鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1的分子標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1的分子標(biāo)記方法。
【背景技術(shù)】
[0002]番前黃化曲葉病毒病為中國番前黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curlvirus，TYLCV)，屬于雙生病毒科。番前黃化曲葉病毒病與蔬菜上常見其它病毒病(如花葉、厥葉、條斑等病毒病)相比較而言，具有暴發(fā)突然、擴展迅速、危害性強、治療難度大等特點，是目前番茄生產(chǎn)上一種毀滅性的植物病害，是一種嚴重威脅全世界番茄生產(chǎn)的病害。培育抗病品種已成為防治該病害的主要技術(shù)手段。
[0003]標(biāo)記輔助選擇是育種的重要組成部分，加快了培育番茄雜交種的育種進程。分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于番茄抗病基因的定位，關(guān)于番茄抗雙生病毒的分子標(biāo)記的開發(fā)國外取得了很大進展。Zamir等將感病系M82 -1 - 8作為母本與抗TYLCV的智利番茄LA1969雜交，分析后代RFLP標(biāo)記和抗性，把耐TYLCV的不完全顯性的主效基因Ty-1基因定位在6號染色體的標(biāo)記TG297 (4cM)和TG97 (8.6cM)附近。Ji和Scott利用感病品種‘Horizon’和抗病材料(智利番茄)雜交后的F3分離群體進行RAH)進行分析，找到了與抗TYLCV基因緊密連鎖的2個RAPD標(biāo)記UBC697和UBC264，并將其轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記?？捎糜跇?biāo)記Ty-1基因還有CAPS標(biāo)記。但以上標(biāo)記存在的問題是操作流程較多，有些需要酶切等，此外與標(biāo)記基因的連鎖程度不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是，提供一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1的分子標(biāo)記方法。旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中番茄黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1的標(biāo)記操作流程較多、需要酶切、與標(biāo)記基因連鎖程度不高的技術(shù)問題。
[0005]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下:
[0006]一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1的分子標(biāo)記方法，該方法包括如下步驟:
[0007]步驟I，提取番茄的基因組DNA ；
[0008]步驟2，用分子標(biāo)記引物對前述提取的番茄基因組DNA進行PCR擴增，所述分子標(biāo)記引物的正向引物序列為5’ -CGTTCTGCTTAATGTGGCAAT-3’(其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示)，所述分子標(biāo)記引物的反向引物序列為5’ -CAACGGAGGGAGCATATCAT-3’ (其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示)；
[0009]步驟3，對前述PCR擴增產(chǎn)物進行電泳分析，如果電泳圖中產(chǎn)生690bp的條帶，則表明植株中含有黃化曲葉病毒抗性基因Ty-Ι，為抗病植株；如果電泳圖中產(chǎn)生409bp的條帶，則表明植株為含ty-Ι基因位點的株系，為不抗病植株。
[0010]進一步地，所述步驟3中PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖中如果同時產(chǎn)生690bp和409bp的條帶，表明植株為含Ty-1/ty-l位點的株系，為雜抗植株。
[0011]進一步地，所述步驟2中PCR擴增的反應(yīng)條件如下:
[0012]PCR的反應(yīng)體系是:10ng/uL的模板DNA 3 μ L，10umol/L的正向引物2.5 μ L，10umol/L 的反向引物 2.5 yL，10mmol/L 的 dNTP 0.625 μ L，10XPCR buffer 2.5 μ L，1mmoI/L 的 Mg2+2.5ul，Taq 酶 1U，補充 ddH20 至 25 μ L ;
[0013]PCR程序分別為:94 °C預(yù)變性3min，然后94°C變性30s，退火溫度57 °C 60s，72°C 60s，進行35個循環(huán)，最后72°C延伸1min。
[0014]本發(fā)明還提供了一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1的分子標(biāo)記引物，其特征在于:該引物的正向引物序列為5’-CGTTCTGCTTAATGTGGCAAT-3’ (其核苷酸序列如SEQID N0.1所示)，反向引物序列為5’ -CAACGGAGGGAGCATATCAT-3’ (其核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示)ο
[0015]本發(fā)明還提供了上述的分子標(biāo)記引物在番茄黃化曲葉病毒抗性基因定位、檢測或標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0017](I)由于番茄黃化曲葉病毒為煙粉虱傳播，傳統(tǒng)田間鑒定方法需要的且對條件要求苛刻。本發(fā)明提供的標(biāo)記方法則省去了田間鑒定所需要的長周期及對條件要求的苛刻。
[0018](2)本發(fā)明標(biāo)記方法中的電泳圖帶型簡單，易于鑒別，可直接應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇，節(jié)省了時間、物力、人力，且提高鑒定的準(zhǔn)確性。將該標(biāo)記應(yīng)用于苗期育種選擇，能夠準(zhǔn)確的篩選出具有抗病基因的個體植株，從而加速育種進程。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明中的分子標(biāo)記引物對待檢測番茄材料進行PCR擴增后產(chǎn)物的電泳圖。
【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細說明。以下采用的試劑和生物材料如未特別說明，均為商業(yè)化產(chǎn)品。
[0021]實施例1，分子標(biāo)記引物的篩選
[0022]采用BSA法分別構(gòu)建抗病基因池和感病基因池，用于分子標(biāo)記引物的篩選。
[0023]Zamir等將黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1定位在6號染色體上，與該基因連鎖的RAPD標(biāo)記及CAPS標(biāo)記均已被篩選出。本發(fā)明根據(jù)該定位結(jié)果以及番茄基因組序列和SSR遺傳圖譜，新設(shè)計一系列標(biāo)記引物。然后針對設(shè)計的一系列標(biāo)記引物對抗病材料和不抗病材料進行多態(tài)性篩選。篩選結(jié)果只有一對引物能夠擴增出多態(tài)性，可作為分子標(biāo)記引物。該分子標(biāo)記引物在含Ty-1位點的抗病材料中能夠擴增出690bp的片段；在含ty-Ι位點的不抗病材料中則擴增出409bp的片段；對于含Ty-1/ty-l位點的雜抗植株，則同時產(chǎn)生690bp和409bp的片段。
[0024]進一步，通過構(gòu)建的抗病基因池和感病基因池對篩選的分子標(biāo)記引物進行穩(wěn)定性鑒定，確定該分子標(biāo)記引物擴增的多態(tài)性穩(wěn)定。
[0025]篩選獲得的分子標(biāo)記引物為:正向引物序列為5’ -CGTTCTGCTTAATGTGGCAAT-3’ (其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示)，反向引物序列為5’ -CAACGGAGGGAGCATATCAT-3’ (其核苷酸序列如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0026]實施例2，利用篩選的分子標(biāo)記引物鑒定黃化曲葉病毒