本發(fā)明具體涉及一種鑭系金屬介導(dǎo)的膠原多肽及其仿生材料的制備方法，屬于生物納米材料制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

作為細胞外基質(zhì)的主要組成部分,膠原蛋白由于良好的生物學(xué)性能和結(jié)構(gòu)特點，它在再生醫(yī)學(xué)和組織工程中得到廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。膠原蛋白具有完美的(Gly-X-Y)n重復(fù)氨基酸序列和經(jīng)典的三重螺旋結(jié)構(gòu)。膠原蛋白纖維形成的分子支架，可以為哺乳動物提供完整的結(jié)構(gòu)和較好的機械強度。因此，膠原蛋白仿生多肽的設(shè)計在構(gòu)建新型生物功能材料方面有很多潛在的應(yīng)用。

對仿生膠原多肽的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種策略來制備膠原多肽納米材料，包括：半胱氨酸修飾的多肽、靜電相互作用、π-π堆積作用、陽離子-π相互作用、金屬配位作用、兩親性多肽、成核現(xiàn)象以及疏水作用等。利用各種膠原多肽，現(xiàn)已經(jīng)成功合成了高度有序的微絲狀、網(wǎng)狀、微型管、空心球、納米盤、納米片等結(jié)構(gòu)。由于膠原多肽自身具有良好的生物相容性和降解性能，利用膠原多肽自組裝方法構(gòu)建的納米材料在藥物控制釋放、組織工程支架材料以及生物礦化等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。

鑭系金屬離子作為光致發(fā)光材料，具有發(fā)光壽命長、低毒性、線性發(fā)射、光化學(xué)穩(wěn)定性高等優(yōu)點，因而在醫(yī)學(xué)診斷和細胞成像領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。固相合成法具有反應(yīng)過程不需要對中間體進行分離純化、收率較高、過程易于檢測等諸多優(yōu)點。本發(fā)明涉及一種鑭系金屬介導(dǎo)的自組裝膠原多肽及其仿生發(fā)光材料的制備方法。特殊設(shè)計的膠原多肽在不同的鑭系金屬離子的介導(dǎo)下，在非常溫和的條件下，均可自組裝形成結(jié)構(gòu)可控的納米材料；而且，該納米材料具有良好且可調(diào)控的發(fā)光性能。膠原多肽與鑭系金屬離子自組裝形成的膠原仿生發(fā)光材料，在細胞成像、醫(yī)療診斷、以及細胞培養(yǎng)發(fā)光支架等方面具有巨大潛力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提出了一種鑭系金屬介導(dǎo)的膠原多肽及其仿生材料的制備方法，特殊設(shè)計的膠原多肽在鑭系金屬離子的介導(dǎo)下，在非常溫和的條件下，自組裝形成結(jié)構(gòu)可控，并具有良好發(fā)光性能的納米材料。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下技術(shù)方案：

一種鑭系金屬介導(dǎo)的膠原多肽及其仿生材料的制備方法，包括如下步驟：

(1)仿生膠原多肽的設(shè)計與合成

設(shè)計特定氨基酸序列的膠原多肽，包括:①、中間含有較多的(Gly-Pro-Hyp)n或(Gly-Pro-Pro)n重復(fù)序列，以幫助多肽形成膠原經(jīng)典的三重螺旋結(jié)構(gòu)；②、兩端含有天冬氨酸或谷氨酸，以實現(xiàn)與鑭系金屬的配位；設(shè)計好的膠原多肽采用Fmoc固相合成法，利用手動合成儀逐步合成的方式合成，包括：a、樹脂處理溶脹；b、活化氨基酸；c、縮合反應(yīng)；d、α-氨基脫保護；e、延伸肽樹脂；f、切割肽樹脂；g、肽的分離純化。

(2)膠原仿生發(fā)光納米材料的制備

在0.1M HEPES，pH 7.0的緩沖溶液條件下，配制濃度為0.1-10.0mg/ml的膠原多肽溶液；配置濃度為50mM的不同鑭系金屬的硝酸鹽溶液；按照鑭系金屬離子與膠原多肽的摩爾比分別為1:1-15:1的條件下，配置鑭系金屬離子與膠原多肽的混合溶液；將上述混合溶液在4-70℃的恒溫箱里放置1-96hrs；將反應(yīng)產(chǎn)物在10000rpm下進行固液分離，得到固體沉淀；并用乙醇分散固體，再離心純化3-5次，得到可發(fā)光的納米材料。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟(1)中所述膠原多肽的兩端第一個氨基酸為天冬氨酸或谷氨酸，第二個氨基酸為天冬氨酸，谷氨酸或色氨酸，中間序列為GPO，GPP，GDP或GEP。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟(1)中所述鑭系金屬元素為鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿、镥中的一種或幾種。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟(1)中所述膠原多肽固相合成使用的樹脂為二氯樹脂，縮合體系為高效的HBTU/HOBt/DIEA縮合體系。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟(2)中所述膠原多肽的濃度為1.0-5.0mg/ml，鑭系金屬離子與膠原多肽的摩爾比為1:1-9:1。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟(2)中所述鑭系金屬離子與膠原多肽的混合溶液在4-45℃的恒溫箱里放置6-64hrs。

本發(fā)明公開的一種鑭系金屬介導(dǎo)的膠原多肽及其仿生材料的制備方法，具有以下優(yōu)點：膠原多肽多肽在不同的鑭系金屬離子的介導(dǎo)下，在非常溫和的條件下，均可自組裝形成結(jié)構(gòu)可控的納米材料；而且該納米材料具有良好且可調(diào)控的發(fā)光性能；膠原多肽與鑭系金屬離子自組裝形成的膠原仿生發(fā)光材料，在細胞成像、醫(yī)療診斷、以及細胞培養(yǎng)發(fā)光支架等方面具有巨大潛力。

附圖說明

圖1為膠原多肽DD(GPP)₅GDP(GPP)₆DD在鑭系金屬離子介導(dǎo)下自組裝形成納米材料的掃描電子顯微鏡圖；

圖2為膠原多肽DD(GPP)₅GDP(GPP)₆DD在鑭系金屬離子介導(dǎo)下自組裝形成納米材料的透射電子顯微鏡圖；

圖3為膠原多肽DD(GPP)₅GDP(GPP)₆DD在鑭系金屬離子介導(dǎo)下自組裝形成納米材料的熒光發(fā)射光譜圖；

圖4為膠原多肽DD(GPO)₇DD在鑭系金屬離子介導(dǎo)下自組裝形成納米材料的掃描電子顯微鏡圖；

圖5為膠原多肽DW(GPO)₇WD在鑭系金屬離子介導(dǎo)下自組裝形成納米材料的掃描電子顯微鏡圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實施方式，進一步闡述本發(fā)明。

如圖1-圖5所示，一種鑭系金屬介導(dǎo)的膠原多肽及其仿生材料的制備方法，包括如下步驟：

(1)仿生膠原多肽的設(shè)計與合成

設(shè)計特定氨基酸序列的膠原多肽，包括:①、中間含有較多的(Gly-Pro-Hyp)n或(Gly-Pro-Pro)n重復(fù)序列，以幫助多肽形成膠原經(jīng)典的三重螺旋結(jié)構(gòu)；②、兩端含有天冬氨酸或谷氨酸，以實現(xiàn)與鑭系金屬的配位；設(shè)計好的膠原多肽采用Fmoc固相合成法，利用手動合成儀逐步合成的方式合成，包括：a、樹脂處理溶脹；b、活化氨基酸；c、縮合反應(yīng)；d、α-氨基脫保護；e、延伸肽樹脂；f、切割肽樹脂；g、肽的分離純化。

(2)膠原仿生發(fā)光納米材料的制備

在0.1M HEPES，pH 7.0的緩沖溶液條件下，配制濃度為0.1-10.0mg/ml的膠原多肽溶液；配置濃度為50mM的不同鑭系金屬的硝酸鹽溶液；按照鑭系金屬離子與膠原多肽的摩爾比分別為1:1-15:1的條件下，配置鑭系金屬離子與膠原多肽的混合溶液；將上述混合溶液在4-70℃的恒溫箱里放置1-96hrs；將反應(yīng)產(chǎn)物在10000rpm下進行固液分離，得到固體沉淀；并用乙醇分散固體，再離心純化3-5次，得到可發(fā)光的納米材料。

其中，步驟(1)中所述膠原多肽序列來自于表1或表2中的肽序列的一種或幾種，多肽的兩端第一個氨基酸為天冬氨酸或谷氨酸，第二個氨基酸為天冬氨酸，谷氨酸或色氨酸，中間序列為GPO,GPP,GDP或GEP。

表1

表2

其中，步驟(1)中所述鑭系金屬元素為鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿、镥中的一種或幾種。

其中，步驟(1)中所述膠原多肽固相合成使用的樹脂為二氯樹脂，縮合體系為高效的HBTU/HOBt/DIEA縮合體系。

其中，步驟(2)中所述膠原多肽的濃度為1.0-5.0mg/ml，鑭系金屬離子與膠原多肽的摩爾比為1:1-9:1。

其中，步驟(2)中所述鑭系金屬離子與膠原多肽的混合溶液在4-45℃的恒溫箱里放置6-64hrs。

實施例1

一種鑭系金屬介導(dǎo)的自組裝膠原多肽DD(GPP)₅GDP(GPP)₆DD及其仿生發(fā)光材料的制備，實現(xiàn)步驟如下：

(1)固相合成法合成膠原多肽DD(GPP)₅GDP(GPP)₆DD

采用Fmoc固相合成法，利用手動合成儀逐步合成的方式合成膠原多肽DD(GPP)₅GDP(GPP)₆DD。

(2)膠原仿生發(fā)光納米材料的制備

在0.1M HEPES，pH 7.0的緩沖溶液條件下，配制濃度為5mg/ml的膠原多肽溶液；配置濃度為50mM的不同鑭系金屬的硝酸鹽溶液；按照鑭系金屬離子與膠原多肽的摩爾比為2:1的條件下，配置鑭系金屬離子與膠原多肽的混合溶液；將上述混合溶液在25℃的恒溫箱里放置48hrs；將反應(yīng)產(chǎn)物在10000rpm下進行固液分離，得到固體沉淀；并用乙醇分散固體，再離心純化3-5次，得到可發(fā)光的納米材料。

實施例2

一種鑭系金屬介導(dǎo)的自組裝膠原多肽DD(GPO)₇DD及其仿生發(fā)光材料的制備，實現(xiàn)步驟如下：

(1)固相合成法合成膠原多肽DD(GPO)₇DD

采用Fmoc固相合成法，利用手動合成儀逐步合成的方式合成膠原多肽DD(GPO)₇DD。

(2)膠原仿生發(fā)光納米材料的制備

在0.1M HEPES，pH 7.0的緩沖溶液條件下，配制濃度為3mg/ml的膠原多肽溶液；配置濃度為50mM的不同鑭系金屬的硝酸鹽溶液；按照鑭系金屬離子與膠原多肽的摩爾比為1:1的條件下，配置鑭系金屬離子與膠原多肽的混合溶液；將上述混合溶液在4℃的恒溫箱里放置24hrs；將反應(yīng)產(chǎn)物在10000rpm下進行固液分離，得到固體沉淀。并用乙醇分散固體，再離心純化3-5次，得到可發(fā)光的納米材料。

實施例3

一種鑭系金屬介導(dǎo)的自組裝膠原多肽DW(GPO)₇WD及其仿生發(fā)光材料的制備，實現(xiàn)步驟如下：

(1)固相合成法合成膠原多肽DW(GPO)₇WD

采用Fmoc固相合成法，利用手動合成儀逐步合成的方式合成膠原多肽DW(GPO)₇WD。

(2)膠原仿生發(fā)光納米材料的制備

在0.1M HEPES，pH 7.0的緩沖溶液條件下，配制濃度為1mg/ml的膠原多肽溶液；配置濃度為50mM的不同鑭系金屬的硝酸鹽溶液；按照鑭系金屬離子與膠原多肽的摩爾比為1:1的條件下，配置鑭系金屬離子與膠原多肽的混合溶液；將上述混合溶液在25℃的恒溫箱里放置24hrs；將反應(yīng)產(chǎn)物在10000rpm下進行固液分離，得到固體沉淀；并用乙醇分散固體，再離心純化3-5次，得到可發(fā)光的納米材料。

以上所述為本發(fā)明的一個示范性實施案例的細節(jié)。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明在實際應(yīng)用過程中根據(jù)具體的制備條件可以有各種更改和變化，并不用于限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)，不應(yīng)將權(quán)利要求中的任何附圖標(biāo)記視為限制所涉及的權(quán)利要求。