本發(fā)明涉及分子標記，具體地說，涉及一種與白葉枯病抗性基因緊密連鎖的SNP分子標記。
背景技術：
：水稻白葉枯病菌具有生理小種專化性，品種的抗性基本上都是受核基因組中的主效抗性基因控制，自世紀年代日本科學家利用黃玉和蘭泰耶瑪斯與金南風雜交后代分析其對日本菌群抗性反應，鑒定出并命名個顯性抗性基因后，有關水稻白葉枯病抗性基因的鑒定與發(fā)掘研究就沒停止過。1975年以后，國際水稻研究所(用菲律賓生理小種先后鑒定出個抗病基因(章琦，2007)。其他國家科研人員也相繼鑒定出一批抗性基因，但由于各國科學家使用的菌系不同，其鑒定結果缺乏國與國之間的可比性，在一定程度上影響到這一研究領域的進展。因此從1982年開始，IRRI與日本科學家開始合作進行白葉枯病基因鑒定工作，創(chuàng)建了水稻白葉枯病抗性基因鑒別系統(tǒng)，到1987年確認了Xa1、Xa2、Xa3、Xa4、Xa5、Xa6、Xa7、Xa8、Xa10、Xa11、Xa12等11個抗性基因的存在(Ogawaetal.,1987)。隨后有更多的基因被鑒定、定位與克隆。截至到目前，已確認和報道的白葉枯抗性基因有38個，命名排序至Xa38(虞玲錦等，2012；國家水稻數據中心)。其中有26個為顯性基因，其余為隱性基因；已經被定位的有26個，其中有8個基因已被克隆，分別為Xa1、Xa5、Xa27、Xa13、Xa3/Xa26、Xa4、Xa21和Xa23(王春連，2006；裴慶利等，2011；國家水稻數據中心)。目前，育種家們通過分子標記輔助選擇(molecμLarassistedselectoin，MAS)，已利用Xa4、Xa21和Xa23選育出了許多抗病恢復系品種，如IR26、IR28、IR30、IR32、IR36、IR50、IR54等。國內大面積種植的雜交稻中大多含有Xa4基因，不過長期大面積地使用單一抗源已經導致了新致病菌株的進化，雜交稻抗病的持久性得不到保證。Xa7基因源于孟加拉稻種DV85和DV86，是一個具有廣譜抗性的顯性抗白葉枯病基因，國際水稻所將DV85與IR24回交，構建了含Xa7的近等基因系IRBB7；我國一個強優(yōu)恢復系水稻品種“鎮(zhèn)恢084”以91-2156為母本，與由DV85選育的抗病品系R19雜交而成，該品種也帶有Xa7基因。因此，利用MAS等現代育種技術，將Xa7基因導入主栽的雜交稻恢復系中，有望大大提高我國水稻的抗病性和生產安全。然而，由于Xa7基因還沒有被克隆，無法設計基因功能標記。以致在傳統(tǒng)水稻育種中抗白葉枯病基因Xa7未得到較好的利用。因此，當前仍需進一步探索新的白葉枯病抗性基因緊密連鎖的分子標記，從而為加快水稻抗病遺傳基礎和抗病育種研究提供技術支撐。技術實現要素：為了解決現有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供與白葉枯病抗性基因Xa7緊密連鎖的SNP(singlenucleotidepolymorphism)分子標記K_060569和K_060570及其應用。為了實現本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術方案如下：第一方面，本發(fā)明提供了一種與白葉枯病抗性基因Xa7緊密連鎖的SNP分子標記K_060569，其序列如SEQIDNo.1所示，第61bp位點處的堿基為C或G。本發(fā)明還提供了一種與白葉枯病抗性基因Xa7緊密連鎖的SNP分子標記K_060570，其序列如SEQIDNo.2所示，第61bp位點處的堿基為G或A。本發(fā)明經試驗研究發(fā)現，上述分子標記與白葉枯病抗性基因Xa7緊密連鎖，含Xa7基因的水稻品種在K_060569測試位點檢測結果均為堿基C，且在K_060570測試位點檢測結果均為堿基G；18個不含Xa27水稻品種無論是其他抗白葉枯基因供體還是普感材料均未在K_060569和K_060570測試位點分別檢測出堿基C和G。第二方面，本發(fā)明分別針對前述分子標記提供了利用KASP反應可高通量的對水稻材料進行Xa7抗性基因檢測的引物組合，如表1所示：表1標記序列表進一步地，含有上述引物組合的試劑或試劑盒也在本發(fā)明的保護范圍之內。進一步地，本發(fā)明提供了所述引物組合在檢測白葉枯病抗性基因Xa7中的應用。具體包括如下步驟：S1、提取水稻樣品基因組DNA；S2、以水稻基因組DNA為模板，利用某一分子標記對應的引物組合進行KASP反應檢測；其中，兩條特異性引物分別連接不同的熒光序列；S3、若只檢測到引物PrimerY所連熒光序列對應的熒光信號，則判斷水稻樣品為攜帶白葉枯病抗性基因Xa7的純和型；若只檢測到引物PrimerX所連熒光序列對應的熒光信號，則判斷水稻樣品為不攜帶白葉枯病抗性基因Xa7的純和型；若同時檢測到兩種熒光，則判斷水稻樣品為攜帶白葉枯病抗性基因Xa7的雜合型。所述熒光序列可為本領域常規(guī)使用的熒光序列，優(yōu)選兩個熒光顏色差異大的熒光序列。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，選擇使用FAM和VIC熒光序列分別連接在兩條特異性引物的5’端。上述應用的實質為該分子標記的檢測方法。其中，PCR反應程序與體系可采用本領域常規(guī)技術，本發(fā)明對此不另作限定。第三方面，本發(fā)明還提供了前述分子標記在水稻抗病性輔助育種中的應用，利用前述方法分子標記的檢測方法對該分子標記進行檢測，選擇攜帶白葉枯病抗性基因Xa7的水稻樣品進行后續(xù)育種。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了兩個與白葉枯病抗性基因Xa7緊密連鎖的SNP分子標記，可用于Xa7基因的鑒定及輔助選擇育種，對促進Xa7基因在商業(yè)化育種中的應用具有重要意義白葉枯病抗性基因Xa7具有高抗、廣譜、持久的特點，但由于還沒有被克隆，無法設計基因功能標記。本發(fā)明應用KASP技術對所尋找到的SNP分子標記進行基因分型，可以快速、精確的檢測Xa7基因，大幅提高基因轉育的效率。且檢測過程不需要酶切、電泳及測序等，操作簡便，利于高通量快速檢測，徹底杜絕了PCR產物的氣溶膠污染和EB對環(huán)境的污染、甲醛對人體的危害。附圖說明圖1為利用分子標記K_060569檢測自然群體分型圖。圖2為利用分子標記K_060570檢測自然群體分型圖。圖3為分子標記K_060569與分子標記K_060570的染色體定位。具體實施方式下面將結合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領域的技術人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1本實施例用于說明本發(fā)明提供的分子標記在檢測白葉枯病抗性基因Xa7中的應用，具體步驟如下：1、針對本發(fā)明所述的分子標記設計利用KASP反應可高通量的對水稻材料進行Xa7抗性基因檢測的引物組合，如表1所示。2、采用簡化CTAB法，從水稻葉片中提取基因組DNA。①取樣放入2.0mLTube中，預先加入兩粒鋼珠和750μLCTAB溶液，震蕩勻漿樣品1.5min；②65℃震蕩加熱0.5-1h；③冷卻至室溫，在通風櫥中加入750mL氯仿︰異戊醇(24︰1)溶液混勻；④12000rmp離心10min，取上清約500mL轉移至新的1.5mL離心管中；⑤加入等體積異丙醇溶液輕搖混勻，于-20℃沉淀1小時以上，12000rmp離心10min，去上清；⑥加入1000mL70％乙醇，輕彈沉淀，1000rmp離心3min，去上清；⑦加300μLH2O過夜溶解備用。3、KASP反應測試：KASP反應測試在LGCSNPline基因分型平臺上進行。在微孔反應板中加入20ngDNA樣品，烘干后加入KASP反應混合液，反應體系見表2。表2KASP檢測的反應體系終濃度體積(μL)100UMPrimerC0.42UM0.0125100UMPrimerX0.17UM0.0050100UMPrimerY0.17UM0.00502xKASPMasterMix1x1.4792超純水1.4983總體積3PCR擴增在水浴熱循環(huán)儀中完成，TouchdownPCR反應條件為：94℃預變性15分鐘；第一步擴增反應，94℃變性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10個循環(huán)，每個循環(huán)退火及延伸的溫度降低0.8℃；第二步擴增反應，94℃變性20秒，57℃退火并延伸60秒，26個循環(huán)。反應完成后利用掃描儀Pherastar對KASP反應產物進行熒光數據讀取，熒光掃描的結果會自動轉化成圖形。本發(fā)明中使用的LGCSNPline基因分型平臺與其配套試劑耗材均購于英國LGC公司。用標記K_060569和K_060570對已知含Xa7基因的水稻品種的水稻品種IRBB7、DZ78、DV85、華恢1437、華恢1337共5份基因供體材料和其它已知不含Xa7的18個水稻品種進行KASP初篩反應驗證，結果如表3。含Xa7基因的水稻品種在K_060569測試位點檢測結果均為堿基C，且在K_060570測試位點檢測結果均為堿基G；18個不含Xa7水稻品種無論是其他抗白葉枯基因供體還是普感材料均未在K_060569和K_060570測試位點分別檢測出堿基C和G。表3SNP標記K_060569和K_060570KASP反應測試結果為檢測本發(fā)明中標記的特異性和實用性，利用190份材料對SNP標記K_060569和K_060570進行自然群體驗證。190份材料中包括已知含純合Xa7基因的品種、Xa7基因的F1單株、Xa7基因的F2單株、含有其他抗白葉枯供體、普感材料、常見雜交稻和核心水稻育種材料。標記在自然群體分型結果如圖1和圖2所示，2個標記檢測結果高度一致，6份已知含Xa7基因的品種檢測為具有白葉枯抗性的純合Xa7基因型，6份Xa7基因的F1單株檢測出雜合Xa7基因型，10份Xa7基因的F2單株檢測出基因型分離，含有其他抗白葉枯供體、普感材料和核心水稻育種材料均檢測為無白葉枯抗性純合xa7基因型，常見雜交稻中少數出檢測出雜合Xa7基因型。可見，SNP標記K_060569和K_060570檢測Xa7基因位點為高特異性的抗性位點，可便捷高效的用于鑒定水稻品種中是否含有Xa7基因。實施例21、分子標記的遺傳位置驗證利用9個在父母本中具有多態(tài)性的全基因組標記以及本發(fā)明中的兩個與Xa7連鎖標記進行遺傳位置驗證，本發(fā)明的兩個與Xa7連鎖的分子標記均被定位到6號染色體82.7cM位置，如圖3所示。2、分子標記的表型驗證利用120株供體親本華1228S和輪回親本R608的F2雜交群體對本發(fā)明中的兩個與Xa7連鎖標記進行遺傳表型驗證。在水稻孕穗期，對F2群體120個單株及2個親本品種接種廣東白葉枯病菌株GD1358，21天后調查病情，表型數據與基因型一致性在90％以上，再次驗證了本發(fā)明的可行性和準確性。選取極抗的50個單株提取DNA，經兩個SNP標記分別檢測，所有極抗單株均表現為抗病基因型或雜合基因型，選擇效率達到100％。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。序列表<110>華智水稻生物技術有限公司<120>一種與白葉枯病抗性基因Xa7緊密連鎖的SNP分子標記及其應用<130>KHP161117612.2<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>121<212>DNA<213>K_060569<220><221>misc_feature<222>(61)..(61)<223>sisg,orc<400>1cctgaatcaataaaactagctgacatgcatcttcacattacttagaatttagaaacggat60sttcaatcgcaaataggatgttcttcaatcacaaaaggagtagtcaacattagctggtac120a121<210>2<211>121<212>DNA<213>K_060570<220><221>misc_feature<222>(61)..(61)<223>risg,ora<400>2ctggctacagctagattgcttcaaaaacgacctgtcgttgctgtaatttatttgctcaac60rtagtattgtcattttaaaacctttcgtacaaatatttattatggccttatgggcataac120c121<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3acatcctatttgcgattgaac21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4acatcctatttgcgattgaag21<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5gctgacatgcatcttcacat20<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>6gctgtaatttatttgctcaacg22<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>7tgctgtaatttatttgctcaaca23<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8atgcccataaggccataata20當前第1頁1 2 3