專利名稱：控制水稻散穗基因pac1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來源于普通野生稻的調(diào)控水稻穗型的基因PACl及其蛋白，以及在水稻穗型調(diào)控中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是重要的糧食作物，我國雜交水稻在生產(chǎn)上的成功應(yīng)用大幅度提高了水稻產(chǎn)量，為我國和世界糧食生產(chǎn)的安全做出了巨大貢獻(xiàn)。然而，雜交水稻的制種成本，尤其是雜交種的產(chǎn)量較低的現(xiàn)狀，是進(jìn)一步提高水稻雜種優(yōu)勢經(jīng)濟(jì)效益的限制因子之一。野生稻中雖然有高產(chǎn)、抗病等基因，但是不利基因的含量也較高，難于直接利用。目前已從野生稻中定位到高產(chǎn)、抗病、抗蟲、耐旱、耐冷等有利于水稻品種改良的基因。同時(shí)篩選出攜帶控制株型等基因、表型優(yōu)良的野生稻滲入系材料，拓寬了水稻種質(zhì)資源。水稻株型影響產(chǎn)量，最好的先例是著名的半矮桿基因sd-Ι在生產(chǎn)上的利用解決了水稻倒伏難題，從而使水稻單產(chǎn)大幅度提高。穗型是理想株型的重要內(nèi)容，理想的穗型能顯著提高水稻產(chǎn)量。野生稻(0.rufipogon Griff)馴化為栽培稻(0.sativa L)的過程中，許多形態(tài)和生理性狀發(fā)生深刻的改變。其中，生殖方式由野生稻的異花授粉轉(zhuǎn)變成栽培稻的自花授粉，這一轉(zhuǎn)變是由于水稻穗形態(tài)和穎花結(jié)構(gòu)的改變引起的。栽培稻與其祖先野生稻相比，穗型由松散變緊湊，花藥變小，柱頭外露率降低。這些性狀降低了花粉散發(fā)以及柱頭接收花粉的能力，從而降低了異花授粉的幾率。然而，這些有利于異花授粉的性狀可以用來改良恢復(fù)系和不育系，從而提高雜交水稻的制種產(chǎn)量。因此控制這些性狀的相關(guān)基因的遺傳及分子機(jī)理研究一直是水稻遺傳育種的熱點(diǎn)。相關(guān)基因的克隆具有重要的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。野生稻散穗表型有利于花粉散布，而且遺傳基礎(chǔ)比較簡單。然而，到目前為止，尚未有控制這些性狀的基因克隆的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種來源于水稻的PACl (Panicle ArchitectureControl I)蛋白的新用途。本發(fā)明所提供的新用途為來源于水稻的PACl蛋白在調(diào)控水稻穗型性狀中的應(yīng)用，具體為由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在調(diào)控水稻穗型性狀中的應(yīng)用。PACl蛋白在水稻中高表達(dá)，水稻穗型為散穗。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育具有散穗性狀轉(zhuǎn)基因水稻的方法。該方法包括如下步驟:將由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)肽康乃局?，得到表達(dá)所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因水稻，所述轉(zhuǎn)基因水稻與所述目的水稻相比穗型松散。所述蛋白質(zhì)的編碼基因(PACl)的編碼區(qū)序列為序列表中序列I。其中， 序列I由1251個(gè)核苷酸組成；序列2由416個(gè)氨基酸組成。
所述蛋白質(zhì)的編碼基因PACl通過含有所述編碼基因PACl的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的水稻中。所述重組表達(dá)載體為將所述編碼基因PACl插入植物超表達(dá)載體中，得到的表達(dá)所述編碼基因PACl的重組載體。所述重組表達(dá)載體中啟動所述編碼基因PACl轉(zhuǎn)錄的啟動子可為Ubi組成型啟動子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組表達(dá)載體具體為將所述編碼基因PACl插入植物表達(dá)載體PCAMBIA1301的多克隆位點(diǎn)Kpn I和Spe I之間，得到表達(dá)所述編碼基因PACl的重組載體(PCAMBIA1301-PAC1)。通常情況下，所述目的水稻為穗型緊湊的水稻，如栽培稻中花17。本發(fā)明的另一 個(gè)目的是提供一種蛋白質(zhì)，名稱為PACl (Panicle ArchitectureControll),來源于水稻，為下述I)或2):I)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有調(diào)控水稻穗型功能的由I)衍生的蛋白質(zhì)。編碼上述PACl蛋白的基因(PAC1基因)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述PACl基因?yàn)槿缦翴)或2)的DNA分子:I)編碼序列是序列表中序列I的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與上述I)所限定的DNA分子雜交，且編碼所述PACl蛋白的DNA分子。實(shí)驗(yàn)證明，由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)能夠使水稻穗型變得松散，利于提高異交結(jié)實(shí)率，進(jìn)而提高雜交水稻制種產(chǎn)量。


圖1為以云南元江野生稻為供體，栽培稻特青為受體構(gòu)建得到染色體片段代換系YIL31的結(jié)果。其中，A為三種水稻的稻穗的表型，I為云南元江野生稻的稻穗表型(散穗)，2為栽培稻特青的稻穗的表型(緊穗)；3為染色體片段代換系YIL31的稻穗表型(散穗)。B為染色體片段代換系YIL31的基因型圖示。圖2為PACl基因的精細(xì)定位圖。其中，A為利用滲入系群體的初步定位結(jié)果；B為利用2400個(gè)隱性單株對PACl基因進(jìn)行的定位，目標(biāo)基因PACl被定位在分子標(biāo)記76.8和SP33之間大約26kb區(qū)間內(nèi)。圖3為實(shí)時(shí)定量PCR檢測穗發(fā)育及抽穗時(shí)PACl基因在YIL31和特青中的表達(dá)量結(jié)果。其中，I表示抽穗前10天的檢測結(jié)果；2表示抽穗當(dāng)天的檢測結(jié)果；3表示抽隨后10天的檢測結(jié)果。圖4為T1代PACl轉(zhuǎn)基因中花17主莖穗的表型。其中，A為T1轉(zhuǎn)入pCAMBIA1301空載體的中花17(pCAMBIA1301/中花17)的主莖穗表型(緊穗)；B為T1轉(zhuǎn)入pCAMBIA1301_PACl的中花17(pCAMBIA1301-PacI/中花17)的主莖穗表型(散穗)。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、PACl轉(zhuǎn)基因水稻的獲得一、重組表達(dá)載體pCAMBIAl301-PACl的構(gòu)建1、PAC1基因的發(fā)現(xiàn)首先構(gòu)建了以野生稻品系元江普通野生稻為供體，優(yōu)良栽培稻品種特青為受體的染色體片段代換系。利用該群體定位到4號染色體上的一個(gè)位點(diǎn)控制野生稻的散穗(PAC1，panicle architecture control I)性狀。然后從中選取編號為HL31 (圖1)的具有散穗性狀的染色體片段代換系與特青回交構(gòu)建分離群體，利用含有2400個(gè)隱性單株的群體對PACl基因進(jìn)行精細(xì)定位。最終將控制散穗的突變位點(diǎn)定位到26kb的區(qū)間(圖2)。對該區(qū)域內(nèi)的染色體片段代換系YIL31和特青基因組測序，并與日本晴基因組序列(NC_008397.2)進(jìn)行序列比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域內(nèi)有一個(gè)注釋基因0.sSPL8 (L0C_0s04g56170)。利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測穗發(fā)育及抽穗時(shí)0.sSPL8基因在YIL31和特青中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.sSPL8基因在穗一次枝梗基部的表達(dá)差異明顯(圖3)，散穗滲入系中的表達(dá)量約是栽培稻的3倍，因此將0.sSPL8基因作為控制散穗的候選基因。2、PACl基因的獲得取新鮮的野生稻品種云南元江的葉片,剪碎,用液氮研磨成粉狀,利用Qiagene公司RNA提取試劑盒獲得野生稻云南元江的總RNA,利用Takala公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，進(jìn)而用下述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到上述注釋基因0.sSPL8的野生稻等位基因。以上述得到的cDNA為模板，以引物SBP-seF:5’ -RRtaccatRatRaacRttccatc-3’ (下劃線處為Kpn I的酶切位點(diǎn)序列,其后的序列對應(yīng)序列表中序列 I 的第 1-1了位)和 SBP-seR:5，actagtgatcgaagtcgagatc—3，(下劃線處為 SpeI的酶切位點(diǎn)序列，其后的序列對應(yīng)序列表中序列I的第1230-1251位)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到從野生稻中擴(kuò)增上述注釋基因0.sSPL8的野生稻等位基因，對該基因序列進(jìn)行測序后發(fā)現(xiàn)其序列不同于0.sSPL8 (L0C_0s04g56170)。將此序列所示基因命名為PACl基因，其序列如序列表中序列I所不。PACl基因(序列I)編碼的蛋白為序列表中序列2所不蛋白，其序列也不同于0.sSPL8 (L0C_0s04g56170)編碼蛋白的氨基酸序列。3、重組表達(dá)載體pCAMBIA1301-PACl的構(gòu)建將上述步驟2獲得的PACl基因，用Kpn I和Spe I雙酶切，并回收酶切片段，將其與經(jīng)同樣雙酶切得到的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301 (Tan Lubin,Xianran Li, Liu Fengxia,Sun Xianyou, Li Chenggang, Zhu Zuofeng, Fu Yongcai， Cai Hongwei， Wang Xiangkun,Xie Daoxin, Sun Chuanqing氺.Control of a key transition from prostrate to erectgrowth in rice domestication.Nature Genetics，2008，40 (11):1360_1364)的骨架片段(大片段)相連，得到重組質(zhì)粒，對其進(jìn)行酶切和測序鑒定，證實(shí)含有大小為1251bp的PACl基因的陽性重組質(zhì)粒命名為PCAMBIA1301-PAC1。在pCAMBIA1301_PACl中，PACl基因位于Ubi組成型啟動子下游。二、PACl轉(zhuǎn)基因水稻的獲得將上述步驟一獲得的重組表達(dá)載體pCAMBIA1301-PACl利用農(nóng)桿菌LB4404轉(zhuǎn)化粳稻品種中花 17 (緊穗)(Hiei Y, Ohta S, Komari T & Kumashiro T.Efficienttransformation of rice (Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J.1994,6:271_282)的成熟胚愈傷組織，經(jīng)預(yù)分化、分化得到轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株在含有潮霉素的培養(yǎng)基上萌發(fā)，篩選到的抗性苗再通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法鑒定確認(rèn)。轉(zhuǎn)基因水稻中花17陽性植株的鑒定:從上述表現(xiàn)出潮霉素抗性的Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻中花17的新鮮葉片中提取微量總DNA。采用PCR擴(kuò)增潮霉素抗性基因(HYG)片段，檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株。潮霉素抗性基因(HYG)檢測引物為:HYG-F:5/ -TACTTCTACACAGCCATC-3'HYG-R 5' -CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3'。擴(kuò)增產(chǎn)物為947bp。將經(jīng)上述鑒 定證實(shí)轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pCAMBIAl301-PACl的Ttl代陽性水稻中花17植株命名為pCAMBIAl301-PacI/中花17。同時(shí)將轉(zhuǎn)pCAMBIAl301空載體的轉(zhuǎn)基因水稻中花17 命名為 pCAMBIAl301/ 中花 17。轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pCAMBIAl301-PACl的Ttl代陽性水稻中花17 (pCAMBIAl301-PacI/中花17)自交后得到T1代植株，經(jīng)上述鑒定方法鑒定陽性的T1代PACl轉(zhuǎn)基因水稻中花17 (pCAMBIAl301-PACl/中花17)的穗型如圖4中A所示，為很明顯的散穗表型；而轉(zhuǎn)入PCAMBIA1301空載體的轉(zhuǎn)基因水稻中花17 (pCAMBIAl301/中花17)的穗型如圖4中B所示，與未轉(zhuǎn)基因的中花17穗型一致，為很明顯的緊穗表型。這表明，PACl基因在植物體中的高效表達(dá)能夠改變水稻植株的穗型，可以使水稻中花17的穗型由緊湊變松散。
權(quán)利要求
1.由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在調(diào)控水稻穗型性狀中的應(yīng)用。
2.一種培育具有散穗性狀轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括如下步驟:將由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)肽康乃局?，得到表達(dá)所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因水稻 ，所述轉(zhuǎn)基因水稻與所述目的水稻相比穗型松散。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述蛋白質(zhì)的編碼基因的編碼區(qū)序列為序列表中序列I。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述蛋白質(zhì)的編碼基因通過含有所述編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的水稻中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述重組表達(dá)載體為將所述編碼基因插入植物表達(dá)載體中，得到的表達(dá)所述編碼基因的重組載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述重組表達(dá)載體中啟動所述編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動子是Ubi組成型啟動子。
7.蛋白質(zhì)，為下述I)或2): 1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； 2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添力口，且具有調(diào)控水稻穗型功能的由I)衍生的蛋白質(zhì)。
8.編碼權(quán)利要求7所述蛋白質(zhì)的基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基因，其特征在于:所述基因?yàn)槿缦翴)或2)的DNA分子: 1)編碼序列是序列表中序列I的DNA分子； 2)在嚴(yán)格條件下與上述I)所限定的DNA分子雜交，且編碼權(quán)利要求7所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種來源于普通野生稻的調(diào)控水稻穗型的基因PAC1及其蛋白，以及在水稻穗型調(diào)控中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的應(yīng)用具體為由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在調(diào)控水稻穗型性狀中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及一種培育具有散穗性狀轉(zhuǎn)基因水稻的方法，該包括如下步驟將由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)肽康乃局?，得到所述編碼基因超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻，所述轉(zhuǎn)基因水稻與所述目的水稻相比穗型松散。實(shí)驗(yàn)證明，由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)能夠使水稻穗型變得松散，利于提高異交結(jié)實(shí)率，進(jìn)而提高雜交水稻制種產(chǎn)量。
文檔編號C07K14/415GK103215303SQ20121004664
公開日2013年7月24日 申請日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者朱作峰, 孫傳清, 付永彩, 李顯然, 譚祿賓, 劉鳳霞 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)