專利名稱：用于制備氨芐青霉素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于制備氨芐青霉素的方法，其中用苯基甘氨酸衍生物使6-氨基青霉烷酸(6-APA)進行酶?；磻?，反應混合物中所含6-APA與氨芐青霉素的總濃度大于250mM，溶液中6-APA的濃度被保持在低于300mM的水平且所用?；瘎┡c6-APA的摩爾比小于2.5。
WO-A-92/01061中描述了以高濃度的?；瘎┡cb-內酰胺衍生物通過b-內酰胺環(huán)、例如6-APA的酶?；饔脕碇苽鋌-內酰胺衍生物、包括氨芐青霉素的方法。將b-內酰胺環(huán)的濃度保持在相對較低的水平。從這些實例中可以推斷以高摩爾比的?；瘎┡cb-內酰胺環(huán)可以實現(xiàn)高轉化率，而以低摩爾比的?；瘎┡cb-內酰胺環(huán)則可以達到顯著低的轉化率。使用高摩爾比的?；瘎┡cb-內酰胺環(huán)的缺陷在于由于?；瘎┑乃庾饔枚鴮е碌拇罅旷；瘎┑娜笔А４送?，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在酶?；磻螳@得的反應混合物中含有的相當大量的D-苯基甘氨酸(相對于氨芐青霉素來說)會妨礙氨芐青霉素的改良，結果是可以分離較小量的氨芐青霉素。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)為在本方法中實現(xiàn)高轉化率，非常重要的是能夠在高濃度下、且由此在高濃度的b-內酰胺環(huán)條件下進行反應。
WO-A-96/02663中描述了一種方法，其中b-內酰胺環(huán)的酶?；磻诤愣舛鹊姆磻獎┫逻M行。在本文所述的連續(xù)方法中，目的是達到最高可接受水平的兩種反應劑濃度。
然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與在制備其它b-內酰胺衍生物、諸如頭孢氨芐中可以實現(xiàn)的轉化率相比，當在高濃度的6-APA下進行氨芐青霉素的制備時，僅能實現(xiàn)相對低的轉化率。
目前申請人意外地發(fā)現(xiàn)通過確保將反應混合物中含有的可溶形式的6-APA的濃度保持相對較低，所實現(xiàn)的轉化率可以比選擇盡可能高的溶解的6-APA的濃度時的轉化率要高。此外，發(fā)現(xiàn)當將溶解的6-APA的濃度保持較低時反應混合物的可攪拌性相對更好。
在本發(fā)明的上下文中，“轉化率”指的是所形成的氨芐青霉素與所用的6-APA的量的摩爾比。將溶解的6-APA的濃度表示為用摩爾表示的6-APA的量/kg反應混合物；將6-APA與氨芐青霉素的總濃度(溶解的和未溶解的)表示為用摩爾表示的6-APA與氨芐青霉素的量/kg的總反應混合物；除溶液外，總反應混合物可以含有許多固體物質，例如6-APA、氨芐青霉素、苯基甘氨酸和固定化酶。
?；瘎┡c6-APA的摩爾比、即所添加的苯基甘氨酸衍生物的總量除以所添加的6-APA的總量(均用摩爾表示)小于2.5。優(yōu)選所述的摩爾比在1.0-2.0之間。特別是在1.2-1.8之間。
優(yōu)選酶?；磻苑峙に囘M行。如果需要，也能夠在順序控制溶解的6-APA的濃度的條件下使反應連續(xù)進行。
在本發(fā)明的方法中，使得反應混合物中6-APA與氨芐青霉素(溶解的和未溶解的形式)的總濃度高于250mM，優(yōu)選高于300mM，1，且特別是高于350mM。
在制備氨芐青霉素的過程中，基本上將溶解的6-APA的濃度保持在低于300mM的水平。在高濃度?；瘎┫?，如果必要，可以將溶解的6-APA的濃度選擇為高于低濃度?；瘎┫逻x擇的溶解的6-APA的濃度。這是因為在高濃度?；瘎┫碌姆磻俾瘦^高，即高濃度溶解形式的6-APA僅能存在相對較短的時間。
可以以不同方式將反應混合物中所含溶解形式的6-APA的濃度保持在較低的水平。保持溶解的6-APA的濃度較低的一種可能性是僅在開始階段加入6-APA總量的一部分并在反應過程中添加其余的部分。然而，這種方法的缺陷在于必須將6-APA作為固體添加-這產(chǎn)生實際的難題。結果是優(yōu)選在反應的開始時最初以分批法加入6-APA的總量，此后，在酶?；磻^程中，反應混合物中6-APA的濃度會降低且氨芐青霉素的濃度會提高。不過，實現(xiàn)較低濃度溶解的6-APA的合適方法是、例如與反應劑達到最高溶解度時的pH相比將pH保持在較低值。將溶解形式的6-APA濃度保持較低的一種特別合適的方法是、例如確保將苯基甘氨酸衍生物的濃度保持在較低的水平，該方法例如通過在反應過程中部分量入(metering in)苯基甘氨酸衍生物來實現(xiàn)。
實際上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當將苯基甘氨酸衍生物的濃度保持較低時，幾乎沒有6-APA進入溶液，使得通過量入苯基甘氨酸衍生物可以控制溶液中6-APA的濃度。
可以將活化形式的苯基甘氨酸例如一種酰胺或一種酯、特別是一種甲酯用作(酶)?；磻械孽；瘎?。優(yōu)選使用D-苯基甘氨酸酰胺(PGA)。
如果將PGA以一種其鹽的形式、優(yōu)選PGA與一種無機酸的鹽、例如PGA.HCl、PGA.1/2H2SO4和PGA.HNO3來添加，那么會獲得一種特別合適的實施方案。在這種方式中，實際上能夠以一種簡單的方式通過保持pH恒定來實現(xiàn)PGA的最佳添加量。優(yōu)選使用PGA.1/2H2SO4，因為這種鹽具有很高的溶解度。
酶?；磻话阍诘陀?0℃的溫度下進行，優(yōu)選-5℃-35℃。所述的酶酰化反應一般在5.5-8.0的pH下進行，優(yōu)選6.0-6.8。
原則上可以將適合用作連接反應中的催化劑的任何酶用作這種酶。這類酶例如是公知為一般名稱是青霉素酰胺酶或青霉素?；D移酶的酶類。例如J.G.Shewale等在《生物化學方法》(ProcessBiochemistry)1989年8月，pp 146-154頁和J.G.Shewale等在《國際生物化學方法》(Process Biochemistry International)1990年6月，pp.97-103中描述了這類酶。合適的酶的實例是來源于下列菌的酶類醋桿菌屬、特別是巴斯德氏醋桿菌；氣單胞菌屬；產(chǎn)堿桿菌屬、特別是糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis)、Aphanocladium；芽孢桿菌屬、特別是巨大芽孢桿菌；頭孢屬；埃希氏桿菌屬、特別是大腸桿菌；黃桿菌屬；鐮孢屬、特別是尖孢鐮孢和茄病鐮孢；克呂沃爾氏菌屬；枝動菌屬；魚精蛋白桿菌屬；變形菌屬、特別是雷脫茄氏變形菌；假單胞菌屬和黃單胞菌屬、特別是柑桔黃單胞菌(Xanthomonas citrii)。
優(yōu)選使用一種固定化酶，因為可以將這種酶簡單地分離并再利用。合適的固定技術例如在EP-A-222462中所述。另一種合適的技術包括在一種載體上固定青霉素G酰基轉移酶的步驟，其中所述的載體含有一種膠凝劑、例如明膠和一種帶有游離氨基的聚合物、例如藻酸胺、脫乙酰殼多糖或聚乙烯亞胺(polyethylenimine)。此外，還可以使用結晶形式的酶(CLEC’sTM)。
在商購的固定化酶中，發(fā)現(xiàn)下列酶是特別合適的例如來自Boehringer Mannheim GmbH的大腸桿菌酶，它商購的商品名為Enzygel；來自Recordati的固定化青霉素-G?；D移酶和來自Pharma Biotechnology，Hannover的固定化青霉素-G酰基轉移酶。
(酶)?；磻头磻旌衔锏倪M一步改良實際上通常在水中進行。如果需要，反應混合物還可以含有一種有機溶劑或一種有機溶劑的混合物、優(yōu)選小于30％(體積)?？梢允褂玫挠袡C溶劑的實例是帶有1-7個碳原子的醇類，例如一醇、特別是甲醇或乙醇；二醇、特別是乙二醇；或者三醇、特別是甘油。
當已經(jīng)實現(xiàn)接近最高轉化率時在大多數(shù)情況下優(yōu)選終止反應。用于實現(xiàn)這一目的的合適的實施方案是降低pH，優(yōu)選將pH降至4.0-6.3，特別是5.0-5.7。另一種合適的實施方案是一旦達到最高轉化率就降低反應混合物的溫度。也能夠將兩種實施方案合并使用。
在大多數(shù)情況下達到最高轉化率時將反應終止后，反應混合物通常以一種懸浮液的形式存在，它含有幾種固體物質，例如氨芐青霉素、D-苯基甘氨酸和固定化酶。就反應的經(jīng)濟性來說，優(yōu)選回收所述的固定化酶。進行這一過程的合適方式是例如通過一種篩來過濾反應混合物，同時優(yōu)選用定向旋轉的攪拌器來進行攪拌，以便將所述的懸浮液向上壓至攪拌器的中心部分。隨后例如通過pH調節(jié)器可以回收有價值的成分，例如AMPI和PG。遺留的母液中僅含有少量的副產(chǎn)物，且如果需要可以隨后將它們進行再循環(huán)。
在本發(fā)明的上下文中，各種成分可以以游離形式或作為鹽存在于反應混合物中。所述的pH值通常指的是用在室溫下校準的pH電極測定的pH值。
本發(fā)明通過實施例來進一步進行解釋，然而，它們不用來限定本發(fā)明。
縮寫AMPI.3H2O＝氨芐青霉素三水合物6-APA ＝6-氨基青霉烷酸PGA ＝D-苯基甘氨酸酰胺PG＝D-苯基甘氨酸AssemblaseTM是一種來源于如WO-A-97/04086中所述的大腸桿菌ATCC1105的固定化大腸桿菌青霉素?；D移酶。固定方法如EP-A-222462中所述進行，將明膠和脫乙酰殼多糖用作膠凝劑并將戊二醛用作交聯(lián)劑。用已添加到活化小顆粒中的酶的量來測定大腸桿菌青霉素?；D移酶的總活性且等于3 ASU/g干重，將1 ASU(阿莫西林合成單位)定義為每小時由6-APA和D-p-羥苯基甘氨酸甲酯(HPGM)生成1g的阿莫西林。3H2O的酶的量(在20℃下，6.5％的6-APA和6.5％的HPGM)。
實施例IPGA.1/2H2SO4溶液的制備。
在T＝5℃下將301.6g的PGA(2.00mol)懸浮于650g的水中。在1小時的期限內逐滴加入102.1g、96％H2SO4(1.00mol)，同時攪拌，通過冷卻將溫度保持在T＜25℃。
實施例II氨芐青霉素的合成將300g凈重(net wet)的Assemblase填入一種安裝了帶有175μm篩目的篩底的酶反應器(1.5l，直徑11cm)中。
向制備反應器(1.2l)中添加131.6g的6-APA(0.600mol)、30.2g的PGA(0.200mol)和400ml的水(T＝10℃)。在T＝10℃下將該混合物攪拌15分鐘且然后將其在時間t＝0時轉入裝有100ml水(T＝10℃)的酶反應器中。
在t＝0時，啟動所述酶反應器中的攪拌器。在283分鐘的期限內以恒定的速度加入423.7g(0.800mol)的PGA.1/2H2SO4溶液，同時將溫度保持在10℃。pH約為6.3。從t＝328分鐘開始，通過用6N(含水)H2SO4滴定將pH保持在6.3。在t＝540分鐘時氨芐青霉素的量為最大值且通過加入6N的H2SO4使pH降至5.6。
目前酶反應器中含有575mmol的AMPI(＝相當于所用6-APA量的96％)15mmol的6-APA50mmol的PGA365mmol的PG反應過程中的濃度如

圖1中所示。
比較實驗A氨芐青霉素的合成將300g凈重(net wet)的Assemblase填入一種安裝了帶有175μm篩目的篩底的酶反應器(1.5l，直徑11cm)中。
在10℃下向制備反應器(1.2l)中添加溶于500ml水的143.2g(0.950mol)PGA。在10℃下15分鐘的期限內以小量方式添加131.6g的6-APA(0.600mol)，同時冷卻，而通過用6N(含水)H2SO4滴定將pH保持在7.0?？傆嬓枰?4.5ml的6N H2SO4。在T＝10℃下將混合物攪拌15分鐘且然后在時間t＝0時轉入裝有100ml水(T＝10℃)的酶反應器中。在t＝10時起動酶反應器中的攪拌器。通過用6N的H2SO4滴定將pH保持在7.0。使溫度保持在10℃。在t＝160分鐘時氨芐青霉素的量為最大值且通過加入6N的H2SO4使pH降至5.6?？傆嬒蛩龅拿阜磻髦刑砑?47.6ml的6N H2SO4。所述的混合物相對較粘而難以攪拌。
目前酶反應器中含有551mmol的AMPI(＝相當于所用6-APA量的92％)24mmol的6-APA50mmol的PGA330mmol的PG反應過程中的濃度如圖2中所示。
權利要求
1.用于制備氨芐青霉素的方法，其中用苯基甘氨酸衍生物使6-氨基青霉烷酸(6-APA)進行酶酰化反應，反應混合物中所含6-APA與氨芐青霉素的總濃度大于250mM，溶液中6-APA的濃度被保持在低于300mM的水平且所用?；瘎┡c6-APA的摩爾比小于2.5。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中反應混合物中所含6-APA與氨芐青霉素之和的濃度大于300mM。
3.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中溶液中6-PAP的濃度被保持在低于250mM的水平。
4.根據(jù)權利要求1-3中任意一項的方法，其中所用總?；瘎┡c6-APA的摩爾比小于2.0。
5.根據(jù)權利要求1-4中任意一項的方法，其特征在于在酶酰化反應過程中部分量入6-APA和/或苯基甘氨酸衍生物。
6.根據(jù)權利要求5的方法，其特征在于將苯基甘氨酸衍生物作為D-苯基甘氨酸酰胺與一種酸的鹽的形式量入。
7.根據(jù)權利要求6的方法，其特征在于將苯基甘氨酸衍生物以D-苯基甘氨酸酰胺。1/2 H2SO4水溶液的形式量入。
8.根據(jù)權利要求5-7中任意一項的方法，其特征在于通過測定pH來控制苯基甘氨酸衍生物的添加量。
9.根據(jù)權利要求1-8中任意一項的方法，其特征在于一旦達到接近最高轉化率就降低反應混合物的pH。
10.根據(jù)權利要求1-9中任意一項的方法，其特征在于一旦達到接近最高轉化率就降低反應混合物的溫度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于制備氨芐青霉素的方法,其中用苯基甘氨酸衍生物使6－氨基青霉烷酸(6－APA)進行酶酰化反應,反應混合物中所含6－APA與氨芐青霉素的總濃度大于250mM,溶液中6－APA的濃度被保持在低于300mM的水平且所用?；瘎┡c6－APA的摩爾比小于2.5。
文檔編號C12P37/00GK1265706SQ98807876
公開日2000年9月6日 申請日期1998年5月25日 優(yōu)先權日1997年6月10日
發(fā)明者H·M·莫迪, W·H·J·貝特森 申請人:Dsm有限公司