本發(fā)明涉及腫瘤治療的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種含抗PD-1基因和聚亞精胺的復合物及其在治療腫瘤中的應用，具體涉及一種將抗PD-1(programmed death-1)基因與聚亞精胺形成的納米復合物通過體外轉(zhuǎn)染到T細胞，制備自帶分泌抗PD-1抗體-T細胞，能產(chǎn)生PD-1抗體，從而幫助阻斷PD-1信號，可有效幫助衰竭T細胞，促進抗腫瘤免疫應答的T細胞治療腫瘤的方法。

背景技術(shù)：

T淋巴細胞靶向殺傷表達這一特異抗原的腫瘤細胞。因其具有靶向殺傷腫瘤細胞的特點，CTL療法已成為腫瘤個體化治療的理想方案,在國際上越來越受到免疫學家們的重視。但是由于PD-1的產(chǎn)生導致T細胞失去活性。為了解決這一難題我們提出了在體外直接將抗PD-1的基因?qū)塍w細胞，從而T細胞自身產(chǎn)生抗PD-1的抗體，來提高T細胞的活性，起到治療腫瘤的作用。

基因因其獨特的靶點特異性、結(jié)構(gòu)可設(shè)計性和代謝安全性，成為科研界普遍看好的新的治療藥物。然而，在過去的20年里，研究人員設(shè)計了一系列的載體用于基因的體內(nèi)輸送，但僅有極少數(shù)進入臨床階段，迄今，仍未有一個載體得到FDA認證，一個有效載體的缺位，導致核酸物質(zhì)體內(nèi)輸送仍然處于臨床瓶頸期。

將核酸物質(zhì)輸送到靶細胞的胞漿或細胞核內(nèi)，需要克服一系列的體內(nèi)輸送屏障，因此，核酸載體是否高效，是其能否用于臨床治療的關(guān)鍵所在。核酸物質(zhì)輸送的載體一般為以下兩類：(1)病毒載體：病毒載體(如慢病毒載體、腺病毒載體)作為基因的輸送載體，雖然有較高的體外轉(zhuǎn)染活性，然而，其免疫原性與易導致突變的缺點為臨床試驗帶來了巨大的安全問題，使得其應用受限。(2)非病毒載體：非病毒載體的優(yōu)勢主要在于，在保證預期的轉(zhuǎn)染活性的條件下，可以大大降低病毒載體所帶來的免疫原性與諸多炎癥反應，其一般為以下兩種載體設(shè)計：(a)陽離子脂質(zhì)體；(b)聚陽離子基因載體。而目前研究更多的主要集中于聚陽離子基因載體與陽離子脂質(zhì)體的修飾，使之適用于基因物質(zhì)的靶向輸送。陽離子脂質(zhì)體具有較高的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染活性，然而，由于表面的正電荷影響其體內(nèi)的正常分布，同時，由于選用陽離子脂質(zhì)，免疫原性與炎癥反應在動物試驗中也成為不可避免的缺點之一(Gao,K.&Huang,L.Nonviral methods for siRNA delivery.Molecular pharmaceutics 6,651-658(2008).)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種含抗PD-1基因和聚亞精胺的復合物及其在治療腫瘤中的用途。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

第一方面，本發(fā)明提供了一種含抗PD-1基因和聚亞精胺的復合物，所述復合物包括質(zhì)量比為1～100：1的聚亞精胺聚合物和抗PD-1基因。

優(yōu)選地，所述聚亞精胺聚合物和抗PD-1基因的質(zhì)量比為5～50：1。

優(yōu)選地，所述聚亞精胺聚合物和抗PD-1基因的質(zhì)量比為10～30：1。

優(yōu)選地，所述聚亞精胺聚合物為亞精胺與連接劑形成的聚陽離子聚合物。

優(yōu)選地，所述連接劑為戊二醛、對苯二甲醛、間苯二甲醛、鄰苯二甲醛、2,5-咪唑二甲醛、2,4-吡啶二甲醛、2,5-吡啶二甲醛、2,6-吡啶二甲醛、2,5-噠嗪二甲醛或2,6-噠嗪二甲醛中的一種。

第二方面，本發(fā)明提供了一種含抗PD-1基因和聚亞精胺的復合物的制備方法，包括以下步驟：

所述聚亞精胺聚合物的水溶液和抗PD-1基因的水溶液混合，在室溫靜置20-60分鐘即可制得所述復合物。

第三方面，本發(fā)明提供了一種含抗PD-1基因和聚亞精胺的復合物的在治療腫瘤中的應用。

第四方面，本發(fā)明提供了一種利用含抗PD-1基因和聚亞精胺的復合物治療腫瘤的方法，包括以下步驟：

將所述含抗PD-1基因和聚亞精胺的復合物與T細胞共培養(yǎng)，制備自帶分泌抗PD-1抗體-T細胞，再將自帶分泌抗PD-1抗體-T細胞注射到腫瘤病人體內(nèi)即可。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

1、本發(fā)明的分泌抗PD-1抗體-T細胞可有效治療腫瘤，可實現(xiàn)腫瘤的免疫治療，并且，不存在體內(nèi)毒性的問題。

2、本發(fā)明制備的含抗PD-1基因和聚亞精胺的復合物轉(zhuǎn)染T細胞治療腫瘤的方法，可實現(xiàn)抗PD-1基因高效低毒的輸送，由于亞精胺是體內(nèi)專職凝聚基因的功能，從而有效提高轉(zhuǎn)染效果。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯：

圖1為本發(fā)明的復合物的粒徑示意圖；

圖2為本發(fā)明的復合物的zeta電位示意圖；

圖3為本發(fā)明的復合物的透射電鏡示意圖；

圖4為本發(fā)明的復合物的凝膠電泳示意圖；

圖5為本發(fā)明的聚亞精胺聚合物的細胞毒性示意圖；

圖6為小鼠腫瘤模型及腫瘤組織切片的示意圖；其中，圖A-D為取下的腫瘤組織，A為生理鹽水組的腫瘤；B為裸DNA組的腫瘤；C為聚亞精胺聚合物(PSAi)組的腫瘤；D為本發(fā)明的納米復合物組的腫瘤。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。

以下實施例提供了一種含抗PD-1基因和聚亞精胺的復合物，所述復合物包括質(zhì)量比為1～100：1的聚亞精胺聚合物和抗PD-1基因。

所述聚亞精胺聚合物和抗PD-1基因的質(zhì)量比為5～50：1。

所述聚亞精胺聚合物和抗PD-1基因的質(zhì)量比為10～30：1。

所述聚亞精胺聚合物為亞精胺與連接劑形成的聚陽離子聚合物。

所述連接劑為戊二醛、對苯二甲醛、間苯二甲醛、鄰苯二甲醛、2,5-咪唑二甲醛、2,4-吡啶二甲醛、2,5-吡啶二甲醛、2,6-吡啶二甲醛、2,5-噠嗪二甲醛或2,6-噠嗪二甲醛中的一種。

所述含抗PD-1基因和聚亞精胺的復合物的制備方法，包括以下步驟：

所述聚亞精胺聚合物的水溶液和抗PD-1基因的水溶液混合，在室溫靜置20-60分鐘即可制得所述復合物。

所述含抗PD-1基因和聚亞精胺的復合物的在治療腫瘤中的應用。

所述利用含抗PD-1基因和聚亞精胺的復合物治療腫瘤的方法，包括以下步驟：

將所述含抗PD-1基因和聚亞精胺的復合物與T細胞共培養(yǎng)，制備自帶分泌抗PD-1抗體-T細胞，再將自帶分泌抗PD-1抗體-T細胞注射到腫瘤病人體內(nèi)即可。

實施例1聚亞精胺聚合物(PSAi)和抗PD-1質(zhì)粒DNA的形成復合物的制備

將聚亞精胺與連接劑2,6-吡啶二甲醛制備的聚亞精胺聚合物配成水溶液，濃度為2μg/μl，用滅菌水稀釋成20ng/μl、40ng/μl、100ng/μl、200ng/μl、1000ng/μl和2000ng/μl溶液。另外將抗PD-1基因質(zhì)粒DNA配成水溶液，濃度為20ng/μl。將聚亞精胺聚合物水溶液等體積加入至質(zhì)粒DNA水溶液，渦旋5min，并靜置20min，即得一系列納米復合物的溶液。

實施例2聚亞精胺聚合物(PSAi)和抗PD-1質(zhì)粒DNA的形成復合物的粒徑與電位的表征

將實施例1制備的一系列復合物溶液放入BIC90plus粒度電位分析儀的測試槽中，該一系列復合物溶液的復合物中PSAi與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比0.25、0.5、2、5、10、50，設(shè)置測試溫度為25℃，介質(zhì)為水，粘度為0.89cp，折射率為1.330，光散射角度為90。，檢測波長為659nm，每個樣品測試3次，每次運行時間為2min，記錄粒徑平均值。結(jié)果如圖1所示，結(jié)果顯示納米復合物的粒徑在200nm以下。其分散指數(shù)符合要求。

將實施例1制備的一系列復合物溶液放入BIC90plus粒度電位分析儀的測試槽中，該一系列復合物溶液的復合物中PSAi與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比0:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1，設(shè)置測試溫度為25℃，介質(zhì)為水，粘度為0.89cp，折射率為1.330，介電常數(shù)為78.54，pH值為7.0，zeta電位分析模型為Smoluchowski方程，每個樣品測試3次，每次自動運行10次，記錄zeta電位平均值。結(jié)果如圖2所示。從圖2的結(jié)果可知，其電勢符合要求。

實施例3聚亞精胺聚合物(PSAi)和抗PD-1質(zhì)粒DNA的形成復合物的透射電鏡測試

按照實施例1的制備方法來配制PSAi/抗PD-1基因質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為1:l的復合物納米復合物溶液，樣品量為100μL。吸取10μl，滴加在400目的銅網(wǎng)上，自然晾干，最后使用透射電子顯微鏡來觀察樣品的形態(tài)，記錄透射電鏡圖。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果顯示納米復合物的粒徑在200nm以下。

實施例4聚亞精胺聚合物(PSAi)和抗PD-1質(zhì)粒DNA的形成復合物的凝膠電泳測試

稱取1.0g瓊脂糖，加入100ml 1×TAE緩沖液，在微波爐中加熱溶解，待溫度降至65℃，加入溴化乙啶(EB)，配制成1.0％瓊脂糖溶液(含0.5μg/ml溴化乙啶)，倒入制膠槽中，插入樣品梳，室溫放置0.5-1小時等膠凝固。然后，拔出樣品梳，電泳槽中加入TAE緩沖液沒過凝膠，等待上樣。接著，按照實施例1的制備方法來配制聚亞精胺聚合物與基因物質(zhì)不同質(zhì)量比的納米復合物水溶液，PSA與基因物質(zhì)的質(zhì)量比依次為0、0.2、0.5、1、5、10、15、20、30、50。Marker選用DSTM5000(100–5000bp)，上樣2μl；6×上樣緩沖液(溴酚蘭-甘油指示劑，含0.25％溴酚蘭，40％甘油)1μl與納米復合物水5μl均勻混合，上樣6μl。在110mV電壓下電泳45分鐘，最后，置于紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄電泳圖，結(jié)果如圖4所示。從電泳圖可以看出，含有抗PD-1基因的質(zhì)粒DNA在質(zhì)量比為1時，復合物在電場的泳動已經(jīng)被完全阻滯住了。從圖片可以觀察到，隨著質(zhì)量比的增加，復合物的泳動都被阻滯了。該試驗表明PSAi具有較好的凝聚質(zhì)粒DNA形成復合物的能力，有效的保護了質(zhì)粒DNA。

實施例5聚亞精胺聚合物(PSAi)的T細胞毒性檢測

采用MTT法測定細胞毒性，選用T細胞考察細胞毒性，以8000個/孔的細胞密度轉(zhuǎn)96孔細胞板，置于37℃5％細胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜。配制1、2、4、8、15mg/mL的一系列不同濃度的聚亞精胺聚合物(由實施例1的方法制備)溶液，每孔加入100μL，稀釋介質(zhì)是DMEM高糖培養(yǎng)基(無血清無酚紅)，從培養(yǎng)箱中取出96孔細胞板，吸去培養(yǎng)液，每孔用100μL磷酸鹽緩沖溶液沖洗一次，再棄去磷酸鹽緩沖溶液，將不同濃度的聚亞精胺聚合物溶液依次加入到細胞板中，平行測定3個孔。置于細胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)4小時。然后，吸去培養(yǎng)液，每孔用100μL磷酸鹽緩沖溶液沖洗一次，再棄去磷酸鹽緩沖溶液，每孔加入100μL DMEM高糖培養(yǎng)基(無血清無酚紅)和25μL MTT溶液(5mg/mL)，繼續(xù)于培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。6小時之后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入100μL二甲基亞砜，放置充分溶甲瓚，采用多功能酶標儀測定樣品在570nm和630nm處的吸光度值(以630nm處為對照)。結(jié)果顯示聚亞精胺聚合物(PSAi)的毒性較低，而高分子的PEI(分子量25000)的毒性明顯高于PSAi。

實施例6本發(fā)明的抗PD-1基因與聚亞精胺聚合物形成復合物轉(zhuǎn)染T細胞治療腫瘤的效果試驗

BALB/c雌性裸鼠(5周齡，體重20±2g)，SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)1周，取SMMC7721生長最佳狀態(tài)的傳代細胞，按細胞數(shù)4×10⁶個/ml細胞液，0.1ml接種于BALB/c小鼠后肢近背部皮下。繼續(xù)飼養(yǎng)2周，使用游標卡尺測量并觀察腫瘤的生長狀況，按照如下公式來計算腫瘤的體積：腫瘤體積(mm³)＝(長×寬×寬)/2。當腫瘤體積達到150-200mm³的時候(做腫瘤模型動物實驗)，分為A為生理鹽水組的腫瘤，B為裸DNA組的腫瘤，C為亞聚精胺聚合物(PSAi)組的腫瘤，D為本發(fā)明的納米復合物組的腫瘤。其中，生理鹽水組注射生理鹽水，裸DNA組注射裸DNA，聚精胺聚合物(PSA)組注射PSA，本發(fā)明的納米復合物組注射的是：經(jīng)本發(fā)明實施例1制備的納米復合物(PAS與抗PD-1質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比為1:40)轉(zhuǎn)染后的T細胞，該轉(zhuǎn)染后的T細胞為含自帶分泌抗PD-1抗體-T細胞。

三周后處死小鼠，取腫瘤組織，檢測結(jié)果如圖6所示，其中，A-D為取下的腫瘤組織，A為生理鹽水組的腫瘤，B為裸DNA組的腫瘤，C為聚亞精胺聚合物(PSAi)組的腫瘤，D為本發(fā)明的納米復合物組的腫瘤。實驗結(jié)果顯示：本發(fā)明的組治療的效果很好。

本發(fā)明具體應用途徑很多，以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。應當指出，以上實施例僅用于說明本發(fā)明，而并不用于限制本發(fā)明的保護范圍。對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進也應視為本發(fā)明的保護范圍。