向日葵中的霜霉菌抗性提供基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及向日葵中的霜霉菌抗性基因，尤其涉及具有霜霉菌抗性的向日葵植 物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及獲得所述具有霜霉菌抗性的向日葵植物的方法，以及所述基因在向 日葵中提供霜霉菌抗性的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 向日葵屬(Helianthus L.)是包括菊(Asteraceae)科中的約52種植物的屬。常用 名稱"向日葵"通常用于表示一年生物種向日葵(Helianthus annuus)。作為食用作物和觀 賞植物，向日葵(Helianthus annuus)和其他物種，諸如洋姜（菊芋Helianthus tuberosus) 被栽培在溫和的地區(qū)。被馴化的向日葵Helianthus annuus是向日葵屬(Helianthus L.)最 常見的物種。栽培Helianthus annuus用于觀賞，并且用于提供來自種子的植物油。
[0003] 霜霉病，向日葵中的一種常見且具有毀滅性的疾病，能殺死植物或阻礙植物的正 常發(fā)育，減少直立（stand )，并且導(dǎo)致顯著的產(chǎn)量損失（高達(dá)50 %~95 % )。在種植之后2~3 周內(nèi)降了暴雨的大田里，向日葵最易受到霜霉菌的影響。
[0004] 霜霉菌(downy mildew)指卵菌植物病原體的植物專性寄生物的幾種類型中的任 一種。霜霉菌專屬于霜霉科(Peronosporaceae)。在栽培的向日葵中常引起霜霉病的霜霉菌 病原體，被命名為向日葵霜霉病菌(Plasmopara halstedii)或向日葵軸霜霉(Plasmopara helianthi)〇
[0005] 在向日葵栽培和育種的技術(shù)領(lǐng)域中，始終需要鑒定出抗霜霉菌的新的抗性基因。 但是，鑒定出的抗性最大的基因是單基因顯性抗性基因，而由這些基因提供的抗性常常很 快就被破壞，因?yàn)樗咕≡w以高頻率發(fā)生進(jìn)化并且適應(yīng)新的情況，從而恢復(fù)成功感染 宿主植物的能力。因此，在本領(lǐng)域中需要持續(xù)尋找新的抗性基因，優(yōu)選其抗性不易被病原體 的適應(yīng)性破壞的抗性基因。
[0006] 除了提供病原體抗性之外，已知的向日葵抗性基因的缺點(diǎn)是，這些基因常常伴隨 不理想的表型，諸如矮化生長(zhǎng)或自發(fā)出現(xiàn)的細(xì)胞死亡。因此，在本領(lǐng)域中需要持續(xù)尋找具有 抗性而沒有不理想表型的新的抗性基因。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 及【具體實(shí)施方式】
[0008] 除了其他目的，本發(fā)明的目的是至少部分（如果不是完全)滿足本領(lǐng)域的上述需 求。
[0009] 除了其他目的，本發(fā)明的這一目的通過提供如在所附權(quán)利要求書中所提出的向日 葵植物和抗性基因來滿足。
[0010] 具體地，除了其他目的，根據(jù)第一方面，通過對(duì)植物病原體霜霉菌具有抗性的向日 葵植物來滿足本發(fā)明的這一目的，其中，所述植物包括:編碼(a)包括如SEQ ID No.2和/或 SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的蛋白的霜霉菌抗性賦予基因，或者編碼與SEQ ID No.2 和/或SEQ ID No.4本身具有超過90%序列同一性、優(yōu)選超過94%序列同一性、更優(yōu)選超過 96%序列同一性的蛋白的霜霉菌抗性賦予基因；并且其中，與對(duì)植物病原體霜霉菌沒有抗 性的向日葵植物中的所述抗性賦予基因的表達(dá)相比，所述抗性賦予基因的表達(dá)是降低的， 或者與對(duì)植物病原體霜霉菌沒有抗性的向日葵植物中的所述蛋白的酶活性相比，所述蛋白 的酶活性是降低的。
[0011] 在得到本發(fā)明的研究中，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，所述基因的表達(dá)降低或所述蛋白的酶 活性降低在向日葵植物中提供了對(duì)霜霉菌的廣譜且持久的抗性。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明，與對(duì)植物病原體霜霉菌沒有抗性的向日葵植物中的所述抗性賦予基 因表達(dá)相比，表達(dá)是降低的。術(shù)語"沒有抗性"指在適當(dāng)?shù)募膊y(cè)試中并且使用適當(dāng)?shù)膮⒄?植物(諸如親本植物)確定的抗性水平低于在本發(fā)明植物中觀察到的抗性水平。相應(yīng)地，所 述抗性也可被稱為對(duì)霜霉菌的提高的抗性。除了親本植物之外，根據(jù)本發(fā)明的合適的參照 植物也可以是本領(lǐng)域中被普遍稱為易受霜霉菌影響的植物。
[0013] 合適的疾病測(cè)試是，使用霜霉菌病原體接種植物，隨后觀察疾病癥狀的出現(xiàn)，諸如 在葉子的上表面或被破壞的葉組織上出現(xiàn)可見的大、有角或塊狀、黃色的區(qū)域。
[0014] 可使用任何合適的且眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)，諸如定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)或mRNA雜交，來確定本發(fā)明的植物和參照植物中的表達(dá)水平
[0015] 根據(jù)本發(fā)明，與對(duì)植物病原體霜霉菌沒有抗性的向日葵植物中的本發(fā)明蛋白的活 性相比，酶活性是降低的。術(shù)語"沒有抗性"指在適當(dāng)?shù)募膊y(cè)試中并且使用適當(dāng)?shù)膮⒄罩?物(諸如親本植物)確定的抗性水平低于在本發(fā)明植物中觀察到的抗性水平。相應(yīng)地，所述 抗性也可被稱為對(duì)霜霉菌的提高的抗性。除了親本植物之外，根據(jù)本發(fā)明的合適的參照植 物也可以是本領(lǐng)域中被普遍稱為易受霜霉菌影響的植物。合適的疾病測(cè)試是，使用霜霉菌 病原體接種植物，隨后觀察疾病癥狀的出現(xiàn)，諸如在葉子的上表面或被破壞的葉組織上出 現(xiàn)可見的大、有角或塊狀、黃色的區(qū)域。
[0016] 本發(fā)明所述的蛋白具有2-酮戊二酸FE(II)依賴性氧合酶活性。所述酶絕對(duì)需要Fe (II)，并且催化雙電子氧化，包括羥基化、脫飽和和氧化閉環(huán)反應(yīng)。"最初"底物的氧化與20G 轉(zhuǎn)化成琥珀酸鹽和C02相關(guān)。氧分子的一個(gè)氧并入到琥珀酸鹽中。在脫飽和反應(yīng)的情況中， 其他氧分子來源的氧可能轉(zhuǎn)化成水。在羥基化反應(yīng)中，來自氧分子的氧部分并入醇產(chǎn)物中， 同時(shí)觀察到來自水的氧發(fā)生顯著水平的交換。相應(yīng)地，所述降低的活性可使用酶反應(yīng)的起 始化合物或生成化合物的試驗(yàn)測(cè)量化合物來測(cè)定。作為合適的選擇，可通過例如ELISA或蛋 白雜交(二者都是技術(shù)人員公知的技術(shù)），來確定所述蛋白的蛋白水平（固有地指示降低的 活性）
[0017] 在本發(fā)明的上下文內(nèi)，通過使所述向日葵植物的所述蛋白或編碼所述蛋白的基因 的表達(dá)或活性降低，以單獨(dú)地或者組合地提供對(duì)霜霉菌的抗性。
[0018] 可通過對(duì)易受霜霉菌影響的植物或霜霉科真菌抗性植物進(jìn)行誘變，從而提高其抗 性，來獲得本發(fā)明的向日葵植物。例如，通過使用諸如甲基磺酸乙酯(EMS)的誘變化學(xué)品，或 使用γ射線或快中子對(duì)植物材料進(jìn)行輻照，可在這些植物中引入表達(dá)水平或蛋白水平上的 突變。產(chǎn)生的突變可以是定向的或者是隨機(jī)的。當(dāng)產(chǎn)生隨機(jī)突變時(shí)，則使用TILLING(定向誘 導(dǎo)基因組局部突變）法（McCallum et al.(2000)Targeted screening for induced mutations.Nat .Biotechnol.18,455-457,and Hen i kof f et al . (2004) TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiol.135, 630-636)，可以很容易地鑒定出在所述抗性賦予基因中攜帶突變的誘變植物。簡(jiǎn)單來講，該 方法基于:在M2代中，對(duì)一大批誘變植物的基因組DNA的感興趣基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過使用 單鏈特異性核酸酶，諸如CEL-I核酸酶（Till et al.(2004)Mismatch cleavage by single-strand specific nucleases.Nucleic Acids Res.32,2632-2641)進(jìn)行DNA測(cè)序或 者掃描點(diǎn)突變，鑒定出在所述基因中具有突變的個(gè)體植物。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的該第一方面的優(yōu)選實(shí)施方式，所述霜霉菌病原體是向日葵霜霉病菌 (Plasmopara halstedii)和/或向日葵軸霜霉(Plasmopara helianthi)。但是，屬于霜霉科 (Peronosporaceae)且能在向日葵中引起霜霉病的其他病原體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的該第一方面的另一優(yōu)選實(shí)施方式，通過在所述基因的編碼序列中的 產(chǎn)生截短或非功能性蛋白的一個(gè)或多個(gè)突變，來提供所述降低的酶活性。通過分析在mRNA 或cDNA水平上的基因轉(zhuǎn)錄物，可以很容易地確定截短的蛋白，并且，在酶測(cè)定中或使用構(gòu)象 依賴性抗體，可以確定非功能性蛋白?？梢栽谵D(zhuǎn)錄水平上測(cè)定的突變例如是氨基酸置換、移 碼突變或提取出現(xiàn)的終止密碼子。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的該第一方面的特別優(yōu)選的實(shí)施方式，使所述蛋白的活性降低的突變 是，使所述抗體提供基因的編碼序列缺乏序列基元"WRDYLR"或Trp-Arg-Asp-Tyr-Leu-Arg， 或在序列基元"WRDYLR"或Trp-Arg-Asp-Tyr-Leu-Arg中產(chǎn)生氨基酸置換的突變。所述序列 基元位于SEQ ID No.2的氨基酸第107~112位