專利名稱：胰島素c肽的重組表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由重組DNA分子生產(chǎn)胰島素C肽，這些重組DNA分子包含編碼胰島素C肽基因序列的多份拷貝。
胰島素是一種參與血糖調(diào)節(jié)的蛋白類激素。胰島素以前體胰島素原的形式在肝臟中合成，胰島素原由胰島素的A鏈和B鏈通過C肽(后文中，衍生自胰島素原的這一C肽被稱作“胰島素C肽”)連接而成。胰島素本身只含B鏈和A鏈。近期的研究指出C肽與臨床有關(guān)(Johansson等，Diabetologia(1992)35，121-128和J.Clin.Endocrinol.Metab.(1993)77，976-981)。在缺乏內(nèi)源C肽的I型糖尿病患者中，使用該肽增強(qiáng)了腎功能，促進(jìn)肌肉興奮和對(duì)葡萄糖的利用，并改善血液-視網(wǎng)膜屏障(Johansson等，1992，同上)。
雖然還未被廣泛認(rèn)同，但是醫(yī)療界開始越來越認(rèn)識(shí)到胰島素C肽的治療用途。所以，目前需要一種合成胰島素C肽方便、經(jīng)濟(jì)而有效的方法。雖然目前肽的化學(xué)合成方法(例如在固相上逐步添加氨基酸)已經(jīng)很成熟，盡管它們可以自動(dòng)化，但是它們?nèi)匀缓苜M(fèi)時(shí)，更重要的是很昂貴，而且因可合成的最大肽長度有限而不經(jīng)濟(jì)，不可靠。目前已經(jīng)發(fā)展了生產(chǎn)肽的另一種方法，即表達(dá)重組DNA，但是這也有缺點(diǎn)，例如得率問題。
目前胰島素C肽的生產(chǎn)方法一般以胰蛋白酶和羧肽酶B對(duì)胰島素原的加工為基礎(chǔ)(Nilsson等，(1996)，J.Biochem.48，241-250；Jonasson等，(1996)Eur.J.Biochem.236，656-661)。胰島素原在合成時(shí)是能夠在大腸桿菌中高效表達(dá)的融合蛋白，融合蛋白經(jīng)基因工程處理為融合伴侶能夠在胰島素原被加工成胰島素和C肽的同時(shí)切除。胰島素原合成時(shí)與ZZ形成融合蛋白，后者是結(jié)合IgG(免疫球蛋白)的葡萄球菌蛋白A衍生的一種合成親合性融合標(biāo)簽(Nilsson等，(1987)，Prot.Eng.1，107-113)。挑選該融合標(biāo)簽是因?yàn)樗哂锌沟鞍酌杆夥€(wěn)定性，IgG結(jié)合能力，高表達(dá)水平和可溶性。所選的生產(chǎn)方法允許使用親合性標(biāo)簽在先溶解包含體再復(fù)性后有效純化，無需為切割去除ZZ親合性標(biāo)簽的其他單元操作。已經(jīng)證明，所述的標(biāo)簽可在胰蛋白酶/羧肽酶B將胰島素原消化成胰島素和C肽時(shí)同時(shí)切除。但是，通過表達(dá)大融合蛋白來生產(chǎn)小肽通常得率很低，因?yàn)榻K產(chǎn)物只占所表達(dá)基因產(chǎn)物的小部分。
Shen在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，4627-4631，1984中說明了一種制備人胰島素原的方法，即通過表達(dá)融合或非融合的基因產(chǎn)物，其中包含多個(gè)串聯(lián)的胰島素原多肽結(jié)構(gòu)域拷貝。這種基因產(chǎn)物可以通過溴化氰處理切割成單個(gè)胰島素原單位。他提出，人胰島素可以用胰蛋白酶/羧肽酶B切割胰島素原來制備。但是，其中沒有解決提高胰島素C肽得率的問題。
所以，還是需要一種重組表達(dá)方法來提高非融合產(chǎn)物形式的胰島素C肽的得率。本發(fā)明解決了這一需要。
本發(fā)明的目的在于改善現(xiàn)有的重組表達(dá)肽的方法，主要基于這樣一個(gè)概念，即，表達(dá)單一基因產(chǎn)物形式的包含多份靶肽(胰島素C肽)拷貝的多聚體(即多聚多肽)，然后切割這樣的多聚基因產(chǎn)物(即多聚多肽)以釋放單體單位形式的靶肽，由此提高靶肽(在本發(fā)明中是胰島素C肽)的表達(dá)量。
所以，本發(fā)明一方面提供了一種生產(chǎn)胰島素C肽的方法，它包括在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)包含所述胰島素C肽多份拷貝的多聚多肽，將所述的表達(dá)出的多肽切割成單個(gè)胰島素C肽拷貝(即由多聚體釋放胰島素C肽單體)。
多聚多肽(基因產(chǎn)物)由包含編碼胰島素C肽的核苷酸序列多份拷貝的基因結(jié)構(gòu)(即核酸分子)編碼。多拷貝或重復(fù)序列在結(jié)構(gòu)中的連接方式使得它們被一起轉(zhuǎn)錄和翻譯成單一的多基因產(chǎn)物(即多聚多肽)，即“連讀方式”，例如，多份核苷酸序列在結(jié)構(gòu)中以匹配讀碼框內(nèi)的方式連接。實(shí)際上，基因結(jié)構(gòu)宜包含一個(gè)由胰島素C肽編碼核苷酸序列構(gòu)成的串聯(lián)體。較好的是，基因結(jié)構(gòu)包含編碼聚核苷酸的串聯(lián)拷貝。這樣，制備這樣的基因結(jié)構(gòu)，然后用標(biāo)準(zhǔn)方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并表達(dá)。然后，可回收表達(dá)的基因產(chǎn)物(多肽)，切割釋放胰島素C肽單體。
在另一方面內(nèi)容中，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)胰島素C肽的方法，它包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞，細(xì)胞中含有包含編碼胰島素C肽的核苷酸序列多份拷貝的核酸序列，培養(yǎng)條件允許所述核酸所編碼的多聚多肽被表達(dá)，切割表達(dá)的多肽，釋放胰島素C肽的單個(gè)拷貝。
在本發(fā)明中，“多”或“多聚”指胰島素C肽或其核苷酸序列的2份或更多份拷貝，以2至50，2至30或2至20份為宜，2至15或2至10份更好。其他的舉例性范圍還包括3至20，3至15或3至10份。
通常，所述結(jié)構(gòu)包含3份或更多份編碼胰島素C肽的核苷酸序列的拷貝，例如3至7或5至7份。7份或7份以上的范圍，例如7至30，7至20或7至15份也可使用。
“胰島素C肽”在本發(fā)明中包括天然或合成胰島素C肽的所有形式。這樣的胰島素C肽可以是人肽，或來自其他動(dòng)物，以哺乳動(dòng)物為佳。所以，對(duì)天然胰島素C肽的各種改變和修飾也包括在內(nèi)，只要它們保留有胰島素C肽的活性。胰島素C肽可以表達(dá)成天然形式，即它們天然存在于不同物種或因地域不同所致的不同等位基因變體，或是功能相當(dāng)?shù)淖凅w或衍生體，彼此的差異可在于氨基酸序列例如截短(從N或C末端，或從N和C兩端)或其它氨基酸的缺失、增加或取代。已知，改變蛋白質(zhì)或肽的序列但同時(shí)保留它們有用的活性可以用文獻(xiàn)中多有記載的本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)做到，例如隨機(jī)或定點(diǎn)誘變，核酸的切割和連接等。所以，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)可方便地制得天然胰島素C肽序列的功能相當(dāng)?shù)淖凅w或衍生體，其中包含具有天然胰島素C肽功能活性(例如生物活性)的肽序列。所以，就上述的活性而言，例如，已知胰島素C肽具有刺激Na+K+ATPase的活性，這一活性可能與報(bào)道中胰島素C肽的許多治療活性有關(guān)，例如治療糖尿病或治療或預(yù)防諸如糖尿病性神經(jīng)病、腎病和視網(wǎng)膜病等糖尿病綜合征。天然或合成胰島素C肽序列的片段可能也具有所需的原肽的功能，所以也包括在內(nèi)。需要特別指出的可能是Wahren等在WO98/13384中所述的肽片段。所有這些胰島素C肽的類似物、變體、衍生體或片段都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，都包涵于“胰島素C肽”這一概念。
通常，可使用天然人胰島素C肽，見圖2C(SEQ ID NO1)。
在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實(shí)施例中，基因結(jié)構(gòu)還包含一段編碼融合伴侶的序列(融合標(biāo)簽)，例如能夠結(jié)合基因表達(dá)產(chǎn)物加工中所用的基體的融合伴侶，。
“融合伴侶”指經(jīng)翻譯后與胰島素C肽鄰接在一起的蛋白質(zhì)或肽分子或其衍生物或片段，此特性可用于所表達(dá)的融合產(chǎn)物的進(jìn)一步加工。
融合伴侶與基體之間的相互作用可基于親合性，螯合肽，疏水性或電荷相互作用，或本領(lǐng)域已知的各種其它機(jī)制。通常，融合伴侶是一對(duì)親合性結(jié)合配對(duì)或配體中的一員，例如能夠選擇性或特異性與一種配體結(jié)合或反應(yīng)的蛋白質(zhì)、多肽或肽序列。合適的融合伴侶有，例如，鏈球菌蛋白G和葡萄球菌蛋白A以及它們的衍生物，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和親合素或鏈霉親合素，或上述蛋白的片段或衍生物，它們分別與免疫球蛋白G、底物類似物或抗體和生物素具有強(qiáng)親合性。上述相互作用可用來從復(fù)雜的混合物中純化融合蛋白產(chǎn)物。蛋白A的ZZ片段(參見Nilsson等，同上)是一例可用的蛋白質(zhì)片段。當(dāng)結(jié)合諸如Zn2+，Cu2+或Ni2+等金屬離子時(shí)，可用組氨酸肽作為融合伴侶，并可通過降低pH或用EDTA洗脫(Ljungquist等，(1989)Eur.J.Biochem.186，563-569)。特別好的多肽融合伴侶是鏈球菌G(spG)的25kDa的血清白蛋白結(jié)合區(qū)(BB)(Nygren等，(1988)J.Mol.Recogn.1，69-74)或其它SpG衍生的白蛋白結(jié)合標(biāo)簽(Stahl & Nygren(1997)Path.Bio.45，66-76)。Oberg等說明了一種表達(dá)載體pTrp BB(SEQ ID NO14)，適用于插入表達(dá)所需產(chǎn)物的基因片段，表達(dá)出的是與BB形成的融合蛋白(Peoceedings of the 6thEuropean Congress on Biotechnology，1994，179-182)。這些融合伴侶對(duì)白蛋白具有強(qiáng)親合性，所以，可用例如帶有白蛋白的層析柱以配體親合性層析為基礎(chǔ)純化所表達(dá)的融合蛋白。最好將白蛋白固定在固相支持物上。
可用各種常規(guī)方法進(jìn)行切割，即由多聚多肽(即表達(dá)的基因產(chǎn)物)，或與融合伴侶(可能存在)分離，切割成單體胰島素C肽。通常，這可用酶來實(shí)現(xiàn)。較好的是，最初的基因表達(dá)產(chǎn)物，即包含融合伴侶和胰島素C肽多拷貝(單體)的多聚多肽或融合產(chǎn)物或融合蛋白，是在一步中用一種或多種蛋白水解酶切割的，得到不融合的胰島素C肽的單獨(dú)拷貝。胰蛋白酶與羧肽酶B(例如源自牛、豬或其他來源)的聯(lián)合處理是獲取所需剪切產(chǎn)物特別好的方法。胰蛋白酶從蛋白質(zhì)的C末端開始在每個(gè)精氨酸殘基處切斷，羧肽酶B則在胰蛋白酶消化后去除各肽上的C末端精氨酸。蛋白酶剪切條件是本領(lǐng)域所熟知的，本領(lǐng)域熟知的還有其它合適的蛋白水解酶，例如枯草桿菌蛋白酶(包括它們的突變體)，腸激酶，Xa因子，凝血酶，IgA蛋白酶，3C蛋白酶和intein。已知，例如，將表達(dá)的基因產(chǎn)物與蛋白水解酶(例如胰蛋白酶和羧肽酶B)一起孵育60分鐘足以充分加工表達(dá)的蛋白。通常，要充分加工融合蛋白使得經(jīng)常規(guī)SDS PAGE檢測(cè)無融合或多聚蛋白，5分鐘孵育就夠了?；蛘?，最初的基因表達(dá)產(chǎn)物可用諸如CNBr，羥基胺或甲酸等化學(xué)試劑來切割。
根據(jù)胰島素C肽和所用核酸分子(基因結(jié)構(gòu))的確切性質(zhì)，(例如蛋白水解酶的)剪切位置可以是天然存在的，也可以是通過用諸如定點(diǎn)誘變，編碼適當(dāng)剪切位置的核苷酸序列的連接等已知技術(shù)對(duì)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)操作而引入的。
通常，表達(dá)出的多聚多肽包含一段接頭區(qū)，即含有或提供一個(gè)剪切位置的一段接頭殘基或肽。較好的是，剪切位置具有被蛋白水解酶識(shí)別并剪切的可剪切基序。接頭區(qū)可位于多聚結(jié)構(gòu)中各“單體”之間，和/或位于融合伴侶(如果存在)與單體肽之間。較好的是，每個(gè)單體肽與接頭區(qū)串聯(lián)。較好的是，適當(dāng)?shù)慕宇^序列在多聚體中位于胰島素C肽單體的兩側(cè)，從而確保剪切釋放的胰島素C肽沒有任何接頭區(qū)的殘基。接頭區(qū)可包含1至15個(gè)，例如1至12個(gè)或1至10個(gè)氨基酸殘基，但是這一長度并不重要，可以根據(jù)方便或具體情況進(jìn)行選擇。1至8，例如1、5和7各殘基的接頭區(qū)可能比較適宜。每個(gè)結(jié)構(gòu)中的各接頭區(qū)可以相同也可以不同，但是為方便起見，通常是相同的。所以，例如，對(duì)于胰蛋白酶和羧肽酶B的聯(lián)合剪切，可提供開始或終止于精氨酸殘基的接頭。
另一種接頭包含單個(gè)或作為較長序列一部分的賴氨酸，也可以被胰蛋白酶/羧肽酶B聯(lián)合剪切。
就位于胰島素C肽單體之間而言，這樣的接頭最好開始于和終止于例如N末端和C末端的精氨酸殘基這類剪切位置，從而確保釋放的胰島素C肽不含任何其它氨基酸。就位于融合伴侶與胰島素C肽多聚體末端之間或位于胰島素C肽多聚體末端而言，可以在接頭的合適末端(或位于適合剪切的相應(yīng)位置，這取決于確切的接頭序列和所用的剪切酶)具有單獨(dú)一個(gè)剪切位點(diǎn)(例如Arg)。
代表性接頭區(qū)實(shí)例包括位于C肽單體之間的-RTASQAR-(SEQ ID NO2)，位于融合伴侶與C肽多聚體之間的-ASQAR-(SEQ ID NO3)和位于多聚體末端的-RTASQAVD(SEQ ID NO4)。
如上所述，可用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法引入接頭序列。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容是包含編碼胰島素C肽的核苷酸序列多份拷貝的核酸分子，所述的核酸分子編碼多聚多肽，后者可經(jīng)剪切而得到所述胰島素C肽的單拷貝。
從另一方面看，本發(fā)明這方面的內(nèi)容可看成是提供了一種包含編碼胰島素C肽的核苷酸序列串聯(lián)體的核酸分子。
上文和后文所述的本發(fā)明各方面內(nèi)容包括這樣的實(shí)施例其中，多聚多肽(基因產(chǎn)物)沒有胰島素A肽和B肽；或者，其中的核酸分子不編碼胰島素A肽和B肽。更具體地說，在這樣的實(shí)施例中，多聚多肽中，或核酸分子所編碼的胰島素C肽的拷貝數(shù)是二，多聚多肽不包含或核酸分子不編碼胰島素A肽和B肽。
在本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，核酸分子還包含一段編碼融合伴侶的核苷酸序列，這有助于進(jìn)一步加工所編碼的多聚多肽，例如用于純化所表達(dá)的蛋白產(chǎn)物。編碼融合伴侶的基因?qū)⑽挥谡_的位置和方向以便與胰島素C肽的多份拷貝一同表達(dá)，形成最初的、單個(gè)融合肽。合適的融合蛋白參見前文。
較好的是，核酸分子還包含一段或多段編碼接頭區(qū)的核苷酸序列，所述的接頭區(qū)如前所述含有剪切位點(diǎn)。
作為本發(fā)明的核酸分子，可以是例如編碼結(jié)構(gòu)式(I)多肽的那些。
H2N-A-(C-X)n-COOH (I)其中，C是胰島素C肽；A是一個(gè)鍵或基團(tuán)F，F(xiàn)是融合伴侶，或基團(tuán)-(F-X)-；X是包含至少一個(gè)剪切位置的接頭區(qū)，各X相同或不同；
n是整數(shù)2至50。
本發(fā)明這方面的內(nèi)容包括這樣一個(gè)實(shí)施例，其中，結(jié)構(gòu)式(I)的條件是n＝2，所述的多肽(I)不含胰島素A鏈和B鏈。
胰島素C肽(基團(tuán)C)，融合伴侶(基團(tuán)F)和接頭區(qū)(基團(tuán)X)的定義如前所述。同樣，n的定義可參見前文有關(guān)“多”或“多聚”所述。
本發(fā)明所用的核酸分子或基因結(jié)構(gòu)宜包含一段調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的合適的調(diào)控序列。這樣的調(diào)控或表達(dá)調(diào)控序列包括例如以匹配讀碼框形式與編碼序列連接的轉(zhuǎn)錄(例如啟動(dòng)子-操縱子區(qū)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，末端終止序列，增強(qiáng)元件等)和翻譯(例如起始和終止密碼子)調(diào)控元件。
任何合適的宿主細(xì)胞均可使用，包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，可根據(jù)所選的表達(dá)系統(tǒng)(例如細(xì)菌、酵母、(例如帶有桿狀病毒的)昆蟲或哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng))來選擇。許多表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，在文獻(xiàn)中多有記載。例如，大腸桿菌可用作生產(chǎn)肽的宿主細(xì)胞，此時(shí)，調(diào)控序列包含例如大腸桿菌trp啟動(dòng)子。其它合適的宿主包括除大腸桿菌之外的革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽性菌，酵母，昆蟲，植物或動(dòng)物細(xì)胞(例如，一般是基因工程細(xì)胞系)。
包含上述核酸分子的表達(dá)載體構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。
任何常用載體都可用來進(jìn)行本發(fā)明方法的表達(dá)，許多是本領(lǐng)域已知的并在文獻(xiàn)中多有記載。合適的載體包括質(zhì)粒，粘?；蚧诓《镜妮d體。但是，這些被引入宿主進(jìn)行表達(dá)的載體最好是質(zhì)粒，噬菌體或病毒載體。這些載體可包含以匹配讀碼框形式與本發(fā)明核酸分子連接的合適的調(diào)控序列。根據(jù)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，還可以包含其它基因元件，例如復(fù)制子，協(xié)助或促進(jìn)載體向宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，穩(wěn)化功能(例如協(xié)助載體在宿主細(xì)胞內(nèi)維持)的序列，克隆位置，限制性核酸內(nèi)切酶剪切位點(diǎn)或編碼標(biāo)記的序列。載體在宿主細(xì)胞內(nèi)可以是游離體，或者，如果是質(zhì)?；蚱渌迦胄暂d體，則插入宿主細(xì)胞的染色體。整合到宿主染色體內(nèi)可能是隨機(jī)、非特異性的，但是以特異性同源整合為佳。這方面的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(參見，例如，Pozzi等，(1992)J.Res.Microbiol.143，449-457和(1996)Gene 169，85-90)。整合為“同源”是因?yàn)橘|(zhì)粒插入載體具有一段宿主細(xì)胞染色體DNA節(jié)段。
適合表達(dá)本發(fā)明基因結(jié)構(gòu)或核酸分子的代表性質(zhì)粒包括pTrpBB(Oberg等，同上)或其衍生物。或者，可以根據(jù)需要修飾所述質(zhì)粒，以去除編碼融合伴侶的序列。任何具有Trp-啟動(dòng)子之類元件的高拷貝載體均可使用。
許多本領(lǐng)域熟知的技術(shù)可用于將上述載體引入原核或真核細(xì)胞進(jìn)行，所述技術(shù)例如細(xì)菌轉(zhuǎn)化技術(shù)，轉(zhuǎn)染，電穿孔。經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的真核或原核細(xì)胞(即含有前述本發(fā)明核酸分子的宿主細(xì)胞)構(gòu)成本發(fā)明的又一方面內(nèi)容。
如實(shí)施例中詳細(xì)說明的那樣，含有本發(fā)明核酸分子的表達(dá)載體，尤其是質(zhì)粒，具有在宿主細(xì)胞內(nèi)遺傳穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)；根據(jù)限制性酶切圖，在由生長到高細(xì)胞密度的培養(yǎng)物制備的質(zhì)粒中，沒有發(fā)現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定性。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供了一種制備編碼多聚多肽的核酸分子的方法，所述的多聚多肽含有多份胰島素C肽拷貝，其中，表達(dá)出的多聚多肽然后可被切割成胰島素C肽單拷貝，該方法包括產(chǎn)生如下核酸分子其中包含以匹配讀碼框形式連接的多份編碼胰島素C肽的核苷酸拷貝。
許多本領(lǐng)域熟知的用來產(chǎn)生基因或基因片段多拷貝的技術(shù)都可用于本發(fā)明方法。例如，可用設(shè)計(jì)好的單鏈非回文突出末端從頭至尾聚合成合成DNA片段。然后，可將聚合DNA片段直接與限制性酶產(chǎn)生的匹配突出端連接(Ljungquist等，(1989)Eur.J.Biochem.186，563-569)。其它基因片段多聚方法以使用Bsp MI(Stahl等，(1990)Gene 89，87-193)或Bsm I(Haydn和Mandecki(1988)DNA 7，571-577)等IIS限制性內(nèi)切酶為基礎(chǔ)。其它方法包括基因結(jié)構(gòu)的聚合和含有限制性位點(diǎn)的接頭分子的連接以允許進(jìn)一步亞克隆(Aslund等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84，1399-1430和Irving等，(1988)Technological Advance in Vaccine Development，A.R.Liss Inc.，New York 97-105)。重新合成基因的方法也是已知的，這涉及使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，適合生成多聚基因片段(Majumder(1992)Gene 110，89-94和Nguyen等，(1994)Advances in Biomagnetic Separation，Eaton Publishing Co.，Natick 73-78)。
在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，純化的基因片段(即編碼胰島素C肽的核苷酸序列)是由所設(shè)計(jì)的非回文突出端從頭至尾聚合而成的，然后連接到用限制性內(nèi)切酶(以Sfi I為宜)消化的質(zhì)粒中。
在一特別優(yōu)選的實(shí)施例中，包含編碼胰島素C肽的核苷酸序列(例如基因片段)的質(zhì)粒經(jīng)消化切下所述的序列或基因片段，并在所述序列或基因片段經(jīng)多聚之后又連接返回到經(jīng)消化的質(zhì)粒中。最好用PCR篩選技術(shù)來篩選轉(zhuǎn)化體(Stahl等，(1933)Biotechniques 14，424-434)，由此擴(kuò)增一份或多份編碼胰島素C肽的節(jié)段?？捎铆傊悄z電泳進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段的比較。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，分離出編碼所需數(shù)量(例如3或7份)串聯(lián)胰島素C肽的基因片段，并連接到用相同于切取胰島素C肽編碼片段所用限制性內(nèi)切酶消化的另一質(zhì)粒中。更好的是，被用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的后一質(zhì)粒還含有合適的啟動(dòng)子和一段編碼胰島素C肽的合適融合伴侶的序列。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容包括上述方法的產(chǎn)物，即胰島素C肽聚合體和所述聚合體經(jīng)剪切產(chǎn)生的單個(gè)胰島素C肽。
具體地說，本發(fā)明的這方面內(nèi)容提供了一種多聚多肽，它包含胰島素C肽的多份拷貝，能夠經(jīng)剪切而釋放出所述胰島素C肽的單拷貝。或者，多聚多肽還可以包含融合伴侶，和/或位于所述胰島素C肽單體兩側(cè)的包含一個(gè)剪切位點(diǎn)的接頭區(qū)。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)多聚多肽的方法，所述的多聚多肽包含胰島素C肽的多份拷貝，能夠經(jīng)剪切而釋放出所述胰島素C肽的單拷貝，該方法包括在允許所述多聚多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞內(nèi)含有編碼所述多聚多肽的核酸分子，回收表達(dá)出的多聚多肽。
可用本領(lǐng)域的已知技術(shù)來培養(yǎng)宿主細(xì)胞，例如分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)。
可用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法由宿主細(xì)胞培養(yǎng)物回收多聚基因產(chǎn)物或多肽，例如標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞裂解法和蛋白質(zhì)純化技術(shù)。如前所述，如果多聚多肽中含有融合伴侶，純化可以基于融合伴侶的親合性方便地實(shí)現(xiàn)。
本領(lǐng)域已知的多種從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)基分離天然表達(dá)或重組表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽的的技術(shù)均可使用。可用本領(lǐng)域已知并在文獻(xiàn)中多有記載的各種方法進(jìn)行細(xì)胞裂解，以釋放胞內(nèi)的蛋白/多肽，而且，根據(jù)使用的方法是分批培養(yǎng)還是連續(xù)培養(yǎng)，如果必要，還可以再進(jìn)行純化，這也是基于本領(lǐng)域的已知技術(shù)。
現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，通過熱處理裂解細(xì)胞并回收多肽對(duì)于本發(fā)明的胰島素C肽多聚多肽特別有效，例如WO90/00200所述的方法以及它的修改形式。這類方法涉及將含細(xì)胞的培養(yǎng)基在例如50-100℃加熱一段時(shí)間，通常不超過1小時(shí)，所表達(dá)的多肽于是以較好的基本純形式釋放到培養(yǎng)基中。這被認(rèn)為是所表達(dá)多肽選擇性釋放的結(jié)果。具體地說，出人意料的是，不論是否重組多肽產(chǎn)物，如果它可溶而且對(duì)熱處理穩(wěn)定，這類方法都有效(該方法因此更為通用)，但是對(duì)本發(fā)明的胰島素C肽多聚多肽特別有效，此時(shí)可以出人意料的高得率獲得高純度產(chǎn)物。所以，例如，這樣的熱處理可以是在例如80-100℃(例如85-99℃或90-95℃)加熱5-20分鐘(例如8-10分鐘)，然后冷卻至0-4℃或在冰上冷卻。
回收多聚多肽之后，可通過其切割釋放出的胰島素C肽單個(gè)單體。所以，本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供了一種生產(chǎn)胰島素C肽的方法，該方法包括剪切上述多聚多肽，釋放所述胰島素C肽的單拷貝。
如上所述剪切多聚多肽獲得C肽單個(gè)單體后，還可以用眾所周知的純化技術(shù)(例如超濾、分子量排阻層析、澄清、反相層析等)進(jìn)一步純化直至(例如)均一(例如經(jīng)SDS-PAGE檢驗(yàn))。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容是上述方法所產(chǎn)生的剪切多肽產(chǎn)物的治療用途。剪切產(chǎn)生的胰島素C肽可用于治療I型糖尿病或糖尿病綜合征。所以，本發(fā)明還包括一種治療I型糖尿病或糖尿病綜合征的方法，它包括給予用上述方法中任一種所制備的胰島素C肽。
通過非限定性實(shí)施例和以下附圖將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的描述，附圖中

圖1是本發(fā)明基因結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)，包括編碼C肽的基因片段的多聚反應(yīng)。
圖2A和B是兩基因產(chǎn)物BB-C3(A)和BB-C7(B)的圖，其中C肽兩側(cè)的接頭區(qū)用單字母代碼表示。每個(gè)C肽兩側(cè)都有精氨酸殘基(粗體)。
圖2C顯示以單字母代碼表示的C肽的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。
圖3是兩融合蛋白BB-C3(泳道1)和BB-C7(泳道2)經(jīng)HAS-瓊脂糖親合性純化后，還原條件下的SDS-PAGE凝膠(10-15％)電泳照片拷貝。泳道M中是分子量分別為94、67、43、30、20和14kDa的標(biāo)記蛋白。
圖4A是BB-C3與胰蛋白酶和羧肽酶B孵育不同時(shí)間后還原條件下的SDS-PAGE凝膠(10-15％)電泳照片拷貝。泳道1顯示未被消耗的融合蛋白，泳道2是經(jīng)5分鐘胰蛋白酶和羧肽酶B處理后的蛋白消化產(chǎn)物。泳道M顯示分子量分別為94、67、43、30、20和14kDa的標(biāo)記蛋白。
圖5分別顯示對(duì)等摩爾量BB-C7(上)和BB-C3(中)胰蛋白酶和羧肽酶B剪切混合物的反相層析(RPC)分析。以購自Sigma的胰島素C肽作為對(duì)照(下)。
圖6是BB-C7融合產(chǎn)物經(jīng)胰蛋白酶(質(zhì)量比5000∶1)和羧肽酶B(質(zhì)量比2000∶1)處理不同時(shí)間后分子量排阻層析(Superdex Peptide，Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)圖的重疊。
圖7顯示由BB-C7處理產(chǎn)生的胰島素C肽(A)與Eli Lilly提供的胰島素C肽(B)或購自Sigma的胰島素C肽(C)進(jìn)行比較的反相層析分析。
圖8顯示包含融合伴侶BB和7份胰島素C肽拷貝的肽產(chǎn)物的單字母氨基酸序列(SEQ ID NO5)。
圖9顯示合成融合蛋白BB-C1(泳道1)，BB-C3(泳道2)和BB-C7(泳道3)在HAS瓊脂糖上親合性純化后的SDS-10-15％PAGE分析。分子量以kDa表示。
圖10分別是等摩爾量BB-C1，BB-C3和BB-C7的胰蛋白酶+羧肽酶B剪切混合物的RPC分析。以購得的C肽標(biāo)準(zhǔn)物(Sigma)作為對(duì)照(圖底)。
圖11顯示pTrpBB-C7質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)培養(yǎng)0(泳道1)、7(泳道2)、27(泳道3)或31(泳道4)小時(shí)后KpnI-PsntI限制性酶切的瓊脂糖凝膠(1％)電泳分析。泳道5顯示最初轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞的原pTrpBB-C7質(zhì)粒的KpnI-PsntI限制性酶切，泳道6是培養(yǎng)31小時(shí)后未被剪切的pTrpBB-C7。標(biāo)記物泳道(M)含有PstI限制性酶切的λ噬菌體DNA。箭頭指示C7片段的位置。
圖12顯示BB-C7培養(yǎng)樣品的SDS-PAGE分析(還原條件下)。泳道12μl未處理培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。泳道20.5μl超聲波處理的培養(yǎng)物。泳道30.5μl熱處理培養(yǎng)物后的培養(yǎng)基。箭頭指示BB-C7融合蛋白的位置。泳道M顯示分子量為94、67、43、30、20和14kDa的標(biāo)記蛋白。
實(shí)施例1-DNA結(jié)構(gòu)的制備將以下4條合成寡核苷酸磷酸化，并通過70℃孵育10分鐘退火配對(duì)(Jope10Jope12和Jope11Jope13)，然后冷卻至室溫Jope10CGGCCTCCCAGGCCCGCGAAGCTGAGGACCTGCAAGTTGGTCAGGTTGAACTGGGCGGTGGCCCGGGTGCAGGC(SEQ ID NO6)，Jope11TCTTTGCAGCCGCTGGCTTTAGAAGGTTCTCTTCAGCGTACGGCCTCCCAGGCCGTCGACTAACTGCA(SEQ ID NO7)，Jope12CATGGCCGGAGGGTCCGGGCGCTTCGACTCCTGGACGTTCAACCAGTCCAACTTGACCCGCCACCGGG(SEQ ID NO8)和Jope13CCCACGTCCGAGAAACGTCGGCGACCGAAATCTTCCAAGAGAAGTCGCATGCCGGAGGGTCCGGCAGCTGATTG(SEQ ID NO9)。將創(chuàng)制的接頭混合，并與KpnI-PstI消化的質(zhì)粒pUC18連接(Yanish-Perron等，1985，Gene 33，103-106)(圖1)，用連接混合物轉(zhuǎn)化dcm-大腸桿菌GM31(Marinus，(1973)Mol.Gen.Menet.127，47-55)。用基于PCR的固相DNA測(cè)序(Hultman等，(1989)Nucl.Acids Res.17，4937-4946)鑒定出含有插入胰島素C肽編碼基因片段正確核苷酸序列的轉(zhuǎn)化體(PUC-C1)。由pUC-C1制備質(zhì)粒DNA，用SfiI限制性酶切，用Mermaid試劑盒(glass-milk)(BIO 101 Inc.，CA，USA)或GeneClean-試劑盒(BIO 101 Inc.，CA，USA)分別純化切下的胰島素C肽編碼基因片段和載體部分。
利用人工設(shè)計(jì)的非回文突出序列從頭至尾聚合純化的胰島素C肽基因片段，然后連接返回SfiI消化的質(zhì)粒中。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌RRIΔM15細(xì)胞(Ruther，(1982)Nucl.Acid.Res.10，5765-5772)，用PCR篩選技術(shù)(Stall等，(1993)同上)篩選轉(zhuǎn)化體。簡而言之，將單個(gè)集落挑取到含有50μlPCR反應(yīng)混合物(20mMTAPS，pH9.3，20℃，2mM MgCl2，50mM KCl，0.1％Tween-20，0.2mM dTMP，6pmol引物(RIT27GCTTCCGGCTCGTATGTGTG(SEQ ID NO10)和RIT28AAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCG(SEQ ID NO11))和1.0單位Taq聚合酶)的PCR管中。兩PCR引物RIT27和RIT28具有pUC18內(nèi)位于胰島素C肽片段插入點(diǎn)兩側(cè)的退火位點(diǎn)。由集落經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的片段具有不同數(shù)量的插入寡核苷酸，以pUC18作為參照用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行比較，鑒定出帶有1至7份插入片段的轉(zhuǎn)化體。所得的質(zhì)粒因此稱為pUC-C1，pUC-C2等。
制備質(zhì)粒，用KpnI-PstI消化切下含有所需數(shù)量插入片段的基因片段。分別分離出編碼1個(gè)，3個(gè)或7個(gè)串聯(lián)胰島素C肽的基因片段，并與同樣消化的pTrpBBT1T2連接，所得的質(zhì)粒分別稱為pTrpBB-C1，pTrpBB-C3和pTrpBB-C7。質(zhì)粒pTrpBBT1T2是通過在質(zhì)粒pTrpBB(Oberg等，(1994)Proc.6thEur.CongressBiotechnol；Elsevier science B.V.179-182)中插入質(zhì)粒pKK223-3(PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)的轉(zhuǎn)錄終止序列構(gòu)建而成的。轉(zhuǎn)錄終止序列是用標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增方案(Hultman等，1989，同上)和寡核苷酸HEAN-19CCCCCTGCAGCTCGAGCGCCTTTAACCTGTTTTGGCGGATG(SEQ ID NO12)和HEAN-20CCCCAAGCTTAGAGTTTGTAGAAACGC(SEQ ID NO13)由pKK223-3獲得的。
由PCR引入的限制性位點(diǎn)用PstI和HindIII消化，然后插入預(yù)先已用相同酶消化過的pTrpBB。所得的表達(dá)載體pTrpBBT1T2編碼一個(gè)親合柄(affinityhandle)，它包含trp操縱子的前導(dǎo)序列(8氨基酸)和鏈球菌蛋白G的血清白蛋白結(jié)合區(qū)BB(25kDa)(Nygren等，(1988)，同上)。轉(zhuǎn)錄受大腸桿菌trp啟動(dòng)子的調(diào)控。此外，質(zhì)粒帶有卡那霉素抗性基因。實(shí)施例2-蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化分別含有編碼融合蛋白BB-C3和BB-C7的pTrpBB-C3和pTrpBB-C7的大腸桿菌細(xì)胞在10ml含有補(bǔ)充了酵母提取物(Difco)(5g/l)和一硫酸卡那霉素(50mg/l)的胰朊酶大豆培養(yǎng)液(Difco USA)(30g/l)的搖瓶中37℃培養(yǎng)通宵。將通宵培養(yǎng)物稀釋10倍成為100ml，加入含有相同培養(yǎng)基的帶攪拌搖瓶中于37℃培養(yǎng)。在對(duì)數(shù)期中期(A600nm≈1)，加25mg/l β-吲哚丙烯酸誘導(dǎo)基因表達(dá)。誘導(dǎo)后20小時(shí)，6000g離心10分鐘收獲細(xì)胞。以20倍培養(yǎng)體積將細(xì)胞重懸于TST(50mM Tris-HCl pH8.0，200mM NaCl，0.05％Tween20，1mM EDTA)，超聲波裂解，40,000g離心。離心沉淀搖瓶培養(yǎng)物，然后將細(xì)胞重懸于30ml冷TST緩沖液中，由此制成用于超聲波處理的樣品。在Sonics and Materials Inc.(Danbury，Connecticut，USA)的振動(dòng)架上(500W)，用13mm標(biāo)準(zhǔn)傾角(horn tip)，70％負(fù)載周期(20kHz)，并將輸出控制設(shè)定為6.5，進(jìn)行2分鐘脈沖超聲波處理。過濾含有可溶胞質(zhì)蛋白的上清液，用TST稀釋至100ml。如Stahl等在(1989)J.Immunol.Meth.124，43-52中所述，在人血清白蛋白(HAS)-瓊脂糖(Nygren等(1988)同上)上通過親合層析分離可溶融合蛋白。測(cè)定280nm處的吸光度，檢測(cè)洗脫流份，冷凍干燥相關(guān)流份。
圖3顯示經(jīng)一步HSA-瓊脂糖上親合性純化后的BB-C3和BB-C7。為主的是兩種融合蛋白的全長產(chǎn)物，而且它們的遷移都符合它們的分子量；分別為39.1和54.2kDa。兩種融合蛋白的搖瓶培養(yǎng)表達(dá)水平幾乎相當(dāng)；BB-C3為130mg/l，BB-C7為120mg/l。實(shí)施例3-融合蛋白的蛋白酶水解消化長久以來都用從C末端剪切堿性氨基酸殘基的胰蛋白酶剪切融合蛋白。雖然已知其特異性較低，但是胰蛋白酶經(jīng)證明能夠特異性剪切融合蛋白，留下位于未剪切折疊蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)的堿性殘基(Wang等，(1989)J.Biol.Chem.264，21116-21121)。胰蛋白酶的優(yōu)點(diǎn)還在于價(jià)廉和易得。在此，我們將胰蛋白酶與羧肽酶B聯(lián)用來處理BB-C3和BB-C7，以獲得天然人胰島素C肽。這樣，用胰蛋白酶消化后，胰蛋白酶將從C末端開始在每個(gè)胰島素C肽的精氨酸殘基處切斷融合蛋白。
為了分析處理效率，兩種融合蛋白BB-C3和BB-C7與胰蛋白酶和羧肽酶B孵育不同的時(shí)間，并進(jìn)行SDS/PAGE分析。發(fā)現(xiàn)，對(duì)兩種融合蛋白的處理都很迅速，5分鐘的處理后，SDS/PAGE分析顯示不再有融合蛋白。(圖4A和B)。
此外，還在剪切融合蛋白BB-C3和BB-C7之后比較了胰島素C肽單體相對(duì)得率。用胰蛋白酶和羧肽酶B處理等摩爾的BB-C3和BB-C7，然后用反相HPLC(250mm，Kromasil C8層析柱，4.6mm內(nèi)徑，7μm粒徑，Hewlett Packard 1090)分析剪切混合物。用含0.1％三氟乙酸的10-40％乙腈梯度洗脫，40℃，30分鐘。如圖5所示，與剪切BB-C3融合蛋白相比，剪切BB-C7得到的胰島素C肽產(chǎn)物(洗脫時(shí)間約為25.4分鐘)與其它剪切產(chǎn)物(來自BB融合伴侶)之比明顯更高。胰島素C肽峰面積積分得峰面積之比為2.43，接近理論值2.33。
由此并不能得知融合蛋白何時(shí)被完 全處理。為了確定胰蛋白酶-羧肽酶B處理何時(shí)達(dá)到完全，對(duì)融合蛋白BB-C7進(jìn)行不同時(shí)間的酶處理。將冷凍干燥的融合蛋白BB-C7溶于含0.1(體積)％Tween20的100mM磷酸鹽緩沖液，pH7.5中，蛋白質(zhì)濃度為1mg/ml，加入胰蛋白酶(T-2395，Sigma，St.Louis，MO，USA)和羧肽酶B(Boehringer Mannheim)，分別使胰蛋白酶/融合蛋白之比為1/5000(質(zhì)量比)，羧肽酶B/融合蛋白之比為1/2000(質(zhì)量比)。在15，30，60和120分鐘后，從剪切混合物中采集樣品，并通過加HAc將pH降低至3以終止反應(yīng)。為了穩(wěn)定剪切產(chǎn)物，加入20(體積)％乙腈。
用分子量排阻層析(Superdex Peptide柱，SMARTTM系統(tǒng)，Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)分析剪切物質(zhì)，并將層析圖重疊(圖6)，可得出結(jié)論，在上述條件下，60分鐘后，BB-C7被處理完全，因?yàn)檠娱L孵育時(shí)間不再增加胰島素C肽。以上結(jié)果還顯示，可以由包含多聚形式胰島素C肽的融合蛋白獲得一定量的胰島素C肽。實(shí)施例4-所得胰島素C肽的描述反相層析(RPC)和質(zhì)譜為了證實(shí)所得的肽的確是天然人胰島素C肽，進(jìn)行了兩種不同的分析。首先，用反相層析(RPC)比較RPC純化的處理BB-C7所到胰島素C肽和胰島素C肽標(biāo)準(zhǔn)物，所述的標(biāo)準(zhǔn)物是Eli Lilly(CA，USA)提供的C肽和市售的胰島素C肽片段3-33(購自Sigma，USA)。在Sephasil C8 5μm SC2.1/10柱上，用SMARTTM系統(tǒng)(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)進(jìn)行胰島素C肽制劑的RPC分析。用含0.1(體積)％三氟乙酸的26-36％乙腈梯度在25℃進(jìn)行20分鐘洗脫。流速為100μl/min，測(cè)定240nm處的吸光度?？梢缘贸鼋Y(jié)論三種制劑基本相同，因?yàn)槎季哂邢嗤臏魰r(shí)間和同樣低的雜質(zhì)含量(圖7)。第二，對(duì)由BB-C7獲得的胰島素C肽進(jìn)行質(zhì)譜分析(表1)。用配備電子噴射單元的JEOL SX102質(zhì)譜儀(JEOLJapan)測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和在比較性RPC分析中所觀察到的與胰島素C肽標(biāo)準(zhǔn)物的相似性一樣，分子量非常一致(表1)，這說明獲得的是天然人胰島素C肽。表1.胰島素C肽的分子量(Da)計(jì)算值 3020.3實(shí)驗(yàn)值 3019.7±1.8實(shí)施例5-所得胰島素C肽單體的描述放射性免疫測(cè)試(RIA)用用于檢測(cè)(例如)血液和尿液中人胰島素C肽含量的市售放射性免疫試驗(yàn)(Euro-Diagnosia，Malmo，Sweden；cat.no.MD315)分析剪切融合蛋白BB-C7所得的胰島素C肽單體。為了進(jìn)行比較，還對(duì)已知具有生物活性的(Johansson等，(1992)Diabetologia 351151-1158)胰島素C肽制劑(Eli Lilly Co.，Indianapolis，Ind，USA)進(jìn)行了分析。將兩種C肽制劑稀釋于0.05M磷酸鈉緩沖液，pH7.4，5％人血清白蛋白(HSA)和0.02％Thimreosal，最終濃度分別為3.31和3.30nmol/l，然后稱重，由此制備分析樣品。簡而言之，試驗(yàn)用到兔抗人C肽抗血清，125I-人胰島素C肽示蹤劑，山羊抗兔Ig抗血清-PEG試劑，人胰島素C肽標(biāo)準(zhǔn)物和對(duì)照樣品，用于在建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后確定樣品中人胰島素C肽的量。兩份樣品的分析結(jié)果概括于表2。結(jié)果顯示，兩種制劑被RIA試驗(yàn)同等地識(shí)別和定量。表2.比較性RIA分析已知具有生物活性的胰島素C肽和剪切重組融合蛋白BB-C7獲得的胰島素C肽樣品估計(jì)濃度(nM) 測(cè)得濃度(nM)胰島素C肽(剪切融合蛋 2.34(71％) 3.31白BB-C7所得)胰島素C肽(購自Eli- 2.41(73％) 3.30Lilly)實(shí)施例6-融合蛋白BB-C1、BB-C3和BB-C7的表達(dá)、純化和蛋白酶水解本實(shí)施例進(jìn)一步提供實(shí)施例2和3中實(shí)驗(yàn)有關(guān)BB-C1融合蛋白的比較結(jié)果。
培養(yǎng)分別含有質(zhì)粒pTrpBB-C1，pTrpBB-C3和pTrpBB-C7的大腸桿菌(實(shí)施例1)，如實(shí)施例2所述表達(dá)，收獲，純化和分析融合蛋白。
分析pTrpBB-C1，pTrpBB-C3或pTrpBB-C7轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞顯示，所編碼的融合蛋白BB-C1，BB-C3和BB-C7胞內(nèi)積累，是可溶性基因產(chǎn)物(未有數(shù)據(jù))。裂解細(xì)胞后，HSA親合性層析有效的純化了產(chǎn)生的融合蛋白。圖9顯示經(jīng)一步HSA-瓊脂糖親合性純化后的BB-C1，BB-C3和BB-C7。為主的都是三種融合蛋白的全長產(chǎn)物，它們的遷移符合它們的分子量；分子量分別為31.5，39.1和54.2kDa。搖瓶培養(yǎng)物的表達(dá)水平可以再現(xiàn)，而且三種不同融合蛋白水平相當(dāng)，都在40-60mg/l范圍內(nèi)。
為了檢測(cè)處理三種親合性純化的融合蛋白的效率，BB-C1，BB-C3和BB-C7與胰蛋白酶和羧肽酶B孵育不同的時(shí)間，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。三種融合蛋白都被迅速處理5分鐘后，SDS-PAGE檢測(cè)無全長融合蛋白殘留(未有數(shù)據(jù))。
進(jìn)一步如實(shí)施例3所述測(cè)定蛋白酶水解處理的效率，發(fā)現(xiàn)，60分鐘后，BB-C7被剪切完全。
為了更充分地比較BB-C1，BB-C3和BB-C7融合蛋白經(jīng)剪切后胰島素C肽單體的相對(duì)得率，進(jìn)行反相HPLC分析(如實(shí)施例3所述)。分析的是等摩爾BB-C1，BB-C3和BB-C7經(jīng)胰蛋白酶+羧肽酶B處理120分鐘后的剪切混合物。測(cè)定A220nm。結(jié)果顯示(圖10)，與剪切BB-C1融合蛋白相比，BB-C3和BB-C7融合蛋白的C肽產(chǎn)物與其它剪切產(chǎn)物之比明顯更高。大致等摩爾量的各種融合蛋白上樣在RPC柱上，這可以由三張層析圖中胰蛋白酶消化產(chǎn)生的BB-標(biāo)簽產(chǎn)生的相等峰高來證明(圖10)。C肽峰面積積分的結(jié)果為C3∶C1為2.5，C7∶C1為6.0，分別接近理論值3和7。
以上結(jié)果進(jìn)一步表明，與單融合蛋白(C1)相比，胰島素C肽多聚體(C3，C7)產(chǎn)生胰島素C肽單體的得率提高了。實(shí)施例7-編碼BB-C7融合蛋白的質(zhì)粒pTrpBB-C7的遺傳穩(wěn)定性研究該實(shí)施例說明如何評(píng)價(jià)編碼BB-C7融合蛋白的質(zhì)粒pTrpBB-C7的遺傳穩(wěn)定性。含質(zhì)粒pTrpBB-C7的大腸桿菌培養(yǎng)不同的時(shí)間，在培養(yǎng)0，7，27和31小時(shí)時(shí)取樣。31小時(shí)類似于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)BB-C7的培養(yǎng)時(shí)間。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從樣品中回收質(zhì)粒(Sambrook等，A Laboratory Mannul，2th版，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)。對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行KpnI-PstI限制性酶切，以切取編碼C7串的片段(見圖1)。用于最初轉(zhuǎn)化大腸桿菌的原pTrpBB-C7質(zhì)粒被作為對(duì)照，因此也接受KpnI-PstI限制性酶切。如圖11所示，所有樣品的限制性酶切片段大小都相同，這證明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，質(zhì)粒pTrpBB-C7是遺傳穩(wěn)定的。實(shí)施例8-為BB-C7選擇性釋放進(jìn)入培養(yǎng)基的熱處理該實(shí)施例說明BB-C7融合蛋白如何經(jīng)熱處理而選擇性釋放到培養(yǎng)基中，并由此顯著提高用于進(jìn)一步純化BB-C7的起始物的純度。背景與釋放大腸桿菌胞內(nèi)產(chǎn)生的重組蛋白最常用的方法(包括離心，將細(xì)胞沉淀重懸于合適的緩沖液和用高壓均質(zhì)化裂解細(xì)胞等操作單元)相比，熱處理釋放基因產(chǎn)物具有許多優(yōu)點(diǎn)(i)包括熱處理的生產(chǎn)流程減少了一步；(ii)因?yàn)樗拗骷?xì)胞的蛋白酶被熱變性，提高了基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性；(iii)通過沉淀其它大腸桿菌蛋白，初步純化了大部分基因產(chǎn)物，和(iv)與全細(xì)胞裂解相比，核酸釋放減少。該方法也適用于釋放其它胞內(nèi)表達(dá)的重組蛋白，這樣的蛋白必須可溶，表達(dá)水平高，而且對(duì)于釋放蛋白所需的熱處理穩(wěn)定。
如實(shí)施例2所述培養(yǎng)含有編碼BB-C7的質(zhì)粒pTrpBB-C7的大腸桿菌。與所述超聲波裂解細(xì)胞(實(shí)施例2)不同的是，用一步熱處理選擇性地、有效地使BB-C7釋放到培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，將培養(yǎng)物浸沒在水中，將水煮沸8-10分鐘。此時(shí)，培養(yǎng)物的溫度達(dá)到約90℃。然后將搖瓶置于冰上。如圖12(泳道3)所示，在此溫度，BB-C7融合蛋白釋放進(jìn)入培養(yǎng)基，但基本上沒有宿主細(xì)胞蛋白釋放。宿主蛋白很可能被該處理完全變性。相反，超聲波處理(圖12，泳道2)和其他裂解細(xì)胞的機(jī)械法釋放全部宿主蛋白和核酸，使得進(jìn)一步純化BB-C7的起始物非常混雜。大腸桿菌正常分泌的蛋白很少(圖12，泳道1)。BB-C7被發(fā)現(xiàn)對(duì)熱穩(wěn)定，可以進(jìn)一步如實(shí)施例1-3所述純化和處理，以釋放C肽單體。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱Creative Peptides Sweden AB(B)街道Dahlbergsstigen 6(C)城市Djursholm(E)國家瑞典(F)郵編S-182 64(i)申請(qǐng)人(A)名稱Stefan Stahl(B)街道c/o Royal Institute of Technology(C)城市Stockholm(E)國家瑞典(F)郵編S-100 44(i)申請(qǐng)人(A)名稱Mathias Uhlen(B)街道c/o Royal Institute of Technology(C)城市Stockholm(E)國家瑞典(F)郵編S-100 44(i)申請(qǐng)人(A)名稱Per-Ake Nygren(B)街道c/o Royal Institute of Technology(C)城市Stockholm(E)國家瑞典(F)郵編S-100 44(i)申請(qǐng)人(A)名稱Per Jonasson(B)街道c/o Royal Institute of Technology(C)城市Stockholm(E)國家瑞典(F)郵編S-100 44(ii)發(fā)明名稱胰島素C肽的重組表達(dá)
(iii)序列數(shù)14(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度31氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro15 10 15Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln20 25 30(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度7氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Arg Thr Ala Ser Gln Ala Arg1 5(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Ala Ser Gln Ala Arg15(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度8氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO4Arg Thr Ala Ser Gln Ala Val Asp15(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度521氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp1 5 10 15Ala Asn Phe Asp Gln Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys20 25 30Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln35 40 45Ala Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr50 55 60Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr65 70 75 80Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu85 90 95Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn Leu Ile Asn Asn100 105 110Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu115 120 125Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp130 135 140Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu145 150 155 160Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly165 170 175Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu180 185 190Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr195 200 205Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr210 215 220Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Arg Ser Phe Asn Phe Pro225 230 235 240Ile Leu Glu Asn Ser Ser Ser Val Pro Ala Ser Gln Ala Arg Glu Ala245 250 255Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala260 265 270Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Arg Thr Ala275 280 285
Ser Gln Ala Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu290 295 300Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly305 310 315 320Ser Leu Gln Arg Thr Ala Ser Gln Ala Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln325 330 335Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln340 345 350Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Arg Thr Ala Ser Gln Ala Arg355 360 365Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro370 375 380Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Arg385 390 395 400Thr Ala Ser Gln Ala Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val405 410 415Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu420 425 430Glu Gly Ser Leu Gln Arg Thr Ala Ser Gln Ala Arg Glu Ala Glu Asp435 440 445Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser450 455 460Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Arg Thr Ala Ser Gln465 470 475 480Ala Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly485 490 495Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu500 505 510Gln Arg Thr Ala Ser Gln Ala Val Asp515 520(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度74堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型其它核酸
(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO6CGGCCTCCCA GGCCCGCGAA GCTGAGGACC TGCAAGTTGG TCAGGTTGAA CTGGGCGGTG 60GCCCGGGTGC AGGC74(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度68堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO7TCTTTGCAGC CGCTGGCTTT AGAAGGTTCT CTTCAGCGTA CGGCCTCCCA GGCCGTCGAC 60TAACTGCA 68(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度68堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO8CATGGCCGGA GGGTCCGGGC GCTTCGACTC CTGGACGTTC AACCAGTCCA ACTTGACCCG 60CCACCGGG 68
(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度74堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO9CCCACGTCCG AGAAACGTCG GCGACCGAAA TCTTCCAAGA GAAGTCGCAT GCCGGAGGGT 60CCGGCAGCTG ATTG 74(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO10GCTTCCGGCT CGTATGTGTG 20(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度23堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性
(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO11AAAGGGGGAT GTGCTGCAAG GCG 23(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO12CCCCCTGCAG CTCGAGCGCC TTTAACCTGT TTTGGCGGAT G 41(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度27堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO13CCCCAAGCTT AGAGTTTGTA GAAACGC 27(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征
(A)長度4646堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝″載體″(xi)序列描述SEQ ID NO14GCGGCCGCTA ATTCATGCTG TGGTGTCATG GTCGGTGATC GCCAGGGTGC CGACGCGCAT 60CTCGACTGCA CGGTGCACCA ATGCTTCTGG CGTCAGGCAG CCAATCGGAA GCTGTGGTAT 120GGCTGTGCAG GTCGTAAATC ACTGCATAAT TCGTGTCGCT CAAGGCGCAC TCCCGTTCTG 180GATAATGTTT TTTGCGCCGA CATCATAACG GTTCTGGCAA ATATTCTGAA ATGAGCTGTT 240GACAATTAAT CATCGAACTA GTTAACTAGT ACGCAAGTTC ACGTAAAAAG GGTATCTAGA 300ATTATGAAAG CAATTTTCGT ACTGAATGCG CAACACGATG AAGCCGTAGA CGCGAATTTC 360GACCAATTCA ACAAATATGG AGTAAGTGAC TATTACAAGA ATCTAATCAA CAATGCCAAA 420ACTGTTGAAG GCGTAAAAGA CCTTCAAGCA CAAGTTGTTG AATCAGCGAA GAAAGCGCGT 480ATTTCAGAAG CAACAGATGG CTTATCTGAT TTCTTGAAAT CACAAACACC TGCTGAAGAT 540ACTGTTAAAT CAATTGAATT AGCTGAAGCT AAAGTCTTAG CTAACAGAGA ACTTGACAAA 600TATGGAGTAA GTGACTATCA CAAGAACCTA ATCAACAATG CCAAAACTGT TGAAGGTGTA 660AAAGACCTTC AAGCACAAGT TGTTGAATCA GCGAAGAAAG CGCGTATTTC AGAAGCAACA 720GATGGCTTAT CTGATTTCTT GAAATCACAA ACACCTGCTG AAGATACTGT TAAATCAATT 780GAATTAGCTG AAGCTAAAGT CTTAGCTAAC AGAGAACTTG ACAAATATGG AGTAAGTGAC 840TATTACAAGA ACCTAATCAA CAATGCCAAA ACTGTTGAAG GTGTAAAAGC ACTGATAGAT 900GAAATTTTAG CTGCATTACC TAAGACTGAC ACTTACAAAT TAATCCTTAA TGGTAAAACA 960TTGAAAGGCG AAACAACTAC TGAAGCTGTT GATGCTGCTA CTGCAAGATC TTTCAATTTC1020CCTATCCTCG AGAATTCGAG CTCGGTACCG GCCTCCCAGG CCCGCGAAGC TGAGGACCTG1080CAAGTTGGTC AGGTTGAACT GGGCGGTGGC CCGGGTGCAG GCTCTTTGCA GCCGCTGGCT1140TTAGAAGGTT CTCTTCAGCG TACGGCCTCC CAGGCCCGCG AAGCTGAGGA CCTGCAAGTT1200GGTCAGGTTG AACTGGGCGG TGGCCCGGGT GCAGGCTCTT TGCAGCCGCT GGCTTTAGAA1260GGTTCTCTTC AGCGTACGGC CTCCCAGGCC CGCGAAGCTG AGGACCTGCA AGTTGGTCAG1320GTTGAACTGG GCGGTGGCCC GGGTGCAGGC TCTTTGCAGC CGCTGGCTTT AGAAGGTTCT1380CTTCAGCGTA CGGCCTCCCA GGCCCGCGAA GCTGAGGACC TGCAAGTTGG TCAGGTTGAA1440CTGGGCGGTG GCCCGGGTGC AGGCTCTTTG CAGCCGCTGG CTTTAGAAGG TTCTCTTCAG1500CGTACGGCCT CCCAGGCCCG CGAAGCTGAG GACCTGCAAG TTGGTCAGGT TGAACTGGGC1560GGTGGCCCGG GTGCAGGCTC TTTGCAGCCG CTGGCTTTAG AAGGTTCTCT TCAGCGTACG1620GCCTCCCAGG CCCGCGAAGC TGAGGACCTG CAAGTTGGTC AGGTTGAACT GGGCGGTGGC1680CCGGGTGCAG GCTCTTTGCA GCCGCTGGCT TTAGAAGGTT CTCTTCAGCG TACGGCCTCC1740CAGGCCCGCG AAGCTGAGGA CCTGCAAGTT GGTCAGGTTG AACTGGGCGG TGGCCCGGGT1800GCAGGCTCTT TGCAGCCGCT GGCTTTAGAA GGTTCTCTTC AGCGTACGGC CTCCCAGGCC 1860GTCGACTAAC TGCAGCTCGA GCGCTTAACT GTTTTGGCGG ATGAGAGAAG ATTTTCAGCC 1920TGATACAGAT TAAATCAGAA CGCAGAAGCG GTCTGATAAA ACAGAATTTG CCTGGCGGCA 1980GTAGCGCGGT GGTCCCACCT GACCCCATGC CGAACTCAGA AGTGAAACGC CGTAGCGCCG 2040ATGGTAGTGT GGGGTCTCCC CATGCGAGAG TAGGGAACTG CCAGGCATCA AATAAAACGA 2100AAGGCTCAGT CGAAAGACTG GGCCTTTCGT TTTATCTGTT GTTTGTCGGT GAACGCTCTC 2160CTGAGTAGGA CAAATCCGCC GGGAGCGGAT TTGAACGTTG CGAAGCAACG GCCCGGAGGG 2220TGGCGGGCAG GACGCCCGCC ATAAACTGCC AGGCATCAAA TTAAGCAGAA GGCCATCCTG 2280ACGGATGGCC TTTTTGCGTT TCTACAAACT CTAAGCTTTG GTGCAGGGGG GGGGGGGAAA 2340GCCACGTTGT GTCTCAAAAT CTCTGATGTT ACATTGCACA AGATAAAAAT ATATCATCAT 2400GAACAATAAA ACTGTCTGCT TACATAAACA GTAATACAAG GGGTGTTATG AGCCATATTC 2460AACGGGAAAC GTCTTGCTCG AGGCCGCGAT TAAATTCCAA CATGGATGCT GATTTATATG 2520GGTATAAATG GGCTCGCGAT AATGTCGGGC AATCAGGTGC GACAATCTAT CGATTGTATG 2580GGAAGCCCGA TGCGCCAGAG TTGTTTCTGA AACATGGCAA AGGTAGCGTT GCCAATGATG 2640TTACAGATGA GATGGTCAGA CTAAACTGGC TGACGGAATT TATGCCTCTT CCGACCATCA 2700AGCATTTTAT CCGTACTCCT GATGATGCAT GGTTACTCAC CACTGCGATC CCCGGGAAAA 2760CAGCATTCCA GGTATTAGAA GAATATCCTG ATTCAGGTGA AAATATTGTT GATGCGCTGG 2820CAGTGTTCCT GCGCCGGTTG CATTCGATTC CTGTTTGTAA TTGTCCTTTT AACAGCGATC 2880GCGTATTTCG TCTCGCTCAG GCGCAATCAC GAATGAATAA CGGTTTGGTT GATGCGAGTG 2940ATTTTGATGA CGAGCGTAAT GGCTGGCCTG TTGAACAAGT CTGGAAAGAA ATGCATAAAC 3000TTTTGCCATT CTCACCGGAT TCAGTCGTCA CTCATGGTGA TTTCTCACTT GATAACCTTA 3060TTTTTGACGA GGGGAAATTA ATAGGTTGTA TTGATGTTGG ACGAGTCGGA ATCGCAGACC 3120GATACCAGGA TCTTGCCATC CTATGGAACT GCCTCGGTGA GTTTTCTCCT TCATTACAGA 3180AACGGCTTTT TCAAAAATAT GGTATTGATA ATCCTGATAT GAATAAATTG CAGTTTCATT 3240TGATGCTCGA TGAGTTTTTC TAATCAGAAT TGGTTAATTG GTTGTAACAC TGGCAGAGCA 3300TTACGCTGAC TTGACGGGAC GGCGGCTTTG TTGAATAAAT CGAACTTTTG CTGAGTTGAA 3360GGATCAGATC ACGCATCTTC CCGACAACGC AGACCGTTCC GTGGCAAAGC AAAAGTTCAA 3420AATCACCAAC TGGTCCGGAT CCCGGTGCCT CACTGATTAA GCATTGGTAA CTGTCAGACC 3480AAGTTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA TTTTTAATTT AAAAGGATCT 3540AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC 3600ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC TTGAGATCCT TTTTTTCTGC 3660GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG 3720ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG CAGATACCAA 3780ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT CAAGAACTCT GTAGCACCGC 3840CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC TGCCAGTGGC GATAAGTCGT 3900GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA 3960CGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC 4020TACAGCGTGA GCTATGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG GACAGGTATC 4080CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA GCTTCCAGGG GGAAACGCCT 4140GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT 4200GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA CGCGGCCTTT TTACGGTTCC 4260TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC GTTATCCCCT GATTCTGTGG 4320ATAACCGTAT TACCGCCTTT GAGTGAGCTG ATACCGCTCG CCGCAGCCGA ACGACCGAGC 4380GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG 4440CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTGGC ACGACAGGTT TCCCGACTGG AAAGCGGGCA 4500GTGAGCGCAA CGCAATTAAT GTGAGTTAGC TCACTCATTA GGCACCCCAG GCTTTACACT 4560TTATGCTTCC GGCTCGTATG TTGTGTGGAA TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGGAA 4620ACAGCTATGA CCATGATTAC GAATTA464權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)胰島素C肽的方法，它包括在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)包含所述胰島素C肽多份拷貝的多聚多肽，剪切所表達(dá)的多肽釋放胰島素C肽單拷貝。
2.一種核酸分子，包含編碼胰島素C肽的核苷酸序列的多份拷貝，所述的核酸分子編碼能夠經(jīng)剪切釋放所述胰島素C肽單拷貝的多聚多肽。
3.一種生產(chǎn)核酸分子的方法，所述的核酸分子編碼包含胰島素C肽多份拷貝的多聚多肽，所表達(dá)的多聚多肽能夠再經(jīng)剪切而產(chǎn)生胰島素C肽單拷貝，所述的方法包括產(chǎn)生包含編碼胰島素C肽的核苷酸序列多份拷貝的核酸分子，以匹配讀碼框形式連接。
4.一種多聚多肽，它包含胰島素C肽的多份拷貝，能夠經(jīng)剪切釋放所述胰島素C肽的單拷貝。
5.一種生產(chǎn)多聚多肽的方法，所述多聚多肽包含胰島素C肽的多份拷貝，并能夠經(jīng)剪切釋放所述胰島素C肽單拷貝，所述的方法包括在所述多聚多肽被表達(dá)的條件下培養(yǎng)含有編碼所述多聚多肽的核酸分子的宿主細(xì)胞，回收所表達(dá)的多聚多肽。
6.一種生產(chǎn)胰島素C肽的方法，所示的方法包括剪切權(quán)利要求4所述的多聚多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，核酸分子或多聚多肽，其中所述胰島素C肽或編碼胰島素C肽的核苷酸序列的多份拷貝串聯(lián)排列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，核酸分子或多聚多肽，其中所述的多聚多肽包含所述胰島素C肽的2至30份拷貝。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，核酸分子或多聚多肽，其中所述的多聚多肽包含所述胰島素C肽的3至7份拷貝。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，核酸分子或多聚多肽，其中所述的多聚多肽還含有融合伴侶。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，核酸分子或多聚多肽，其中的融合伴侶是親合性結(jié)合對(duì)或配體中的一方。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，核酸分子或多聚多肽，所述的融合伴侶是鏈球菌蛋白G的25kDa的血清白蛋白結(jié)合區(qū)(BB)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，核酸分子或多聚多肽，所述多聚多肽中胰島素C肽單體的兩側(cè)是含有剪切位點(diǎn)的接頭區(qū)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，核酸分子或多聚多肽，所述的剪切位點(diǎn)可被蛋白水解酶剪切。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，核酸分子或多聚多肽，所述的剪切位點(diǎn)包含被胰蛋白酶和羧肽酶B剪切的精氨酸殘基。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至3和7至14中任一項(xiàng)所述的方法或核酸分子，所述的核酸分子還包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)控或表達(dá)調(diào)控序列。
17.一種表達(dá)載體，它包含權(quán)利要求2和7至16中任一項(xiàng)所述的核酸分子。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的表達(dá)載體，它是質(zhì)粒。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的表達(dá)載體，它以質(zhì)粒pTrpBB(SEQ ID NO14)為基礎(chǔ)或是它的衍生物。
20.一種宿主細(xì)胞，它包含權(quán)利要求2和7至16中任一項(xiàng)所述的核酸分子。
21.一種胰島素C肽，它是用權(quán)利要求1或6所述的方法制備的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)胰島素C肽的方法,它包括在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)含胰島素C肽多份拷貝的多聚多肽,剪切所述的多肽釋放出胰島素C肽單拷貝。本發(fā)明還提供用于上述方法的核酸分子,表達(dá)載體,和宿主細(xì)胞,以及上述方法中表達(dá)和被剪切的胰島素C肽多聚多肽。
文檔編號(hào)C12N15/16GK1268141SQ9880807
公開日2000年9月27日 申請(qǐng)日期1998年8月7日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月7日
發(fā)明者S·斯托爾, M·烏倫, P·A·尼格倫, P·約納松 申請(qǐng)人:瑞典創(chuàng)新肽有限公司