專利名稱：水稻隱性抗白葉枯病主效基因xa25和它在水稻抗病改良中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術領域。具體涉及一個水稻抗白葉枯病隱性基因xa25 的分離克隆、功能驗證和應用研究?？共‰[性基因xa25能夠賦予水稻抵抗由白葉枯病菌引起的病害。抑制xa25基因的表達能夠進一步增強水稻對白葉枯病的抗性。
背景技術：
植物在生長的過程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病毒、細菌、霉菌和線蟲等。病原物侵入植物導致兩種結果(1)病原體成功的在寄主植物內(nèi)繁殖，引起相關的病癥；( 寄主植物產(chǎn)生抗病反應，殺死病原物或阻止其生長。利用抗性基因資源改良植物的抗病性，是預防病害同時又保護環(huán)境的根本出路。植物的抗病反應是多基因參于調(diào)控的復雜過程。參于植物抗病反應的基因分為兩大類(Kou和Wang，2010)。第一類是受體(receptor)基因，包括抗病(disease resistance) 主效基因，又稱R基因和宿主模式識別受體(host pattern recognition receptor)基因。 第二類是抗病相關(defense-related 或 defesne-responsive)基因。根據(jù)目前人們對抗病基因功能的認識，抗病基因的產(chǎn)物主要是作為受體，直接或間接與病原蛋白相互作用，啟動植物體內(nèi)的抗病信號傳導路徑(Chisholm等，2006)?？共』蚪閷У目共》磻剐詮?，是很好的基因資源。但是農(nóng)作物中抗病基因的資源有限。水稻白葉枯病是一種非常嚴重的病害，由稻黃單孢桿菌中的致病變種 Xanthomonas oryzaepv. oryzae (Xoo)侵染引起，是世界上對水稻危害最大的細菌性病害之一(過崇儉，19卯)。受侵染的水稻一般減產(chǎn)20-30%，嚴重時能夠達到50% (0u，19^)。白葉枯病造成米質(zhì)松脆，發(fā)芽率降低。如果在分蘗期出現(xiàn)凋萎型白葉枯，則造成稻株的大量枯死，損失會更大。水稻中抗病主效基因的資源非常有限。如目前命名的抗白葉枯病主效基因只有大約30多個，其中只有6個被分離克隆了(儲昭暉和王石平，2007)。每一個抗白葉枯病主效基因只對部分白葉枯病菌生理小種有抗性，即不同的抗病主效基因具有不同的抗
■i並曰O控制白葉枯病害流行的最好的方法是利用抗性基因資源改良水稻品種的抗性。轉基因技術為品種改良提供了高效途徑。但利用這一途徑的前提是必須具有優(yōu)良抗性基因克隆。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是分離克隆水稻中的隱性抗白葉枯病主效基因xa25，并采用RNA干擾技術(RNA interference，RNAi)、利用人工微小RNA(artificial microRNA)，通過使xa25 基因沉默，高效利用這個基因改良水稻品種抵御病害的能力。本發(fā)明涉及分離和應用包含xa25基因的DNA片段，它的核苷酸序列如序列表 SEQ IDNO :1所示，它編碼的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO 1中第201-252、1201-1237、1352-1562、1804-1965、2095-2214和2330-2635位所示。該基因(片段)賦予水稻對由白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)所引起的病害產(chǎn)生特異性的抗病反應。這一發(fā)明適用于所有對該病原菌敏感的植物。這些植物包括單子葉植物和雙子葉植物。除上述所述的如SEQ ID NO :1所示的DNA片段外，本發(fā)明所定義的基因還包括基本上相當于SEQID NO 1所示的DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID NO=I所示序列的亞片段。對序列表SEQ ID NO :1所示序列進行生物信息學分析表明，該DNA序列編碼的蛋白質(zhì)屬于MtN3/saliva家族?？梢圆捎靡呀?jīng)克隆的xa25基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，采用PCR(polymerase chain reaction)技術，也可以從基因組、 mRNA和cDNA中擴增得到本發(fā)明的xa25基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段 DNA。采用以上技術，可以分離得到包含xa25基因的序列或者包含一段xa25基因的序列， 將這一序列與合適的載體連接，可以轉入植物細胞抑制其自身的xa25基因的表達，產(chǎn)生高抗白葉枯病的轉基因植物。采用這種轉基因技術創(chuàng)造抗病植物是傳統(tǒng)育種技術所不能達到的。本發(fā)明為增強水稻對白葉枯病菌的抗性提供了一種新的方法。這種方法包括將 xa25基因的部分片段和與能夠表達人工微小RNA (artificial microRNA, amiRNA)的載體連接、轉入水稻，通過抑制其自身xa25基因的表達進一步提高水稻對白葉枯病的抗性。在本發(fā)明的實施例部分，我們闡述了隱性抗病主效基因xa25的分離、功能驗證和應用過程以及該基因的特點。


序列表SEQ ID NO 1.本發(fā)明分離的隱性水稻抗白葉枯病主效基因xa25的核苷酸序列，該基因來源于抗病水稻品種明恢63。序列表SEQ ID NO 2.本發(fā)明分離的隱性水稻抗白葉枯病主效基因xa25編碼的氨基酸序列。序列表SEQ ID NO 3.本發(fā)明分離的隱性水稻抗白葉枯病主效基因xa25的顯性等位基因)Ca25的核苷酸序列，該基因來源于感病水稻品種珍汕97。序列表SEQ ID NO 4.本發(fā)明分離的隱性水稻抗白葉枯病主效基因xa25的顯性等位基因)Ca25編碼的氨基酸序列。圖1.本發(fā)明鑒定和分離克隆水稻抗白葉枯病隱性基因xa25和它的等位顯性基因 Xa25、以及xa25和)(a25基因功能驗證的流程圖。圖2.從珍汕97/明恢63F3群體中隨機選擇255個F3單株分析對白葉枯病菌菌株 PX0339的病斑分布。圖3.利用4個分子標記初步將隱性抗白葉枯病主效基因xa25定位在水稻12染色體的著絲粒區(qū)。分子標記間的數(shù)值表示遺傳距離，實心黑色圓圈示著絲粒區(qū)。圖4.精細定位隱性抗白葉枯病主效基因xa25。分子標記間的數(shù)值表示遺傳距離。 括號中的數(shù)字代表xa25位點與相應的分子標記間檢測到的重組事件數(shù)量。圖5.用于遺傳轉化的感病品種珍汕97中的包含顯性基因)Ca25候選基因 (0sl2g29220)的DNA片段和)(a25候選基因(0sl2g^220)的結構。圖中長粗橫線條代表長5213個核苷酸(nt)的遺傳轉化片段。橫柱條表示外顯子，其中黑色部分代表編碼序列， 白色部分代表5’端和3’端的非翻譯區(qū)；橫線條代表內(nèi)含子；數(shù)字表示各個結構的堿基數(shù)； “ATG”和“TAG”分別是翻譯起始密碼和終止密碼。圖6.遺傳轉化載體pCAMBIA1301的結構。圖7.對明恢63遺傳背景(D1750MH7)和中花11遺傳背景(D1750ail)的遺傳轉化T1代家系進行基因型和表型共分離分析。說明與)Ca25候選基因與感病表型共分離。病斑面積為苗期接種白葉枯病菌菌株PX0339兩周后的數(shù)據(jù)。圖8.抗病水稻品種明恢63中隱性抗白葉枯病主效基因xa25的結構。圖中橫柱條表示外顯子，其中黑色部分代表編碼序列，斜線部分是5’ -和3’ -UTR;橫線條代表內(nèi)含子；數(shù)字表示各個結構的堿基數(shù)；“ATG”和“TAG”分別是翻譯起始密碼和終止密碼。圖9.在苗期和成株期(孕穗期)，抗病水稻品種明恢63的隱性基因xa25和感病水稻品種珍汕97的顯性基因)Ca25在接種病原菌菌株PX0339之后的表達模式。看家基因 actin的表達量作為樣品量一致性的參照。ck 未接種；1、2、3 接種PX0339后1、2、3天。
具體實施例方式本發(fā)明的前期研究結果顯示秈稻(Oryza sativa L. ssp. indica)品種明恢63特異性抗白葉枯病菌菌株PX0339，而明恢63所具有的這一特異性抗性可能是由它攜帶的、位于12號染色體著絲粒區(qū)段的一個抗白葉枯病主效基因)Ca25(t)(臨時命名)調(diào)控的(Chen 等，2002)。這個基因就是本發(fā)明中的隱性抗白葉枯病主效基因xa25。以下實施例中進一步定義本發(fā)明。圖1描敘了遺傳定位和分離克隆隱性抗白葉枯病主效基因xa25和它的等位顯性基因)(a25、驗證xa25和)(a25基因功能和高效利用隱性基因xa25改良水稻抗性的流程。根據(jù)以下實施例，本領域技術人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實施例1 精細定位隱性抗白葉枯病主效基因xa251.實驗材料和接種方法用攜帶隱性抗白葉枯病主效基因xa25的抗病水稻品種明恢63為父本、攜帶這個隱性基因的等位顯性基因)(a25的感病水稻品種珍汕97 (Oryza sativa L. ssp. indica)為母本，構建F2群體。明恢63還攜帶抗白葉枯病主效基因等，2004)。為了排除基因對精細定位隱性抗白葉枯病主效基因xa25的影響，本發(fā)明研究人員利用 Xa3/Xa26 基因的特異性 PCR 引物(5，-AACTCCAACAGTATGTCCACCTTT-3，)和 Xa26PR( 5‘ -GCATTGGCAGCAAGAGTAT-3‘)檢測這個F2群體中的單株，選取了 60個在位點為珍汕97純合帶型(不攜帶基因)，在xa25位點兩側的分子標記RM179和R1C8172 為雜合帶型的單株。這60個F2單株后代組成珍汕97/明恢63F3群體，由5816個F3單株組成。在該群體中隨機選取255個&單株，用于初步定位隱性抗病主效基因xa25。進一步利用該群體中的795個極端抗病F3單株精細定位xa25。白葉枯病菌接種采用剪葉法對苗葉)期和成株(孕穗)期的水稻進行接種 (Sun等，2004)。白葉枯病菌株由菲律賓國際水稻研究所惠贈(Sim等，2004 ；Wu等，2008)。 白葉枯病菌的培養(yǎng)遵循已經(jīng)公開發(fā)表的方法(Sim等，2004)。接種14天后調(diào)查病斑長度(厘米)或病斑面積(病斑長度/病葉長度X 100% )。2.初步定位隱性抗白葉枯病主效基因xa25為初步定位隱性基因xa25，對5816個單株組成的珍汕97/明恢63F3群體在苗期接種白葉枯病菌菌株PX0339，從中隨機選擇255個單株組成隨機群體，分析病斑長度。在該隨機群體中病斑長度呈現(xiàn)一個明顯的雙峰分布，兩峰的峰谷處于3. 3cm的位置(圖2)。 以這個峰谷為抗病和感病單株的分界線，將病斑長度< 3. 3cm視為抗病單株，將病斑長度 ^ 9. 5cm的視為感病單株。按照這一分類標準，這個隨機群體中的抗病個體有55株，感病個體有200株?？共沃陻?shù)和感病單株數(shù)之比符合1 3 ( χ 2 = 1.698，P >0.05)分離比，證明明恢63對PX0339的抗性由單一隱性抗病主效基因調(diào)控。根據(jù)本發(fā)明研究人員的前期工作基礎，明恢63中調(diào)控對PX0339抗性的主效基因位于水稻12號染色體的兩個分子標記R887和G1314之間(Chen等，2002)。本發(fā)明研究人員選取了 R887和G1314這兩個分子標記附近的 3 個 SSR(simple sequence r印eat)分子標記 RM179、RM511、RM28172 和一個Indel (insertion/deletion)分子標記MZ2對這個由255個F3單株組成的隨機群體進行分析。其中的SSR標記為國際上的通用分子標記(http //www. Gramene. org ； International Rice Genome Sequencing Project 2005) ；Indel 豐示i己貝Ut艮SItR禾禾中曰月恢63和珍汕97的基因組序列(Xie等，2010)設計。Indel標記MZ2是PCR標記，用引物 MZ2F(5，-CCTAATGCAACGCTGAAGTG-3，)和 MZ2R(5，-AATGAGTTCTCCGTGGGTTG-3，)擴增檢測。 利用這4個分子標記將該隱性基因定位到12號染色體著絲粒區(qū)，同本發(fā)明研究人員前期定位的fe25(t)基因位置在同一區(qū)段(Chen等，2002)。因為該隱性抗病主效基因與)Ca25 (t) 基因可能為同一個基因，我們將其命名為xa25。xa25基因與分子標記RM511共分離，距分子標記MZ2為1. 2cM，距分子標記RM28172為0. 4cM(圖3)。3.精細定位隱性抗白葉枯病主效基因xa25對5816個單株組成的珍汕97/明恢63F3群體在苗期接種白葉枯病菌菌株PX0339， 從中選取795個極端抗病單株(平均病斑長度< 2cm)用于精細定位隱性基因xa25。先用位于該基因兩側Indel標記MZ2和SSR標記R1C8172來篩選其中的重組單株。在基因的一側，用MZ2檢測到6個重組單株(圖4)。在基因的另一側，用R1C8172檢測到另外6個重組單株(圖4)。為更進一步精細定位xa25，利用位于MZ2和R1C8172之間的兩個hdel標記 MZ4、MZ7和一個SSR標記RM511來檢測這12個重組單株。Indel標記MZ4和MZ7根據(jù)水稻品種明恢63和珍汕97的基因組序列(Xie等，2010)設計。MZ4和MZ7都是PCR標記，分別用引物 MZ4F(5，-GCGAATGATGTGAGAGGTGA-3，)禾口 MZ4R(5，-CGGAGATCAATCTGCAACCT-3，)以及引物 MZ7F(5，-GGAACCCATCCACCTAATCC-3，)和 MZ7R(5，-GAATGGTGCCCTAACGTTCT-3，)擴增檢測。用MZ7檢測在R1C8172 —側的6個重組單株中發(fā)現(xiàn)一個重組事件(圖4)。MZ4和 RM511在這個12個重組單株中沒有檢測到重組事件(圖4)。為確認該定位結果，對這12 個重組單株進行了后代(F4)驗證。來源于每個F3重組單株分別種植20個F4單株個體，苗期接種PX0339，所有后代均表現(xiàn)出抗病。進一步驗證了 xa25定位的準確性。因此xa25被定位到分子標記MZ2和MZ7之間。實施例2 顯性基因)(a25的分離和功能驗證1.顯性)(a25候選基因的確定根據(jù)Gramene數(shù)據(jù)庫的信息(http://www, gramene. org/Oryza sativa japonica/
6mapview ？ chr = 12)，分子標記MZ2和MZ7間的物理距離大約為1，2331Λ。根據(jù)水稻基因 [Rice Genome Annotation Project(RGAP) :http: //rice, plantbiology. msu. edu/1的信息，該1233-1Λ區(qū)段包含一個MtN3/saliva基因家族的成員(RGAP位點編號為0sl2g^220)。0sl2g29220基因與水稻中已經(jīng)報道的隱性抗白葉枯病主效基因xal3同屬一個基因家族(Chu 等，2006 ；Yuan 等，2010)。采用 PCR 引物 seF3 (5，-TCACTAAATTGGCTAT GGCTAG-3，)、seF5(5，-CTTGTGGAGCAAACATTCG-3，)、seF8(5，-CTCCCTCGGCTGGGTCTGC-3，)、 seF13(5，-GGAGGAGACAAGCTACCA-3，)、美國 Perkin Elmer 公司的測序試劑盒(Big Dye Kit)，根據(jù)試劑盒說明書以雙脫氧核苷酸末端終止法分別對感病品種珍汕97和抗病品種明恢63中的0sl2g29220基因進行測序，發(fā)行這兩個水稻品種中的0sl2g29220基因的編碼區(qū)有3%的變異(序列表SEQ ID NO 1和序列表SEQIDN0 2)。故將感病品種珍汕97中的 0sl2g29220基因視為顯性基因)(a25的候選基因。2. Xa25候選基因的分離和功能驗證本發(fā)明研究人員采用長鏈PCR的方法，利用PCR引物)(a25F3 (5，-CGCGGATCCAAACGT ATGGCAGAGGTTCAGGTAGCC-3 ’)和 Xa25R3 (5 ’ -CGGGGTACCCAGTCATGGAAGTACGAAATCAGGAAA-3 ’) 從感病水稻品種珍汕97中擴增了包含顯性基因)Ca25的候選基因(0sl2g29220)、長大約 5. 21Λ的DNA片段(圖5)。該片段包含了候選基因的自身啟動子區(qū)(1569個核苷酸)、候選基因(3102個核苷酸)和候選基因下游序列(542個核苷酸)。本發(fā)明所遺傳轉化載體是pCAMBIA1301 (圖6)，它是常用的水稻遺傳轉化載體 (Sum等，2004)。將上述DNA片段經(jīng)BamHI、KpnI雙酶切處理，與同樣用BamHI、ΚρηΙ雙酶切處理的農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化載體PCAMBIA1301連接。通過酶切驗證陽性克隆，獲得的重組質(zhì)粒被命名為D1750。采用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法，將D1750分別轉入攜帶隱性抗白葉枯病主效基因xa25的抗病水稻品種明恢63和中花11中。分別獲得20株和19株遺傳轉化植株。將在明恢63、中花11背景中獲得的轉化植株分別命名為D1750MH和D1750ZH。在苗期對所有Ttl代轉化植株接種白葉枯病菌菌株PX0339，接種14天后調(diào)查病斑面積。同時取樣抽取DNA，采用遺傳轉化載體所攜帶的報告基因GUS(i3-葡萄糖酸酸酶)的 PCR 引物 GusF (5，-CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC-3，)和 GusR(5‘-GAGTGAAGATCCCTTTCTT GTTACC-3’)擴增檢測陽性遺傳轉化植株。在明恢63背景中，15株遺傳轉化陽性植株的病斑面積為30. 6士7. 4%至50. 6士3. 9%，抗病對照明恢63的病斑面積為6.5士 1. 1%，感病對照珍汕97的病斑面積為49. 9士7. 6% (表1)。在中花11 背景中，15株遺傳轉化陽性植株的病斑面積為19. 7士2. 9%至31. 3士7. 4%，抗病對照中花 11的病斑面積為4. 3 士 1.0% (表2)。表1. T0代遺傳轉化植株(D1750MH，明恢63背景)對白葉枯病菌菌株PX0339的反
應
權利要求
1.一種分離的對白葉枯病產(chǎn)生抗性的隱性基因Xa25，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO 1 所示。
2.一種分離的對白葉枯病產(chǎn)生抗性的隱性基因xa25，它的編碼序列如序列表SEQ ID NO 1 中第 201-252、1201-1237、1352-1562、1804-1965、2095-2214、2330-2635 位所示。
3.權利要求1或2所述的基因在增加水稻對白葉枯病抗性中的應用。
4.權利要求3所述的應用，其特征包括通過抑制隱性基因xa25的表達，培育高抗白葉枯病水稻的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物生物技術領域。具體涉及包含水稻隱性抗白葉枯病主效基因xa25以及xa25的等位顯性基因Xa25的兩條DNA片斷的分離克隆、功能驗證和應用。利用基于人工微小RNA(artificial microRNA，amiRNA)干擾技術原理的轉基因技術，將隱性基因xa25的部分DNA片段與外源調(diào)節(jié)序列連接并轉入水稻，抑制水稻中隱性基因xa25的表達，可進一步增強水稻對白葉枯病的抗性。
文檔編號C07K14/415GK102559698SQ20101059588
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月14日 優(yōu)先權日2010年12月14日
發(fā)明者劉沁松, 王石平, 袁猛 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學