本發(fā)明涉及胰島素的結(jié)晶領(lǐng)域。具體涉及一種制備甘精胰島素結(jié)晶的方法。

背景技術(shù)：

胰島素是由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.貝斯特首先發(fā)現(xiàn)。1922年開(kāi)始用于臨床，使過(guò)去不治的糖尿病患者得到挽救。近年來(lái)，全世界糖尿病的患病率都在迅猛增長(zhǎng)，胰島素的需求越來(lái)越多，單純的從動(dòng)物細(xì)胞提取已滿足不了病人的需求，胰島素及胰島素類似物的生產(chǎn)迫在眉睫。其中一種新開(kāi)發(fā)的長(zhǎng)效胰島素類似物-甘精胰島素，正在越來(lái)越多被醫(yī)生和患者所接受和使用。

甘精胰島素(recombinant glycine-arginine insulin)是一種通過(guò)基因重組技術(shù)獲得并用于治療Ⅰ、Ⅱ型糖尿病的長(zhǎng)效胰島素類生物制品，其持續(xù)控制血糖的原理為：皮下注射后甘精胰島素分子立即聚合，因而溶解度降低，形成甘精胰島素沉淀物，機(jī)體吸收延遲，其降糖作用的時(shí)間也被延長(zhǎng)。甘精胰島素是當(dāng)前治療Ⅰ、Ⅱ型糖尿病十分方便和有效的藥物。國(guó)外由Aventis公司生產(chǎn)的甘精胰島素注射液(商品名Lantus)與人胰島素的不同之處在于其A鏈羧基端21位的天門冬氨酸被甘氨酸所取代，B鏈羧基端30位蘇氨酸后的31和32位連接了兩個(gè)精氨酸，改造后的活性胰島素即甘精胰島素，由E.coli表達(dá)生產(chǎn)。可在糖尿病患者體內(nèi)平穩(wěn)發(fā)揮藥效24小時(shí)以上，并且無(wú)明顯的血藥高峰值和低峰值，很適合用于低基礎(chǔ)胰島素的替代治療。

甘精胰島素是一種在中性液中溶解度低的人胰島素類似物。在本品酸性(pH＝4)注射液中，完全溶解。其主要作用是調(diào)節(jié)糖代謝。中國(guó)糖尿病防治指南認(rèn)可：甘精胰島素是唯一平穩(wěn)無(wú)峰、作用時(shí)間長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)的胰島素。符合人類生活作息周期，每天只需注射一次，而被患者和醫(yī)生所青睞。

目前市場(chǎng)上大多以無(wú)定型或者粉末存在的甘精胰島素沒(méi)有均一且穩(wěn)定的形態(tài)，而以結(jié)晶形式存在的甘精胰島素，體積小，易與上清分開(kāi)，大大縮短了過(guò)濾、洗晶及凍干的時(shí)間，生產(chǎn)效率高，是更好的重組甘精胰島素的應(yīng)用形式。因此，尋找一個(gè)穩(wěn)定且簡(jiǎn)單的結(jié)晶方法勢(shì)在必行。

中國(guó)專利CN102219851B中公開(kāi)了一種從含有甘精胰島素、有機(jī)溶劑、鋅、酚衍生物、鹽以及有機(jī)酸的結(jié)晶液中，在pH 7.0～9.0的條件下制備甘精胰島素結(jié)晶的方法，該方法制備的結(jié)晶具有穩(wěn)定的固體分子形式，易于大批生產(chǎn)操作，沉降體積小，易與上清分離，離心時(shí)間及凍干時(shí)間短，生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)，但是結(jié)晶過(guò)程中有大量有機(jī)試劑存在，這些揮發(fā)性差且毒性高的有機(jī)溶劑的殘留會(huì)嚴(yán)重影響胰島素產(chǎn)品的質(zhì)量。這不僅會(huì)給最終的結(jié)晶產(chǎn)品帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)，也給后續(xù)操作帶來(lái)很多麻煩。雖然該發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為，甘精胰島素在沒(méi)有有機(jī)溶劑的條件下，只能是絮狀的無(wú)定形沉淀，無(wú)法形成結(jié)晶，但本發(fā)明通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)后證明，即使在無(wú)有機(jī)溶劑存在條件下，甘精胰島素也能形成較好的六聚體晶型，且此在不含有機(jī)溶劑的 溶液中結(jié)晶的方法不僅能簡(jiǎn)化結(jié)晶操作過(guò)程，降低風(fēng)險(xiǎn)，還可以降低成本，減少對(duì)環(huán)境的污染。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷和不足，提供一種在不含有機(jī)溶劑的溶液中制備甘精胰島素結(jié)晶的方法，該方法簡(jiǎn)單、方便、綠色環(huán)保且可降低成本，所制備的甘精胰島素結(jié)晶體積小，易與上清分開(kāi)，大大縮短了過(guò)濾、洗晶及凍干的時(shí)間，生產(chǎn)效率高，后續(xù)風(fēng)險(xiǎn)低，是較好的甘精胰島素的應(yīng)用形式。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案提供了一種制備甘精胰島素結(jié)晶的方法，包括以下步驟：

1)將甘精胰島素、酚類衍生物、含鋅物質(zhì)和有機(jī)酸溶于水中，制成結(jié)晶液；

2)取pH調(diào)節(jié)劑將結(jié)晶液的pH值調(diào)至4.5～7.0，攪拌3～9小時(shí)，分離即得；

其中結(jié)晶液中甘精胰島素的濃度為1～3.5g/L，酚類衍生物、含鋅物質(zhì)和有機(jī)酸的質(zhì)量/體積分?jǐn)?shù)分別為0.01～1.00％、0.005～1.5％和0.01～2.0％。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，酚類衍生物選自苯酚、間甲酚或?qū)αu基苯甲酸甲脂。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，有機(jī)酸選自乙酸、檸檬酸或甘氨酸。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，含鋅物質(zhì)選自氯化鋅、氧化鋅、乙酸鋅、溴化鋅或硫酸鋅。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟1)所述結(jié)晶液的pH值為4.5～5.5，步驟2)所述pH值調(diào)至5.0～7.0。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，pH值調(diào)節(jié)劑為在pH 5.0～7.0具有緩沖能力的緩沖溶液。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，pH值調(diào)節(jié)劑選自氫氧化鉀、氫氧化鈉、氨水。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，pH值調(diào)節(jié)劑的濃度為0.5～4M。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，甘精胰島素結(jié)晶的制備是在室溫下進(jìn)行的。

本發(fā)明的實(shí)施方式中使用的水均為去離子水。

除非明確地說(shuō)明與此相反，否則，本發(fā)明引用的所有范圍包括端值。例如，“將上述結(jié)晶液調(diào)pH值至5.0～7.0”表示結(jié)晶液的pH取值范圍為5.0≤n≤7.0。

本發(fā)明所述的“分離”表示在重力或者其他外力作用下通過(guò)介質(zhì)或不通過(guò)介質(zhì)將流體與非流體分離的操作，所述介質(zhì)包括但不限于濾紙、紗布、濾芯、半透膜、濾網(wǎng)等，理論上，含有多孔結(jié)構(gòu)的材料都可以成為過(guò)濾的介質(zhì)；將固體部分分離的設(shè)備包括但不限于真空或減壓裝置、加壓裝置、離心裝置等。

本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“或”表示備選方案，如果合適的話，可以將它們組合，也就是說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“或”包括每個(gè)所列出的單獨(dú)備選方案以及它們的組合。例如，“所述的有機(jī)酸選自乙酸、檸檬酸或甘氨酸?！北硎居袡C(jī)酸是乙酸、檸檬酸、甘氨酸之中的一種，也可以是其一種以上的組合。

本發(fā)明中的數(shù)字均為近似值，無(wú)論有否使用“大約”或“約”等字眼。數(shù)字的數(shù)值有可能會(huì)出現(xiàn)1％、2％、5％、7％、8％、10％等差異。每當(dāng)公開(kāi)一個(gè)具有N值的數(shù)字時(shí)，任何具有N+/-1％，N+/-2％，N+/-3％，N+/-5％，N+/-7％，N+/-8％或N+/-10％值的數(shù)字會(huì)被明確地公開(kāi)，其中“+/-”是指加或減。

本發(fā)明所述的室溫是指10～35℃。

有益效果：

本發(fā)明所述的方法能使甘精胰島素在無(wú)有機(jī)溶劑的條件下直接結(jié)晶，綠色環(huán)保，操作簡(jiǎn)單，還可以降低成本，同時(shí)形成的晶體具有較好的晶型，且大小形狀均一。

本發(fā)明制備結(jié)晶的方法工藝簡(jiǎn)單，容易控制，縮短了產(chǎn)品的過(guò)濾收集、洗晶及冷凍干燥時(shí)間，適用于甘精胰島素的工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施案例1中甘晶胰島素結(jié)晶在顯微鏡下1000倍放大圖。

圖2為實(shí)施案例2中甘晶胰島素結(jié)晶在顯微鏡下400倍放大圖。

圖3為實(shí)施案例3中甘晶胰島素結(jié)晶在顯微鏡下400倍放大圖。

具體實(shí)施方式

以下所述的是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所保護(hù)的不限于以下優(yōu)選實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)在此發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的基礎(chǔ)上，做出的若干變形和改進(jìn)，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例中所用的原料均可以通過(guò)商業(yè)途徑獲得。

氯化鋅購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20100517；苯酚購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20110216；檸檬酸購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20100723；氫氧化鈉購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20120416。

實(shí)施例1

制備甘精胰島素結(jié)晶液，結(jié)晶液中各組分的含量為：甘精胰島素：2.53g/L，苯酚：0.1％、氯化鋅：0.05％、檸檬酸：0.5％。

秤取10.11g甘精胰島素溶于2L水中，制成甘精胰島素溶液，另將3.99g苯酚、2.02g氯化鋅、20.11g檸檬酸加入到結(jié)晶溶液中，加水定容至4L，制成結(jié)晶液。將結(jié)晶液置于室溫下低速攪拌，用氫氧化鈉調(diào)pH值到5.0，攪拌4小時(shí)，在室溫下靜置，然后取上清檢測(cè)，上清液中甘精胰島素的含量為0.04mg/ml。

取結(jié)晶混懸液鏡檢，放大1000倍可見(jiàn)明顯的六面體結(jié)晶，透明度較高(圖1)。

實(shí)施例2

制備甘精胰島素結(jié)晶液，結(jié)晶液中各組分的含量為：甘精胰島素：2.07g/L，苯酚：0.01％、氯化鋅：0.007％、檸檬酸:0.05％。

秤取2.07g甘精胰島素溶于500ml水中，制成甘精胰島素溶液，另將2ml 5％苯酚、1.75ml 4％氯化鋅、0.5g檸檬酸加入到結(jié)晶溶液中，加水定容至1L，制成結(jié)晶液。將結(jié)晶液置于室溫下低速攪拌，用氫氧化鈉調(diào)pH至6.8，攪拌6小時(shí)，在室溫下靜置，然后去上清檢測(cè)，上清液中甘精胰島素的含量為0.01mg/ml。

取結(jié)晶混懸液鏡檢，放大400倍可見(jiàn)明顯結(jié)晶，透明度較高(圖2)。

實(shí)施例3

制備甘精胰島素結(jié)晶液，該結(jié)晶液中各組分的含量為：甘精胰島素：3.17g/L，苯酚：0.7％、氯化鋅：1.5％、檸檬酸：1.8％。

秤取6.34g甘精胰島素溶于1L水中，制成甘精胰島素溶液，另將14g苯酚、30g氯化鋅、36g檸檬酸加入到結(jié)晶溶液中，加水定容至2L，制成結(jié)晶液。將結(jié)晶液置于室溫下低速攪拌，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，攪拌9小時(shí)，在室溫下靜置，然后去上清檢測(cè)，上清液中甘精胰島素的含量為0.04mg/ml。

取結(jié)晶混懸液鏡檢，放大400倍可見(jiàn)明顯的結(jié)晶，透明度較高(圖3)。