疣粒野生稻bZIP1基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種疣粒野生稻bZIPl基因，具體包含一個(gè)來(lái) 源于疣粒野生稻的抗白葉枯病相關(guān)基因的分離克隆和功能分析，尤其涉及疣粒野生稻DNA 序列和該DNA序列對(duì)水稻對(duì)白葉枯病抗性的影響。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是人類(lèi)最重要的糧食作物之一，高產(chǎn)一直是水稻育種選擇的重要農(nóng)藝性狀， 也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)追求的主要目標(biāo)。然而，水稻的產(chǎn)量往往受到生物或者非生物逆境的影響。白 葉枯病，由黃單胞桿菌(Xanthomonasoryzaepv.0ryzae，Xoo)引起，是一個(gè)嚴(yán)重的全球性 水稻病害。水稻是亞洲許多國(guó)家的主要糧食，因此水稻白葉枯病對(duì)亞洲國(guó)家糧食生產(chǎn)的威 脅尤為嚴(yán)重（Singhetal. 2001;Centuryetal. 1999)，該病害也一直是影響我國(guó)水稻高 產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的一個(gè)重要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在發(fā)病較重的年份和地區(qū)該病引起的水稻減產(chǎn)高達(dá)50% 甚至絕收(章琦等，2007)。實(shí)踐表明，使用抗病品種是防治白葉枯病最經(jīng)濟(jì)有效且環(huán)境影響 小的技術(shù)措施。但是，由于白葉枯病生理小種變異頻繁，新的抗性品種在種植幾年后往往又 會(huì)變?yōu)橐赘?Hulbertetal.2001)。例如，日本的抗病品種"朝風(fēng)"，在種植后不久就遭遇當(dāng) 地毒性菌株的侵襲，另外在韓國(guó)、印度、菲律賓和我國(guó)南方部分稻區(qū)也發(fā)現(xiàn)有能侵染帶Xa21 抗病基因水稻的毒性囷株(Goeletal.，1998;Leeetal.，1999;曾列先等，2002;姬廣海 等，2003)。因此，挖掘利用新的抗病基因資源，拓展抗病基因資源;研究相關(guān)抗病機(jī)理，提升 和延展抗病基因的功能，成為目前水稻抗病育種的重要研究?jī)?nèi)容。
[0003]由于自然選擇的結(jié)果，野生稻對(duì)環(huán)境適應(yīng)性要遠(yuǎn)高于栽培稻，對(duì)水稻各種病害具 有較好的抗性(BrarandKhush1997)。野生稻遺傳資源在水稻育種工作已經(jīng)起到了很多 積極的作用。由于眾多學(xué)者的不懈努力，多個(gè)來(lái)源于野生稻的白葉枯病抗性基因已被定位 或克隆，包括來(lái)源于普通野生稻（OrizarufipogonGriff.)的Xa23(Zhangetal.1996)， 小粒野生稻（O.minuta)的Xa27(Amante_Bordeosetal.l992;Wuetal.2008)，藥用野生 稻O.officinalis的Xa29(Tanetal.2004)和普通野生稻的Xa30(Jinetal.2007)等。來(lái) 源于長(zhǎng)雄蕊野生稻(〇·longistaminata)的Xa21基因（Songetal· 1995)更是被廣泛的應(yīng)用 于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和基礎(chǔ)科學(xué)研究。疣粒野生稻為GG組，和普通栽培稻的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(Brarand Khush1997)。研究表明，其對(duì)白葉枯病的抗性非常高（章琦，1994)。通過(guò)多年研究，我們確 定了多個(gè)來(lái)源于疣粒野生稻的抗白葉枯病候選基因，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證。結(jié)果顯示，其中 一基因的能顯著影響水稻對(duì)白葉枯病的抗性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的正是為了克服上述技術(shù)的不足，而提供一種疣粒野生稻bZIPl基因。
[0005]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供疣粒野生稻中分離的OmbZIPl基因，本發(fā)明的第二個(gè) 目的是提供了增強(qiáng)水稻對(duì)白葉枯菌抗性的新方法。這種方法包括將OmbZIPl基因與能夠表 達(dá)雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)的載體、轉(zhuǎn)入水稻以提高水稻對(duì)白葉枯病抗性的方 法。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)完成的。這種疣粒野生稻bZIPl基因，其DNA 序列是SEQIDN0:1所示的DNA序列，或者基本上相當(dāng)于SEQIDN0:1的DNA序列。OmbZIPl總 長(zhǎng)1413bp(堿基對(duì)）。其中最前端AGT為起始符，根據(jù)三聯(lián)體密碼規(guī)則計(jì)算，最后三個(gè)字符TAA 為終止符，可見(jiàn)是個(gè)完整的基因。
[0007]疣粒野生稻bZIPl基因作為增強(qiáng)水稻對(duì)白葉枯病抗性中的應(yīng)用。
[0008]所述的DNA序列與適合啟動(dòng)子連接，能夠使水稻產(chǎn)生雙鏈RNA。
[0009] 本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明克隆并堅(jiān)定了疣粒野生稻中一基因（OmbZIPl)，該基 因和栽培稻中的一bZIP型轉(zhuǎn)錄因子高度同源。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)，該基 因的能影響水稻對(duì)白葉枯病的抗性，增強(qiáng)了水稻對(duì)部分白葉枯小種的抗病。
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1.是具有OmbZIPl基因遺傳背景的To代材料。采用Ubiquitin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的OmBBRl基因轉(zhuǎn)入石首白毛。To代轉(zhuǎn)基因材料RT鑒定顯示，OmBBRl基因表達(dá)均較強(qiáng)。而OmBBRl 的轉(zhuǎn)基因生長(zhǎng)較矮小且育性下降;接種白葉枯菌后OmBBRl轉(zhuǎn)基因材料顯示出較高的抗性。 [0011] 圖2.是具有OmbZIPl基因亞細(xì)胞定位。35s啟動(dòng)子表達(dá)sGFP: 融合蛋白主要 定位于細(xì)胞核內(nèi)；Ubiquitin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的融合蛋白的也主要定位于細(xì)胞核內(nèi)。
[0012] 圖3.是具有OmbZIPl自身互作。BiFC互作載體的結(jié)構(gòu)示意圖，nYFP: 融合蛋 白和cYFP: :OmBBRl融合蛋均采用35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá);共轉(zhuǎn)化煙草的瞬時(shí)實(shí)驗(yàn)顯示OmBBRl蛋白具有很強(qiáng)的自身互作，互作位點(diǎn)位于細(xì)胞核中。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0014] 實(shí)施例1:
[0015] 1.疣粒野生稻OmbZIPl基因的克隆
[0016] 1.1.疣粒野生稻RNA制備
[0017] ⑴試劑：
[0018] Solution I連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技 有限公司；DNA片段回收試劑盒購(gòu)自Promega公司；限制性?xún)?nèi)切酶和cDNA第一鏈合成試劑盒 購(gòu)自NEB公司；TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；高保真DNA聚合酶購(gòu)自Τ0Υ0Β0公司；IPTG (Isopropyl-l thio-P-galactoside，異丙基-硫代-β-D-半乳糖昔）；X_gal (5_brom〇-4-chlor〇-3_indolyl-0-D-galactoside，5_溴-4-氯-3-吲噪-β-硫代半乳糖苷）；卡那霉素 (Kanamycin，Kan);氨節(jié)青霉素(Ampici 11 in，Amp);鏈霉素（streptomycin，Str);液氮;二乙 基焦碳酸酯（diethylprocarbonate DEPC);無(wú)水乙醇；氯仿；異丙醇;Na2EDTA;冰醋酸；甘 油;胰蛋白胨;酵母浸膏;NaCl;瓊脂
[0019]由上海英俊生物技術(shù)有限公司（Invitrogen)和生工生物工程(上海)有限公司進(jìn) 行引物合成。
[0020] (2)儀器：
[0021] 超凈工作臺(tái)、手術(shù)刀、250ml三角形燒瓶、移液槍、恒溫干燥箱、槍頭、高壓滅菌鍋、 研缽、制冰機(jī)、小勺、一次性塑料手套、恒溫培養(yǎng)箱、電泳儀、接種針、離心管、酒精燈、PCR儀、 臺(tái)式低溫離心機(jī)、超低溫冰箱、-20°C冰箱、4°C冰箱、水浴鍋、小型電泳裝置、超微量分光光 度計(jì)、培養(yǎng)皿、恒溫?fù)u床、渦旋儀、高壓滅菌鍋等。
[0022] (3)相關(guān)軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)：
[0023] 引物設(shè)計(jì)米用Oligo6Demo,序列分析比對(duì)米用VectorNTIAdvance10和DNA STAR-LesergeneV6，序列同源性分析在NCBI(http://www·ncbi·nlm·gov/)和RAP·DB (http://rapdb·dna·affrc·go·jp/)上進(jìn)行。
[0024] 1.2.材料、菌株與載體
[0025] 植物材料為疏粒野生稻(Oryzameyeriana)。大腸桿菌菌株(Escheichiacoli， DH5a)，農(nóng)桿菌菌株(Agrobacteriumtumefaciens，EHA105)和酵母菌株(Y2HGold)以及水稻 白葉枯菌(Xanthomonas<^}^36。￥.(^5^36，乂〇〇)菲律賓生理小種？10為本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0026] 1.3.總1?熟的提取
[0027] 疣粒野生稻生長(zhǎng)條件為：溫度28-32°C，濕度：60-80 %，光照250micromol/m2 ·s白 光，光周期為12h/d。
[0028] (1)按樣品數(shù)量準(zhǔn)備好RNaseFree的2mlEP管，并放入高溫烘烤過(guò)的震蕩用玻璃 珠；
[0029] (2)選取鮮嫩幼葉75mg，放入2mlEP管中（14天苗嶺苗和2mlEP管等長(zhǎng)葉片約 25mg，故取等管長(zhǎng)的葉片3段），立即放入液氮冷凍；
[0030] (3)將震蕩適配器用液氮預(yù)冷，再將取樣用的2mlEP管放入配器，安裝并鎖緊適配 器后，25Hz震蕩1.5min;
[0031] (4)每管(75mg組織）加lmlTRIzo1試劑(添加TRIzol時(shí)，要保證樣品低溫，切莫同時(shí) 從液氮中取出多管樣品，導(dǎo)致樣品升溫降解。每次從液氮保存罐中取出1~2管樣品，加 TRIzo1后立即晃動(dòng)，直至TRZo1融化并和樣品完全混勻）；
[0032] (5)勻漿后，室溫(氣溫低時(shí)用25°C金屬浴)放置5min;
[0033] (6)每管樣品加氯仿0.2ml(按每mlTRIzol加0.2ml氯仿計(jì)），手工振蕩15秒；
[0034] (7)室溫(氣溫低時(shí)用25°C金屬浴)靜置5分鐘后，4°C，12000g，15min(此步驟離心 后，要格外小心）；
[0035] (8)用20〇111槍頭緩緩吸取上清（一般為0.51111)到一新的1?^86?代6的1.5111找？管 (離心后的EP管要盡量輕拿輕放，移液時(shí)絕對(duì)不要碰到中間的蛋白層，液面越接近蛋白層， 移液速度越要慢，以免因液體流動(dòng)激起中間的蛋白層，如無(wú)把握，可以少吸取一些上清）， [0036] (9)可選步驟(建議操作）：加等體積的氯仿異戊醇(一般為0.5ml)，手工振蕩15秒， 靜置5min后，4°〇，1200(^，1〇111；[11離心，取上清無(wú)色水相（一般為0.5ml)到RNaseFree1.5mlEP管(注意事項(xiàng)與前一步一樣，離心后的EP管盡量輕拿輕放，移液時(shí)，不要碰到中間的 蛋白層，移液速度要慢，以免激起中間的蛋白層，如無(wú)把握可以少吸取一些上清）；
[0037] (10)加等體積的異丙醇(一般為0.5ml)，顛倒數(shù)次混勻，室溫(氣溫低時(shí)用金屬?。?靜置十分鐘；
[0038] (11 )4°C，，12000g，10min，離心?？梢?jiàn)總RNA在官底的白色沉淀，棄去上清；
[0039] (12)吸干殘留的異丙醇。調(diào)整移液器到200L刻度，用槍頭吸取約180L75%乙醇， 再吸取約20ul空氣，輕輕攪動(dòng)的RNA粘在槍頭上，以減少RNA損失；
[0040](13)補(bǔ)充加入75%乙醇lml，顛倒混勻數(shù)次后，4°C，7500g，5min，離心。
[0041] (14)重復(fù)上訴洗滌步驟；
[0042] (15)去上清，用200L槍頭盡量吸干液體，真空干燥沉淀5~10分鐘（用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 時(shí)，不要開(kāi)離心功能，30°C抽干約5分鐘時(shí)，可見(jiàn)殘留液體逐漸減少，RNA由白色變?yōu)橥该?，?時(shí)為最佳干燥效果。如果繼續(xù)干燥則會(huì)由透明變白，導(dǎo)致RNA難溶，且導(dǎo)致0D260/280〈1.6);
[0043] (16)加DEPC水 20 ~30L，溶解總RNA;
[0044] (17)測(cè)0D值跑電泳確認(rèn)RNA質(zhì)量，加入后繼續(xù)步驟或_80°C凍存。
[0045] 1.4.RNA的逆轉(zhuǎn)錄
[0046] (1)引物設(shè)計(jì)：
[0047] 以提取的水稻總RNA為模板，參照invitrogenTMM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn) 錄。在RNAase-Free的PCR管中加入以下成分。
[0049] 將加入上訴混合物的PCR管置于65°C，5min后，迅速置于冰上5-10min。加入以下成 分lOxbuffer2.5L，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶lL，RNaseOUT?核酸酶抑制劑0.5L，Nuclease-Free Water2.5L至最終體積為20L?；靹蚝笤?2°C放置lh，然后在90°C加熱lOmin來(lái)終止反應(yīng)。將 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放于_20°C，保存?zhèn)溆谩?br>[0050] 依據(jù)0SWRKY7基因的0RF序列用軟件01 igo設(shè)計(jì)引物，用于PCR擴(kuò)增。引物由生工公 司合成。
[0051]
[0052] (2)PCR擴(kuò)增
[0053]以疣粒野生稻cDNA為模板，PCR擴(kuò)增⑶S序列。擴(kuò)增體系參考KODFXDNA聚合酶說(shuō) 明書(shū)，體系如下
[0055]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變