板栗疫病菌致病力基因P5Cdh及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種影響真菌致病力和產(chǎn)孢的板栗疫病菌致病力基因P5Cdh及其應(yīng)用。該基因含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，DNA全長2270bp，cDNA全長1782bp，編碼594個(gè)氨基酸，表達(dá)的蛋白質(zhì)如SEQ.ID.No.3所示，該蛋白可用于調(diào)控板栗疫病菌的致病機(jī)理。實(shí)驗(yàn)證明，該基因被潮霉素抗性基因hph置換后得到的缺失突變體在離體板栗樹枝上形成致病斑極顯著小于野生型產(chǎn)生的致病斑，即基因P5Cdh的缺失導(dǎo)致板栗疫病菌的致病力喪失。本發(fā)明涉及的基因P5Cdh及其表達(dá)載體、宿主等在植物病害防治藥物和板栗疫病控制研究方面具有重要意義。低毒病毒侵染板栗疫病菌后抑制P5Cdh基因轉(zhuǎn)錄，該基因編碼的蛋白可能是低毒病毒侵染后作用的靶標(biāo)，本發(fā)明涉及的低毒病毒與該基因的相互影響為研究病毒-宿主相互作用的分子機(jī)制具有重要的意義。
【專利說明】板栗疫病菌致病力基因P5Cdh及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物基因工程和植物保護(hù)領(lǐng)域，尤其涉及一種影響真菌致病カ和產(chǎn)孢的板栗疫病菌致病力基因P5Cdh及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)是引起板栗疫病的病原菌,在分類上屬于子囊菌中的絲狀真菌，現(xiàn)在已成為研究植物病原真菌致病機(jī)理的ー個(gè)模式菌。
[0003]目前，大約70%-80%植物病害都是由植物病原真菌引起的，研究病原真菌的侵染過程是深入研究病原真菌致病分子機(jī)理的基礎(chǔ)。根據(jù)病原真菌侵染寄主的過程了解到病原真菌致病因子和致病基因主要有:⑴與植物病原真菌粘附寄主表面有關(guān)，如酯酶和角質(zhì)酶，真菌通過釋放這些酶來改變宿主表面的特性與植物病原真菌侵染結(jié)構(gòu)有夫，如附著胞和侵染釘，真菌通過產(chǎn)生由特化的菌絲形成的侵染結(jié)構(gòu)來幫助入侵并與宿主建立計(jì)生關(guān)系與侵入有夫，有些病原真菌穿透是通過自然孔ロ入侵，如氣孔或傷ロ，有些病原真菌入侵則可直接穿透植物表面必)侵入宿主的病原真菌相應(yīng)要對宿主產(chǎn)生的防衛(wèi)物質(zhì)進(jìn)行解毒作用，同時(shí)也產(chǎn)生一 系列降解酶和有毒性的代謝產(chǎn)物破壞和分解寄主組織，并從中獲得水分和營養(yǎng)成分，達(dá)到進(jìn)一歩在寄主體內(nèi)定殖的作用，如細(xì)胞壁降解酶(果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素降解酶)和細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)含物降解酶(蛋白酶、淀粉酶、脂酶)。通過分析致病因子、分離與克隆致病基因來深入地研究病原真菌的致病分子機(jī)理，對于制訂持久、有效的病害治理策略具有重大意義。
[0004]在國內(nèi)，現(xiàn)有栗疫病的主要防治方法是綜合防治，包括選育抗病品種、鏟除病源和病斑用藥。用藥主要依賴化學(xué)藥劑，但化學(xué)農(nóng)藥的大量使用會帶來環(huán)境污染、生態(tài)破壞等負(fù)面影響，生物防治已越來越受到重視。鑒定致病基因，深入研究其致病機(jī)理，為生物農(nóng)藥設(shè)計(jì)候選的靶標(biāo)基因，尤其是環(huán)保高效殺菌劑設(shè)計(jì)用靶標(biāo)的選定具有重要的指導(dǎo)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種板栗疫病菌致病力基因P5Cdh及其應(yīng)用，該基因在板栗疫病菌的致病機(jī)制中起重要作用，對篩選植物病害防治的靶標(biāo)藥物具有重要意義。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:板栗疫病菌致病力基因P5Cdh，具有序列表SEQ.1D.N0.1的堿基序列，由2270個(gè)堿基組成，3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子分別位于SEQ ID No:1的自5’端的第1-180位堿基為該基因組基因的第一個(gè)外顯子，自5’端的第254-361位堿基為該基因組基因的第二個(gè)外顯子，自5’端的第438-1931位堿基為該基因組基因的第三個(gè)外顯子，自5’端的第181-253位堿基為該基因組基因的第一個(gè)內(nèi)含子，自5’端的第362-437位堿基為該基因組基因的第二個(gè)內(nèi)含子；自5’端的第1_3位堿基為該基因起始密碼子ATG，自5’端的第1929-1931位堿基為該基因組基因的終止密碼子TGA ；自3'端的第1932-2270位堿基為該基因組基因的3’非編碼區(qū)；或者具有編碼序列表SEQ.ID.N0.3氨基酸序列的堿基序列。
[0007]與上述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh具有50%以上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的堿基序列。
[0008]上述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh或其缺失、突變或修飾后的基因在控制板栗疫病菌致病中的應(yīng)用。
[0009]以上述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh中任一區(qū)域堿基序列設(shè)計(jì)的引物。
[0010]上述引物通過PCR擴(kuò)增用于檢測在化合物處理狀況下P5Cdh基因的表達(dá)。
[0011]上述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh的cDNA，具有序列表SEQ.1D.N0.2的堿基序列，由1782個(gè)堿基組成；或者具有編碼序列表SEQ.1D.N0.3氨基酸序列的堿基序列。
[0012]上述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh編碼的蛋白質(zhì)或其同源蛋白，具有序列表SEQ.1D.N0.3,由594個(gè)氨基酸組成；或SEQ.1D.N0.4 (稻痕菌(Manapothia oryzae)同源蛋白，一致性 73%)、SEQ.1D.N0.5 (尖孢錸刀菌(Fusarium oxysporum)同源蛋白，一致性 71%)的氨基酸序列。
[0013]上述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh編碼的蛋白質(zhì)或其同源蛋白，氨基酸序列經(jīng)過不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和或缺失和或添加。
[0014]上述蛋白質(zhì)或其同源蛋白為靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中的應(yīng)用。
[0015]以上述蛋白質(zhì)或與其有40%以上一致性的同源蛋白中任一區(qū)域氨基酸序列設(shè)計(jì)的多肽。
[0016]上述多肽制備抗體用于檢測在化合物處理狀況下P5Cdh蛋白的表達(dá)。
[0017]治療板栗疫病的方法，阻斷或抑制板栗疫病菌的P5Cdh的表達(dá)。
[0018]本發(fā)明所提供的板栗疫病菌編碼5-羧基-A1-吡咯啉脫氫酶(A 1-pyrroline-S-carboxylate dehydrogenase)蛋白，名稱為 P5Cdh,來源于板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica) EP155 菌株(ATCC 38755)。
[0019]同源蛋白的聚類分析表明，P5Cdh與植物病原真菌稻瘟菌親緣關(guān)系最近(同源性70.4%)，之后為尖孢錸刀菌(同源性為69.2%)、核盤菌(同源性為69.0%)，煙曲霉與產(chǎn)黃青霉(同源性分別為62.8%和62.0%)(圖1)，表明P5Cdh蛋白在致病真菌中可能執(zhí)行ー些相同的基本功能。為了鑒定P5Cdh蛋白功能，將P5Cdh蛋白進(jìn)行原核表達(dá)和酶活檢測，對重組蛋白以P5C為反應(yīng)底物，NAD為末端電子受體，根據(jù)檢測一系列的濃度梯度NAD接受P5C傳遞的電子生成NADH以檢測酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。根據(jù)雙倒數(shù)法得出Km值為1.48±0.145mM與Vmax值為 1.69±0.1lOumol.S-kcat=OJTi0.050s—1 (如圖 2)。為了研究 P5Cdh 在板栗疫病菌中的功能,通過同源重組方法以高效同源重組系統(tǒng)Aku80為出發(fā)菌株構(gòu)建了 P5Cdh的缺失突變體A P5Cdh并進(jìn)行了功能互補(bǔ)(圖3)，構(gòu)建的突變體經(jīng)Southern blot驗(yàn)證基因P5Cdh已被潮霉素抗性基因置換。將突變體△ P5Cdh接種到PDA平板培養(yǎng)觀察表型，該菌株表型與EP155和Aku80無顯著不同，色素增加(圖4);將突變體AP5Cdh接種到板栗樹枝進(jìn)行致病力檢測，AP5Cdh產(chǎn)生的致病斑大小顯著小于EP155和Aku80的致病斑(圖4)，可見基因P5Cdh是板栗疫病菌致病力相關(guān)基因。突變體AP5Cdh的產(chǎn)孢量(2.51X107±1.03X106個(gè)/mL)與 EP155 (2.08X 107±3.38X 106 f/mL)#PAku80 (1.79 X 107± 1.63 X IO6 個(gè) /mL)無顯著差異(圖5)。低毒病毒侵染突變體AP5Cdh不但使菌株變白且不產(chǎn)抱，而且菌落生長受抑制顯著；且低毒病毒抑制基因P5Cdh的轉(zhuǎn)錄(圖6)。綜合以上結(jié)果，證明了 P5Cdh基因的缺失導(dǎo)致板栗疫病菌的致病力顯著降低。說明P5Cdh基因是板栗疫病菌致病機(jī)制所必需的基因。因此，篩選能夠阻止該基因表達(dá)與其蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾與定位的化合物，可以有效控制板栗疫病菌的毒力，可以作為新型殺菌劑的候選新藥物直接利用。也就是說，本發(fā)明所提供的P5Cdh的ー個(gè)重要用途是，該基因的表達(dá)與其蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾與定位可以作為重要靶位點(diǎn)用于抗真菌藥劑(特別是抗板栗疫病菌的藥劑)的篩選和設(shè)計(jì)中。進(jìn)ー步解析該基因參與的致病機(jī)制，從中也可以發(fā)現(xiàn)候選靶位點(diǎn)用于抗真菌藥劑(特別是抗板栗疫病菌藥劑)的篩選和設(shè)計(jì)中。此外，也可以以該基因核苷酸序列的某一區(qū)段作為探針或作為PCR引物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)在板栗疫病菌中再分離該序列，也可以用于篩選、分離其它真菌的與該基因具有一定序列同源性的序列。
[0020]本發(fā)明證明了低毒病毒侵染導(dǎo)致P5Cdh基因的轉(zhuǎn)錄水平下降。說明P5Cdh基因是低度病毒作用板栗疫病菌使其毒力下降的潛在靶基因。本發(fā)明所提供的P5Cdh的ー個(gè)重要用途是，該基因的轉(zhuǎn)錄與其蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾與定位可以作為重要靶位點(diǎn)用于抗病毒藥劑(特別是抗真菌病毒的藥劑)的篩選和設(shè)計(jì)中。進(jìn)ー步解析該基因參與的致病機(jī)制，從中也可以發(fā)現(xiàn)真菌病毒用于抗真菌藥劑(特別是抗板栗疫病菌藥劑)的篩選和設(shè)計(jì)中。
[0021]應(yīng)用本發(fā)明鑒定或輔助鑒定板栗疫病菌的候選殺菌劑可采用如下方法:以前述蛋白為靶點(diǎn)對檢測物質(zhì)進(jìn)行篩選，將得到的抑制序列所示蛋白表達(dá)的待檢測物質(zhì)作為候選的板栗疫病菌的殺菌劑；或以前述蛋白為靶點(diǎn)對檢測物質(zhì)進(jìn)行篩選，將得到的抑制序列所示蛋白轉(zhuǎn)錄的待檢測物質(zhì)作為候選的板栗疫病菌的殺菌劑；如不能抑制，則待測物質(zhì)為非候選的板栗疫病菌殺菌劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是P5Cdh與其它植物病原真菌中同源蛋白的聚類分析圖。
[0023]圖2是P5Cdh的原核表達(dá)和酶活檢測實(shí)驗(yàn)圖。其中，
[0024]A是蛋白電泳圖:經(jīng)GST sepherose resin純化后獲得的蛋白P5Cdh A 45。
`[0025]B是酶活動(dòng)力學(xué)曲線圖:Lineweaver - Burk雙倒數(shù)作圖法分析重組蛋白GST-P5Cdh A 45的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Vmax和Km ；P5Cdh活性檢測在30°C以0_5mM NAD為底物，于443nm測量產(chǎn)物NADH的濃度，數(shù)據(jù)顯示為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)。
[0026]圖3是P5Cdh基因的敲除研究實(shí)驗(yàn)圖。其中，
[0027]A是基因敲除盒構(gòu)建示意圖:左臂正、反向引物分別為P5Cdh_A(5’ -atttagccgtcgtgacatcttcctc_3，)矛ロ PDCdh_J(5，—tctttctagaggatccccgggtaccggattggatggattgagctgt-3’)，右臂正、反向引物分別為 P5Cdh_2 (5’_atatcatcttctgtcgacctgcaggctatccgagcaatgaggtctg-3’ )和 P5Cdh-B (5，-ggtgtgagagagaaggtggtcgttc-3’ )，擴(kuò)增模板為 EPl55 總 DNA,擴(kuò)增目的片段大小分別為974bp和1038bp。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)正、反向引物分別為 hph_F(5，-cggtacccggggatcctctag-3，)和 hph_R(5，-gcctgcaggtcgacagaagatg-3，)，擴(kuò)增模板為質(zhì)粒PCPXHY2。左、右兩臂及Hph的PCR擴(kuò)增片段通過fusion PCR的方法，左、右兩臂按照上下游順序分別融合到hph的兩側(cè)，構(gòu)成基因置換敲除盒，2145bp的hph置換的是P5Cdh基因的第三個(gè)外顯子區(qū)域1454bp (該區(qū)域演繹的氨基酸殘基含完整的ALDH_F4-17_P5⑶H的功能域)在離第一個(gè)外顯子約1.5kb上游和3’UTR處各有ー個(gè)Hind III酶切位點(diǎn)。[0028]B是Southern blot驗(yàn)證板栗疫病菌P5Cdh基因缺失突變體的構(gòu)建電泳圖:使用探針probel為引物P5Cdh-A/P5Cdh-3擴(kuò)增的左臂片段，使用探針probe2為引物hphF/hphR(5，-agtagatggatccatccact-3，)擴(kuò)增的hph啟動(dòng)子區(qū)域。野生型EP155、出發(fā)菌株Aku80、突變體AP5Cdh和八？50此-(:0111的總0嫩用把11(1111酶切后，電泳順序如下:M:GeneRulerlKb Ladder ；1:EP155 ；2: A ku80 ；3: A P5Cdh ；4: A P5Cdh_com。如 A 圖所示，基因P5Cdh的第三個(gè)外顯子區(qū)域1454bp被hph2145bp置換后，probe I雜交A P5Cdh條帶由雜交 EP155、Aku80 和 AP5Cdh-com 的 3466bp 增大為 4157bp ;probe2 雜交 EP155 和 A ku80無條帶，雜交AP5Cdh條帶為4157bp。
[0029]圖4是P5Cdh基因的缺失株菌落表型和潰瘍斑實(shí)驗(yàn)圖。
[0030]圖中，將EP155、Aku80、EP713、AP5Cdh 和 AP5Cdh_com 于 PDA 光照培養(yǎng) 14 天的菌落表型JfEP155、Aku80、EP713、AP5Cdh和A P5Cdh_com接種休眠板栗樹枝后，于25°C保濕放置30天，對樹枝潰瘍斑進(jìn)行觀察。
[0031]圖5是P5Cdh基因的缺失株產(chǎn)孢量比較圖。
[0032]圖中，對光照培養(yǎng)14天的菌落分生孢子進(jìn)行收集，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。。
[0033]圖6是低毒病毒侵染P5Cdh基因的缺失株表型及低毒病毒抑制P5Cdh基因的轉(zhuǎn)錄水平實(shí)驗(yàn)圖。其中，
[0034]A是菌落表型比較圖:將EP713和A P5Cdh菌絲融合后，將遠(yuǎn)離EP713的AP5Cdh接至PDA光照培養(yǎng)7天的菌落表型。
[0035]B是轉(zhuǎn)錄水平比較圖:提取EP155和EP713的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，引物 P5Cdh-qf(Sj -ttctacatcaactgcaagag-3J)和 P5Cdh-qr(5, -actcttccttcatggtcctc-3>)擴(kuò)增P5Cdh基因的cDNA，通過CP18S rDNA校正后，比較EP155和EP713的P5Cdh基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。
【具體實(shí)施方式】
[0036]以下通過實(shí)施例和附圖進(jìn)一歩詳細(xì)說明本發(fā)明，其中，實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明，均為常規(guī)方法；實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無特別說明，均可通過商業(yè)途徑獲得；百分含量如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
[0037]實(shí)施例l、P5Cdh與其它真菌中同源蛋白的聚類分析
[0038]將P5Cdh 的氨基酸序列輸入 GenBank (http://www.ncb1.nlm.nih.gov)進(jìn)行BlastP檢索，獲得多個(gè)物種同源蛋白的氨基酸序列。JGI344979是板栗疫病菌P5Cdh蛋白，P5Cdh蛋白在其它真菌中的同源蛋白為:XP_003718931來自稻痕菌(Magnaportheoryzae), EGU80836 來自尖抱祿刀菌(Fusarium oxysporum), XP_750764 來自煙曲霉(Aspergillus fumigatus), CAP80517 來自廣負(fù)青霉(Penicillium chrysogenum),XP_001596907 來自核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)。使用 MEGA4.0 軟件的鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建進(jìn)化樹,建樹過程選擇bootstrap檢驗(yàn)1000次,用TREEVIEW進(jìn)行展示。如附圖1所示，P5Cdh與其它植物病原真菌中同源蛋白的聚類分析了該蛋白進(jìn)化的保守性和親緣關(guān)系(圖1 )，與尖孢錸刀菌親緣關(guān)系最近，同源性為69.2%，與核盤菌親緣關(guān)系較近，同源性為69.0%，與稻瘟菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同源性為70.4%，煙曲霉與產(chǎn)黃青霉聚成ー簇，與板栗疫病菌的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，同源性分別為62.8%和62.0%。[0039]實(shí)施例2、P5Cdh的原核表達(dá)及酶活檢測
[0040]I )P5Cdh的原核表達(dá):用軟件MitoPro II預(yù)測P5Cdh信號肽為l_45aa，如實(shí)施例4的 I)和 3)制備 EP155 的總 RNA，合成 cDNA 第一鏈，用引物 P5Cdh-f_Hind III(5’-gcgaagcttatggcttctcgcagggtcagtctcc-3 ノ和 P5Cdh-r-Xba I (b'-gcctctagagacctcattgctcggatactcgac-3’)擴(kuò)增P5Cdh缺失信號肽(l_45aa)的cDNA序列克隆至含GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體PGEX-4T-1的Hind III/Sal I的克隆位點(diǎn)內(nèi)，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T_P5Cdh A 45。將重組質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到大腸桿菌表達(dá)宿主BL21的感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含1OOμ g/mL ampicillin的LA平板上進(jìn)行重組子篩選。獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)電泳分析及酶切鑒定后，對攜帶pGEX-4T-P5Cdh A 45的BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá):將活化的過夜培養(yǎng)物按1%的接種量擴(kuò)大培養(yǎng)于含50 u g/mL ampicillin的LB培養(yǎng)基中，37°C 200rpm培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4 ;加入IPTG至終濃度為0.3mM，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至20°C 200rpm繼續(xù)培養(yǎng)6個(gè)小時(shí)后，即可離心收集菌體。按Ig菌體加入IOml binding buffer重懸菌體,加入Iysozyme至終濃度為0.2mg/ml進(jìn)行4°C緩慢振蕩30min酶解反應(yīng)，于4°C IOOOOrpm離心20分鐘去細(xì)胞碎片。將上清液緩慢加入到Glutathione Sepharose resin預(yù)裝柱內(nèi)，流速控制在lml/min,再次加入IOmlbinding buffer漂洗雜蛋白后，加入1-2倍柱床體積elution buffer進(jìn)行洗脫。目的蛋白預(yù)測分子量約64KD，GST標(biāo)簽蛋白約26KD，則融合蛋白大小預(yù)計(jì)為90KD。將洗脫蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析顯示目的條帶略大于90KD，與預(yù)期大小一致(附圖2A)。不需要切除GST標(biāo)簽，直接進(jìn)行酶活檢測。
[0041]2) P5Cdh的酶活檢測:向目的蛋白加入10倍體積酶液保存buffer進(jìn)行稀釋，用AmiconlOKD超濾管濃縮后，用Bradford方法定量蛋白濃度約為198 y g/ y I,即2.2 y M。酶活反應(yīng)以P5C為反應(yīng)底物，NAD為末端電子受體，根據(jù)檢測一系列的濃度梯度NAD接受P5C傳遞的電子生成NADH，測OD33tl值。以標(biāo)準(zhǔn)品NADH制備標(biāo)準(zhǔn)曲線測得吸光系數(shù)為6.22cm-1mM-1.取反應(yīng)速率V倒數(shù)I/V為縱坐標(biāo)，以底物proline濃度[S]倒數(shù)1/[S]為橫坐標(biāo)作圖，根據(jù)雙倒數(shù)法得出Km值為1.48 + 0.145mM與Vmax值為1.69±0.1lOumol ? s—1，kcat=0.77 ±0.050s-1 (如附圖 2B)。
[0042]實(shí)施例3、P5Cdh基因在板栗疫病菌中的功能研究
[0043]I)敲除盒的構(gòu)建
[0044]基因敲除采用同源重組的方法，用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因替換板栗疫病菌高效同源重組系統(tǒng)中P5Cdh基因的編碼區(qū)，具體策略見附圖2A。左臂正、反向引物分別為P5Cdh_A(5，-atttagccgtcgtgacatcttcctc-3，)矛ロ P5Cdh_3 (5，—tctttctagaggatccccgggtaccggattggatggattgagctgt-3’)，右臂正、反向引物分別為 P5Cdh_2 (5’-atatcatcttctgtcgacctgcaggctatccgagcaatgaggtctg-3，)和 P5Cdh_B (5，-ggtgtgagagagaaggtggtcgttc-3，), f廠增模板為EP155總DNA，擴(kuò)增目的片段大小分別為929bp和1058bp。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)正、反向引物分別為 hph_F(5’ -cggtacccggggatcctctag-3’ )和 hph_R(5’ -gcctgcaggtcgacagaagatg-3’)，擴(kuò)增模板為質(zhì)粒pCPXHY2。通過fusion PCR的方法將左、右兩臂按照上下游順序分別融合到hph的兩側(cè)，構(gòu)成基因置換敲除盒，2145bp的hph置換的是P5Cdh基因的第三個(gè)外顯子區(qū)域1454bp (該區(qū)域演繹的氨基酸殘基含完整的ALDH_F4-17_P5⑶H的功能域)。
[0045]本發(fā)明中采用的Fusion PCR方法如下:[0046]分別回收上下游片段及抗性基因并按摩爾比1: 3: I的比例進(jìn)行融合PCR反應(yīng)。融合PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2min ;94°C變性30sec，58°C退火10min，72°C延伸4min，共進(jìn)行15個(gè)循環(huán)；最后72°C反應(yīng)lOmin。以稀釋10倍后的融合PCR產(chǎn)物I y I為模板，用引物P5Cdh-A/P5Cdh-B按照常規(guī)PCR方法大量擴(kuò)增。獲得的PCR產(chǎn)物為4132bp，經(jīng)こ醇沉淀濃縮至濃度為l_2y g/y L，可直接用于真菌轉(zhuǎn)化。
[0047]2)互補(bǔ)重組質(zhì)粒的構(gòu)建用引物 P5Cdh_F(5’-tgctcaccttgctgctcttggaagt-3’)和P5Cdh_B(5’ -ggtgtgagagagaaggtggtcgttc-3’ )擴(kuò)增包括啟動(dòng)子區(qū)域1.5kb和終止子區(qū)域Ikb的基因全長4343bp，并克隆到含有G418抗性基因的互補(bǔ)載體的平端位點(diǎn)Sma I處。
[0048]3)板栗疫病菌的的轉(zhuǎn)化
[0049]在本發(fā)明中，板栗疫病菌的的轉(zhuǎn)化采用CaCl2/PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化真菌原生質(zhì)體的方法，原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法具體如下:
[0050]a.原生質(zhì)體的制備
[0051]配備溶液 0.6M MgSO4UM Sorbitol、OM soluiton (1.2M MgSO4, IOmM NaH2PO4,pH5.8)、Trapping Buffer (0.4M Sorbitol,0.1M Tris-HCl, pH7.0)、STC (IM Sorbitol,0.1M Tris-HCl pH8.0,0.1M CaCl2),PTC(40%PEG3350,0.1M Tris-HCl,0.1M CaCl2,pH8.0)高壓滅菌后保存于4°C。
[0052]將保存菌種接種至PDA平板，室溫光照培養(yǎng)數(shù)天至菌落半徑2cm，刮取少量菌絲至100ml EP完全培養(yǎng)基中，25°C靜置培養(yǎng)3d后可用于制備原生質(zhì)體。此時(shí)配備酶解液，于50mL OM soluiton加入纖維素酶0.5g、蝸牛酶0.3g及溶菌酶0.2g，過濾滅菌后待用。離心收集菌體，加入30mL0.6M MgSO4漂洗菌體兩次，加入50mL酶解液消化菌體細(xì)胞壁，于280C 200rpm反應(yīng)3_4h至鏡檢觀察到菌絲體形成原生質(zhì)體后，按每管12.5ml酶解反應(yīng)液分裝到50ml corning管中，在液面上緩慢加2倍體積的Trapping Buffer, 3500g4°C離心30分鐘后，用巴氏吸管小心地從兩層液面交界處吸取原生質(zhì)體，并轉(zhuǎn)移至新的corning管中，置冰上；加入2倍體積IM Sorbitol漂洗原生質(zhì)體；重復(fù)一次；用15ml STC漂洗原生質(zhì)體一次；用血球計(jì)數(shù)板對原生質(zhì)體進(jìn)行計(jì)數(shù)，用STC:PTC按4:1的比例重懸原生質(zhì)體，同時(shí)加入DMSO至終濃度為1%，使原生質(zhì)體濃度為8 X IO7-1 X IO8個(gè)/ml以上；按每管100 U I分裝至EP管，置于_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0053]b.板栗疫病菌的轉(zhuǎn)化
[0054]配備再生培養(yǎng)基:200ml再生培養(yǎng)基中含有Casein enzymatic hydrolysate0.2g>yeast extracts0.2g、surcose68.4g、Bacto? Agar3.2g,加熱溶解后高壓滅菌，于轉(zhuǎn)化前 3h加熱溶解，冷卻至50°C后放于46°C溫育待用。
[0055]取2-5 ii g 純化的 DNA 與 I ii I spermidine (IOOmM)混勻后,加入 100 ii I 原生質(zhì)體中，輕輕混勻，冰浴30min ;再加入Iml PTC混勻，室溫放置25分鐘；7000g4°C離心5min ；棄上清，加入500 ill STC輕輕懸浮沉淀，5000g4°C離心Imin ;棄上清，再次加入500 STC輕輕懸浮沉淀，按170 iil/皿均勻點(diǎn)在潔凈無菌的培養(yǎng)皿中，取12ml再生培養(yǎng)基覆蓋，并輕輕搖勻；于28°C培養(yǎng)18-24小時(shí)后，加入12ml含抗生素的再生培養(yǎng)基覆蓋上層，室溫培養(yǎng)3-4天至菌落長出。
[0056]c.抗性轉(zhuǎn)化株的純化
[0057]從再生培養(yǎng)基中挑取的轉(zhuǎn)化株首先要經(jīng)過2-3輪的抗性篩選，使其具有穩(wěn)定的抗生素抗性，然后通過單孢分離或原生質(zhì)體再生進(jìn)行菌株的純化。單孢分離的基本過程是:首先將轉(zhuǎn)化株接種于無抗生素的PDA平板上，光照培養(yǎng)14-21天左右使其產(chǎn)孢，用無菌水或
0.02%Tween80洗下孢子，稀釋不同的濃度后涂于含有抗生素的PDA培養(yǎng)基上，室溫培養(yǎng)3天，挑取單菌落進(jìn)行檢測。
[0058]d.總DNA的提取
[0059]稱取Ig菌體放入研缽中，加足量的液氮充分冷卻，將菌體研磨成粉末，依次加入 5ml 總 DNA extraction buffer (0.1M Tris-Cl[pH8.0], 0.2M NaCI, 4mMEDTA[pH8.0]，2%SDS)和5ml Tris飽和酚，在融化的過程中用研磨杵不斷攪拌使其充分作用。將融化的混合物轉(zhuǎn)入30mL Corning管中，3000g離心40min。吸出上清，加入等體積的苯酚/氯仿、等體積的氯仿各抽提一次。將上清液轉(zhuǎn)至EP管中，加0.7倍體積的異丙醇，混勻后室溫IOOOOg離心8分鐘，倒掉上清液，用預(yù)冷75%こ醇洗沉淀2-3次，自然晾干，カロIOOu IddH2O 或 TE 溶解。
[0060]e.Southern blot
[0061 ] 板栗疫病菌總DNA的酶切、電泳及轉(zhuǎn)膜
[0062]取30-50 u g的基因組DNA，加入Hind III和RNaseA，反應(yīng)總體積400 U 1，37°C酶切8-16h至電泳檢測完全酶切后，こ醇沉淀，溶于50 u I ddH20中；上樣于1.0%的瓊脂糖凝膠在0.5XTBE的緩沖體系中分離酶切產(chǎn)物。倒入脫嘌呤溶液(0.25N HCl)至沒過凝膠，緩慢震蕩15min至溴酚蘭變黃，ddH20漂洗2次；倒入變性液(0.5M NaOH, 1.5M NaCl)至沒過凝膠，緩慢震蕩15min至溴酚蘭變藍(lán)，倒去變性液后重復(fù)一次，ddH20漂洗2次；倒入中和液(1M Tris-Cl, 1.5M NaCl, pH8.0)至沒過凝膠，緩慢震蕩15min后換新的中和液再次緩慢震蕩15min，倒去中和液，加入20XSSC (0.3M檸檬酸鈉，3M NaCl)至沒過凝膠，緩慢震蕩IOmin以上。
[0063]準(zhǔn)備與凝膠同樣大小的尼龍膜I張及濾紙3張，用鉛筆在膜的正面做好標(biāo)記。
[0064]取大于凝膠的容器裝入20XSSC，上邊放ー玻璃板，取一張長的濾紙放在玻璃板上，吸水紙兩端從玻璃板上垂下浸入20XSSC中并完全濕潤，即為鹽橋，在鹽橋上依次鋪放凝膠、尼龍膜、濾紙、吸水紙塔、約Ikg重物，凝膠DNA通過毛細(xì)管作用向上轉(zhuǎn)移至尼龍膜用時(shí)約8h，取下尼龍膜，DNA面朝上放入紫外交聯(lián)儀，以1200J、3min紫外照射固定DNA，尼龍膜晾干待用。如立即進(jìn)行雜交可不用等晾干可直接使用。
[0065]探針的制備
[0066]取15 U I 待標(biāo)記模板 DNA (0.3-1 U g)及 I U 150ng/ U I 的 Ikb ladder marker 至
1.5mLEP管中，沸水浴IOmin使DNA變性，迅速在冰上冷卻；加入4 u I DIG-High prime至變性DNA中，充分混合，37°C溫浴Ih，時(shí)間越長標(biāo)記效率越高，但是不要超過20h。65°C溫育IOmin停止反應(yīng)。
[0067]預(yù)雜交:將尼龍膜DNA面朝上放入雜交筒中，按每IOOcm2尼龍膜加入42°C預(yù)熱的IOmL,42°C轉(zhuǎn)動(dòng)至少 30min。
[0068]雜交:將DIG 標(biāo)記的 I ii I DNA 探針(約 25ng/mL DIG Easy Hyb)加至 49 U I ddH20中，沸水浴5min變性后迅速放到冰水浴中冷卻；將冷卻的探針加入42°C預(yù)熱的DIG EasyHyb (3.5mL/100cm2尼龍膜)中并混勻；倒掉預(yù)雜交液并加入探針/雜交液混合液，雜交爐中輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，42 °C雜交6-20h。[0069]洗膜:在25°C不斷轉(zhuǎn)動(dòng)條件下(雜交爐)，用足量的2XSSC、0.1%SDS洗滌2次，每次5min。在68°C不斷轉(zhuǎn)動(dòng)條件下(雜交爐)，用預(yù)熱到68°C的0.5XSSC、0.1%SDS洗滌2次，每次 15min。
[0070]免疫顯色:下面為IOOcm2雜交膜的免疫檢測過程，所有過程在25°C進(jìn)行，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)。加入 IOOmLwashing buffer,搖動(dòng) l_5min ;倒去 washing buffer,加入 IOOmL Blockingsolution,搖動(dòng) 30min ;倒去 Blocking solution,加入 2OmL Antibody solution,搖動(dòng)30min ;棄去 Antibody solution,加入 IOOmL Washing buffer 搖動(dòng) 15min,重復(fù)一次；加入2OmL Detection buffer搖動(dòng)2_5min ;將膜放入雜交袋，加入ImL CPSD,室溫反應(yīng)5min,吸去多余的CPSD，封ロ，放入37°C IOmin激活顯影反應(yīng)，在暗室中進(jìn)行X膠片壓片，30min后顯影液顯影，定影液定影。掃描圖片保存。
[0071]4)野生型菌株與P5Cdh基因的缺失株生長的比較
[0072]將EP155、A ku80、EP713、A P5Cdh 和 A P5Cdh_com 接到 PDA 平皿上，每個(gè)菌株接種3-5份，于25°C光照培養(yǎng)14天后觀察表型(圖4)，A P5Cdh表型與EP155和A ku80無顯
著差異，色素増加。
[0073]5)野生型菌株與P5Cdh基因的缺失株致病カ檢測實(shí)驗(yàn)
[0074]于每年的1-2月取直徑為5cm左右的板栗樹干，將其余細(xì)枝出去并用蠟封住切ロ，用內(nèi)徑直徑為5mm打孔器與樹枝上打孔，孔深約l-2mm，每孔間隔約10-12cm ;將板栗疫病菌于PDA平板上光照培養(yǎng)2-3d至菌落直徑約為2-3cm，用打孔器取出菌塊轉(zhuǎn)接于板栗樹枝新孔處，每個(gè)菌株接種五份，用封ロ膜封好，保持濕度，將樹干室溫放置30天后，小心將打孔處周圍的樹皮削去，即可觀察到菌塊產(chǎn)生的潰瘍斑，測量潰瘍斑的長短直徑并計(jì)算面積，病斑面積=3.14X病斑長軸半徑X病斑短軸半徑。AP5Cdh的致病斑大小顯著小于EP155和Aku80產(chǎn)生的致病斑(圖4)。
[0075]6)野生型菌株與P5Cdh基因的缺失株產(chǎn)孢量的比較
[0076]將EP155、A ku80、EP713、A P5Cdh 和 A P5Cdh_com 接到 PDA 平皿上，每個(gè)菌株接種3-5份，于25°C光照培養(yǎng)14天后，每皿用IOml0.02%Tween80將分生孢子沖洗下來，于顯微鏡下計(jì)數(shù)。每個(gè)菌株分析數(shù)值至少三個(gè)重復(fù)。所獲得的分手孢子數(shù)量除以菌落面積即為該菌落的單位面積產(chǎn)孢量。突變體AP5Cdh的產(chǎn)孢量(2.51X107±1.03X 106個(gè)/mL)與EP155 (2.08X 107±3.38X 106 f/mL)Δ ku80 (1.79 X 107± 1.63 X IO6 個(gè)/mL)無顯著差異(圖5)。
[0077]實(shí)施例4、低毒病毒抑制P5Cdh基因的轉(zhuǎn)錄
[0078]I)總RNA的提取:將接種于PDA光照培養(yǎng)7d的菌體從培養(yǎng)基上刮下，用吸水紙吸去過多水分。稱取0.5g菌體加足量的液氮研磨成粉末，立即加入準(zhǔn)備好的5ml總DNAextraction buffer和5ml Tris飽和酹的等體積混合物,在溶解的過程中用研磨件不斷攪拌使其充分作用。將融化的混合物轉(zhuǎn)入Corning管中，3500g離心40min。棄上清,加入等體積的苯酚/氯仿、等體積的氯仿各抽提一次。將上清液轉(zhuǎn)至EP管中，加0.7倍體積的異丙醇，混勻后室溫IOOOOg離心8分鐘，倒掉上清液，用預(yù)冷75%乙醇洗沉淀2-3次，自然晾干，加100 ill DEPC處理的ddH20溶解。電泳檢測所得總RNA的質(zhì)量和濃度。
[0079]2) dsRNA 的純化:用 RNase-Free DNase I (Roche)在 25_37°C 消化 15_20min 去除小量殘余總DNA，DNase I的用量是lu/iig DNA，經(jīng)酚/氯仿抽提和乙醇沉淀后，溶于適量的DEPC-H2O中，分光光度計(jì)測定RNA的濃度。用1.0%的瓊脂糖凝膠在IXTAE (40mMTris-HAc, ImM EDTA, pH8.0)的條件下電泳檢測消化后RNA的質(zhì)量。
[0080]3) cDNA 第一鏈的合成:反應(yīng)體系:0.2-2 y g 總 RNA、I u IlOmM primer、加入DEPC-處理水定容至12 Ul ;溫和混勻后短暫離心，置于70°C水浴5min后，立即返回冰浴冷卻，短暫離心后繼續(xù)加入 4u 15Xreaction buffer>2 u IlOmM dNTP> I u I RiboLock?RNaseInhibitor (20U)，溫和混勻后短暫離心，置于37°C水浴5min后，加入Iul RiboLock?HMinus Reverse Transcriptase (200U)并輕輕混勻，42°C溫育 60min, 70°C水浴 5min 終止反應(yīng)。反應(yīng)液置于_20°C保存。
[0081]4)熒光定量PCR反應(yīng)體系如下:稀釋合適倍數(shù)的第一鏈cDNA2iil、10XEx TaqBuffer2.5 u 1>2.5mM dNTPl u l>25mM MgCl20.8 u 1> Primerl (5uM) I u 1> Primer2 (5uM)I ill、20 X SYBG Il ill、Ex Taq0.1 yl，加ddH20至總體積25 yl。將反應(yīng)體系置于熒光定量PCR儀(MJ Opticon II)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件設(shè)置為:94°C預(yù)變性，5min ;按照以下參數(shù)進(jìn)行40-50個(gè)PCR循環(huán):94°C 20sec ;退火20sec ；72°C 20sec ;讀取熒光信號(Plateread)。72°C，5min,從65°C升至95°C，每升溫0.2°C讀取一次熒光信號，從而進(jìn)行熔解曲線分析(Melting curve analysis)。所有反應(yīng)重復(fù)三次，以C(t)平均值計(jì)算結(jié)果,在擴(kuò)增效率處于80-105%范圍內(nèi)，使用2_AAG(t)方法驗(yàn)證相對基因表達(dá)差異。經(jīng)過三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明EP713中P 5Cdh基因表達(dá)量僅為EP155的8.5%，下調(diào)了 10倍多(圖6)。
【權(quán)利要求】
1.一種板栗疫病菌致病力基因P5Cdh，其特征在于具有序列表SEQ.1D.N0.1的堿基序列，或者具有編碼序列表SEQ.1D.N0.3氨基酸序列的堿基序列。
2.與權(quán)利要求1所述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh具有50%以上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的喊基序列。
3.權(quán)利要求1所述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh或其缺失、突變或修飾后的基因在控制板栗疫病菌致病中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh中任一區(qū)域堿基序列設(shè)計(jì)的引物通過PCR擴(kuò)增用于檢測在化合物處理狀況下P5Cdh基因的表達(dá)。
5.權(quán)利要求1所述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh的cDNA，其特征在于具有序列表SEQ.1D.N0.2的堿基序列，或者具有編碼序列表SEQ.1D.N0.3氨基酸序列的堿基序列。
6.權(quán)利要求1所述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh編碼的蛋白質(zhì)或其同源蛋白，其特征在于具有序列表SEQ.1D.N0.3或SEQ.1D.N0.4、SEQ.1D.N0.5的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求6所述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh編碼的蛋白質(zhì)或與其有40%以上一致性的同源蛋白，其特征在于:所述氨基酸序列經(jīng)過不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和或缺失和或添加。
8.權(quán)利要求6所述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh編碼的蛋白質(zhì)或與其有40%以上一致性的同源蛋白為靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求6所述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh編碼的蛋白質(zhì)或與其有40%以上一致性的同源蛋白中任一區(qū)域氨基酸序列設(shè)計(jì)的多肽制備抗體用于檢測在化合物處理狀況下P5Cdh蛋白的表達(dá)。
10.一種治療板栗疫病的方法，其特征在于阻斷或抑制板栗疫病菌的P5Cdh的表達(dá)。
【文檔編號】A01P3/00GK103451204SQ201310233261
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月13日
【發(fā)明者】陳保善, 姚姿婷, 鄒承武, 周輝, 王金子, 盧立丹, 李洋 申請人:廣西大學(xué)