向的變體如變體6、變體11和變體5沒(méi)有有效地標(biāo)記。甚至在其它變體中，標(biāo)記條件如反應(yīng)時(shí)間和染料與蛋白的比例在個(gè)體基礎(chǔ)上必須被優(yōu)化，這是因?yàn)椴皇撬械墓こ袒腚装彼岫纪瑯拥匾子诮Y(jié)合。在攜帶工程化半胱氨酸的鏈上特異地標(biāo)記變體1‐14。利用鏈霉蛋白酶對(duì)變體的蛋白水解處理對(duì)大多數(shù)變體產(chǎn)生不同的熒光模式，但是對(duì)具有鄰近置換的變體，如變體3和12，產(chǎn)生相似的模式。因此，大多數(shù)變體被有效地和特異地標(biāo)記。

將該組半胱氨酸變體區(qū)分為五類交聯(lián)傾向(表1)。I類包括是單體并在標(biāo)記之后保持穩(wěn)定的變體。II類變體在標(biāo)記之前和之后含有小百分比的二聚體。III類變體具有更顯著的寡聚體化傾向，包括形成一些三聚體。如比三聚體大的聚集物的存在所證明的，IV類變體具有更高的寡聚體化傾向，尤其是標(biāo)記之后。V類包括與IV類變體相似的高寡聚化傾向的變體，具有另外的結(jié)構(gòu)異常如純化的濃縮樣品的片段化或著色。

實(shí)施例3：工程化抗體半胱氨酸變體的應(yīng)用

將具有低交聯(lián)傾向的半胱氨酸變體(變體1‐4、7、10、12‐14)以高特異性和有效性和很少的寡聚化進(jìn)行標(biāo)記。用馬來(lái)酰亞胺染料的標(biāo)記只是這些抗體變體上位點(diǎn)特異性結(jié)合的一個(gè)實(shí)例。具有其它功能性如結(jié)合特異性或毒性的分子可被同樣的連接。因此，該組變體在抗體變體的儲(chǔ)庫(kù)上擴(kuò)展以用作靶向治療中的有效負(fù)載載體或用作體外和體內(nèi)熒光分析。

為了說(shuō)明變體之一的熒光應(yīng)用，我們分析了與熒光團(tuán)芘結(jié)合的變體發(fā)射模式。當(dāng)兩個(gè)芘分子靠近在一起時(shí)，已知作為激基(excimer)熒光，在465nm具有特征性的發(fā)射增加。我們用芘馬來(lái)酰亞胺標(biāo)記變體4和7并監(jiān)測(cè)發(fā)射光譜。雖然變體4在465nm顯示基礎(chǔ)水平的發(fā)射，但是變體7顯示強(qiáng)的激基熒光?？紤]到變體7的C_H1中工程化半胱氨酸的位置，在Fab結(jié)構(gòu)域的內(nèi)側(cè)上，觀察到的結(jié)果與已知的相對(duì)于Fc的Fab的剪切作用相關(guān)聯(lián)。因此，該變體可用于抗體結(jié)構(gòu)域動(dòng)力學(xué)的分析。

變體6的高寡聚化傾向提示抗體半胱氨酸變體的另一個(gè)效用，其被更詳細(xì)地探究。將標(biāo)記的變體6進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析以從寡聚體分離單體，將含有蛋白的部分在7.5％非還原SDS‐PAGE凝膠上分辨并在用考馬斯藍(lán)染色之前和之后進(jìn)行分析。變體6的凝膠過(guò)濾分析顯示標(biāo)記和交聯(lián)之間的競(jìng)爭(zhēng)：種類的MW越高，標(biāo)記效率(熒光水平所顯示的)越低。最高M(jìn)W的種類具有0.5的標(biāo)記效率，而單體種類具有1.0的標(biāo)記效率，最初的標(biāo)記樣品具有0.8的標(biāo)記效率。具有多個(gè)寡聚體的抗體變體，變體6呈現(xiàn)抗體寡聚化的極好對(duì)照和高分子量蛋白的合適標(biāo)準(zhǔn)，具有另外的功能性——其可被位點(diǎn)特異地標(biāo)記。

實(shí)施例4：半胱氨酸變體的交聯(lián)傾向(CLP)和空間聚集傾向(SAP)之間的相關(guān)性

比較半胱氨酸變體的交聯(lián)傾向(CLP)和空間聚集傾向(SAP)，在該半胱氨酸變體中特定的氨基酸用半胱氨酸置換。基于非還原SDS‐PAGE分析給每個(gè)變體指定CLP。突變殘基的SAP值來(lái)自半徑的計(jì)算結(jié)果。我們?cè)赟AP‐編碼的抗體‐1結(jié)構(gòu)上覆蓋工程化半胱氨酸變體。

觀察到以下相關(guān)性。用半胱氨酸置換的所有氨基酸在‐0.27至0.00的范圍里具有負(fù)的SAP值。這與用于置換的極性或帶電荷氨基酸的選擇是一致的。所有CLP I類變體具有0.00和‐0.11之間的SAP(變體3、4、7、10、12)，所有CLP II類變體具有‐0.12和‐0.23之間的SAP(變體1、2、13)。然而，存在在具有高CLP的那些范圍中具有SAP的變體(例如變體8、9和11)。高度交聯(lián)變體變體8和11鄰近SAP位點(diǎn)。具有CLP III的變體5靠近C_H2中的高SAP位點(diǎn)，而CLP II的變體2不是。然而，在C_H3中的變體6和變體10之間，V_H中的變體9和14之間沒(méi)有這種相關(guān)性。

另外的觀察結(jié)果由變體14制造。如果附近有高SAP區(qū)，那么變體14不能表達(dá)，而當(dāng)該高SAP區(qū)被低SAP區(qū)替換，它就表達(dá)。與在天然的抗體‐2背景中的變體14的產(chǎn)率(0.34mg/L)相比，觀察到在穩(wěn)定的抗體‐2中變體14高100倍的產(chǎn)率(35.6mg/L培養(yǎng)物)。當(dāng)半胱氨酸被引入到接近高SAP值的蛋白表面時(shí)，變體14在不同背景中的相對(duì)產(chǎn)率顯示結(jié)構(gòu)問(wèn)題。當(dāng)鄰近工程化半胱氨酸的疏水碎片中的兩個(gè)疏水的氨基酸由賴氨酸置換時(shí)，該問(wèn)題得以解決。

綜上所述，相關(guān)性在半胱氨酸變體的穩(wěn)定性與SAP之間存在：1)具有低交聯(lián)傾向的半胱氨酸變體具有稍微負(fù)的SAP(0.00至‐0.11)，2)具有更負(fù)的SAP(‐0.12至‐0.23)的半胱氨酸變體更易于交聯(lián)，和3)高SAP碎片的緊鄰區(qū)域中的半胱氨酸變體更可能交聯(lián)或具有結(jié)構(gòu)異常。結(jié)論1和2與先前限定的觀點(diǎn)一致，該觀點(diǎn)是完全暴露的殘基可能更易于交聯(lián)[9]。

實(shí)施例5–結(jié)論

我們?cè)O(shè)計(jì)了一組人IgG1半胱氨酸變體，其廣泛地分布在抗體分子上，每個(gè)免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)域至少一個(gè)變體。這些變體中的大部分是穩(wěn)定的，并能被有效和特異地結(jié)合，而不顯著喪失抗原結(jié)合活性。因此，穩(wěn)定的抗體變體加到用于有效負(fù)載分子的位點(diǎn)特異結(jié)合的變體儲(chǔ)庫(kù)。如果熒光團(tuán)連接到工程化半胱氨酸，那么可分析特定結(jié)構(gòu)域的動(dòng)力學(xué)。高度寡聚化變體也是有益的，因?yàn)楹芏喽嗑垠w為抗體聚集物和為通常高分子量蛋白提供方便的標(biāo)準(zhǔn)物。

這里描述的抗體半胱氨酸變體的交聯(lián)傾向和SAP方法之間的相關(guān)性顯示，SAP方法學(xué)可用于篩選具有降低的交聯(lián)的結(jié)合位點(diǎn)。SAP技術(shù)是基于計(jì)算機(jī)的，因此它減少變體設(shè)計(jì)中的時(shí)間和實(shí)驗(yàn)工作。CLP/SAP比較顯示部分和不是完全暴露的氨基酸的置換產(chǎn)生最穩(wěn)定的變體。而且，該比較顯示鄰近的疏水碎片應(yīng)被避免。

這里描述的工程化人IgG1表面半胱氨酸變體為治療性抗體的位點(diǎn)特異性結(jié)合提供新位點(diǎn)和識(shí)別另外變體的方法。幾乎沒(méi)有交聯(lián)傾向的變體在發(fā)展用于靶向治療的抗體中具有極大的效用。本文公開(kāi)的半胱氨酸變體包括在先前表示的結(jié)構(gòu)域(C_L、C_H1、C_H3)以及在先前未表示的結(jié)構(gòu)域(V_L、V_H、C_H2)中的新位點(diǎn)。

而且，標(biāo)記的變體可用作一組位點(diǎn)特異性熒光抗體標(biāo)志用于體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)室研究。熒光標(biāo)記的產(chǎn)物可通過(guò)提供給研究團(tuán)體抗體和其它蛋白試劑的生物技術(shù)公司(如Thermo Scientific Pierce、GE Healthcare和Invitrogen)被商業(yè)化。

高度交聯(lián)變體6是有用的蛋白質(zhì)凝膠或其它層析技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。它可由提供蛋白試劑的公司(例如Invitrogen、Bio‐Rad和Pierce)推向市場(chǎng)。

CLP和SAP之間的相關(guān)性進(jìn)一步提示我們先前描述的SAP技術(shù)的商業(yè)應(yīng)用。對(duì)SAP的考慮可改善用于位點(diǎn)特異性結(jié)合的穩(wěn)定的抗體半胱氨酸變體的設(shè)計(jì)。

表1

參考文獻(xiàn)

1.Carter,P.J.,Potent antibody therapeutics by design.Nat Rev Immunol,2006.6(5):p.343‐57.

2.Polakis,P.,Arming antibodies for cancer therapy.Curr Opin Pharmacol,2005.5(4):p.382‐7.

3.Kaminski,M.S.,et al.,Radioimmunotherapy of B‐cell lymphoma with[131I]anti‐B1(anti‐CD20)antibody.N Engl J Med,1993.329(7):p.459‐65.

4.King,D.J.,et al.,Preparation and preclinical evaluation of humanised A33immunoconjugates for radioimmunotherapy.Br J Cancer,1995.72(6):p.1364‐72.

5.Khaw,B.A.,et al.,Myocardial infarct imaging of antibodies to canine cardiac myosin with indium‐111‐diethylenetriamine pentaacetic acid.Science,1980.209(4453):p.295‐7.

6.Rodwell,J.D.,et al.,Site‐specific covalent modification of monoclonal antibodies:in vitro and in vivo evaluations.Proc Natl Acad Sci U S A,1986.83(8):p.2632‐6.

7.Sun,M.M.,et al.,Reduction‐alkylation strategies for the modification of specific monoclonal antibody disulfides.Bioconjug Chem,2005.16(5):p.1282‐90.

8.Junutula,J.R.,et al.,Site‐specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index.Nat Biotechnol,2008.26(8):p.925‐32.

9.Lyons,A.,et al.,Site‐specific attachment to recombinant antibodies via introduced surface cysteine residues.Protein Eng,1990.3(8):p.703‐8.

10.Shopes,B.,A genetically engineered human IgG mutant with enhanced cytolytic activity.J Immunol,1992.148(9):p.2918‐22.

11.Shopes,B.,A genetically engineered human IgG with limited flexibility fully initiates cytolysis via complement.Mol Immunol,1993.30(6):p.603‐9.

12.Stimmel,J.B.,et al.,Site‐specific conjugation on serine right‐arrow cysteine variant monoclonal antibodies.J Biol Chem,2000.275(39):p.30445‐50.

13.Zheng,Y.,et al.,Conformations of IgE bound to its receptor Fc epsilon RI and in solution.Biochemistry,1991.30(38):p.9125‐32.

14.Zheng,Y.,et al.,Dynamic conformations compared for IgE and IgG1 in solution and bound to receptors.Biochemistry,1992.31(33):p.7446‐56.

15.Junutula,J.R.,et al.,Rapid identification of reactive cysteine residues for site‐specific labeling of antibody‐Fabs.J Immunol Methods,2008.332(1‐2):p.41‐52.