本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
：，涉及一種利用水稻白葉枯病菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運目標蛋白到植物體內(nèi)的表達載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：許多植物和動物病原菌都配備有效應(yīng)蛋白(translocatedeffectorproteins)作為其“分子兵工廠”，效應(yīng)蛋白能幫助病原菌感染宿主并在宿主中定殖。效應(yīng)蛋白對于病原菌在植物/動物中的增殖和侵染具有極其重要的作用。隨著各種病原菌(細菌、真菌等)基因組測序的完成，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過生物信息學(xué)分析預(yù)測了數(shù)目龐大的分泌型蛋白質(zhì)。但生物信息學(xué)僅能對蛋白質(zhì)的功能進行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果的準確性無法確保，因此蛋白質(zhì)是否真的具有預(yù)測的功能，仍然需要試驗驗證。很多病原菌分泌蛋白的含量很低且分泌方式不明確，很多寄生性真菌無法在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，也沒有辦法進行遺傳操作，因此研究這些病菌侵染時所分泌蛋白的功能非常困難。如何從數(shù)目龐大的預(yù)測蛋白中快速有效的篩選出對致病菌存在重要作用的效應(yīng)蛋白就變得極其有意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種利用水稻白葉枯病菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運目標蛋白到植物體內(nèi)的表達載體及其應(yīng)用。本發(fā)明首先保護一種特異DNA分子，自上游至下游依次包括如下區(qū)段：區(qū)段甲、區(qū)段乙和區(qū)段丙；所述區(qū)段甲為HrcC啟動子；所述區(qū)段乙為TAL信號肽；所述區(qū)段丙為轉(zhuǎn)錄終止序列。所述區(qū)段甲具體可如序列表的序列1第7-524位核苷酸所示。所述區(qū)段乙具體可如序列表的序列1第525-674位核苷酸所示。HrcC啟動子和TAL信號肽的物種來源均為XOO生理小種PX099。所述特異DNA分子中，所述區(qū)段乙和區(qū)段丙之間還具有限制性內(nèi)切酶的識別序列。所述限制性內(nèi)切酶具體可為限制性內(nèi)切酶SacⅠ。所述轉(zhuǎn)錄終止序列具體可為NOS轉(zhuǎn)錄終止序列。所述區(qū)段丙具體可如序列表的序列1第690-965位核苷酸所示。所述特異DNA分子具體可為如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1第7-965位核苷酸所示的DNA分子；(a2)序列表的序列1所示的DNA分子。含有以上任一所述特異DNA分子的重組載體也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組載體具體可為在出發(fā)載體中插入以上任一所述特異DNA分子得到的重組載體。所述出發(fā)載體具體可為PUFR034載體。所述重組載體具體可為在PUFR034載體的EcoRI和KpnI酶切位點之間插入序列表的序列1第7至965位核苷酸所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護以上任一所述特異DNA分子的應(yīng)用，為表達目的蛋白并將其轉(zhuǎn)運至植物細胞。所述目的蛋白具體可為mCherry蛋白、含有mCherry蛋白的融合蛋白或avrxa10蛋白。所述mCherry蛋白具體可為序列表的序列2中第1-708位核苷酸所示DNA分子編碼的蛋白質(zhì)。所述含有mCherry蛋白的融合蛋白具體可為序列表的序列2所示核苷酸所示DNA分子編碼的蛋白質(zhì)。所述avrxa10蛋白具體可為序列表的序列4所示DNA分子編碼的蛋白質(zhì)。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，具體可為水稻，更具體可為日本晴水稻。所述應(yīng)用中，所述特異DNA分子借助水稻白葉枯病菌導(dǎo)入植物。所述水稻白葉枯病菌具體可為生理小種PX099。本發(fā)明還保護以上任一所述重組載體的應(yīng)用，為表達目的蛋白并將其轉(zhuǎn)運至植物細胞。所述目的蛋白具體可為mCherry蛋白、含有mCherry蛋白的融合蛋白或avrxa10蛋白。所述mCherry蛋白具體可為序列表的序列2中第1-708位核苷酸所示DNA分子編碼的蛋白質(zhì)。所述含有mCherry蛋白的融合蛋白具體可為序列表的序列2所示核苷酸所示DNA分子編碼的蛋白質(zhì)。所述avrxa10蛋白具體可為序列表的序列4所示DNA分子編碼的蛋白質(zhì)。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，具體可為水稻，更具體可為日本晴水稻。所述應(yīng)用中，所述重組載體借助水稻白葉枯病菌導(dǎo)入植物。所述水稻白葉枯病菌具體可為生理小種PX099。本發(fā)明還保護以上任一所述特異DNA分子的應(yīng)用，為鑒定待測蛋白是否為效應(yīng)蛋白。本發(fā)明還保護以上任一所述重組載體的應(yīng)用，為鑒定待測蛋白是否為效應(yīng)蛋白。本發(fā)明還保護一種鑒定待測蛋白是否為效應(yīng)蛋白的方法，包括如下步驟：(1)將待測蛋白的編碼基因插入以上任一所述重組載體的所述區(qū)段乙和所述區(qū)段丙之間且所述編碼基因與所述區(qū)段乙位于同一個編碼框，得到重組質(zhì)粒；(2)將步驟(1)得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入出發(fā)菌，得到重組菌；所述初發(fā)菌為水稻白葉枯病菌；(3)分組操作如下：實驗組：將所述重組菌導(dǎo)入植物，然后觀察植物發(fā)病情況；對照組：將所述出發(fā)菌導(dǎo)入植物，然后觀察植物發(fā)病情況；在平行操作的前提下，如果實驗組植物的發(fā)病程度不同于對照組植物，待測蛋白為效應(yīng)蛋白。所述效應(yīng)蛋白為具有改變植物病原菌侵染宿主植物的功能的蛋白質(zhì)。所述改變具體可為促進?！皩嶒灲M植物的發(fā)病程度不同于對照組植物”具體可為“實驗組植物的發(fā)病程度高于對照組植物”。步驟(1)中，所述待測蛋白的編碼基因具體可通過重組插入所述重組載體的所述區(qū)段乙和所述區(qū)段丙之間。步驟(1)中，“將待測蛋白的編碼基因插入以上任一所述重組載體的所述區(qū)段乙和所述區(qū)段丙之間”的實現(xiàn)方式具體如下：①用限制性內(nèi)切酶SacⅠ酶切所述重組載體，回收線性化載體；②在待測蛋白的編碼基因的5’末端增加片段甲(片段甲具體可為如下序列：CGGACGATGTCCGAGCTC)、3’末端增加片段乙(片段乙具體可為如下序列的反向互補序列：ACGATCTGCAGCGAGCTC)；所述片段甲由15-20個核苷酸組成，末尾的6個核苷酸為限制性內(nèi)切酶SacⅠ的識別序列；所述片段乙由15-20個核苷酸組成，起始的6個核苷酸為限制性內(nèi)切酶SacⅠ的識別序列；③取步驟①得到的線性化載體和步驟②得到的DNA分子，采用IIOneStepCloningKit進行重組操作，得到所述重組質(zhì)粒。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，具體可為水稻，更具體可為日本晴水稻。所述水稻白葉枯病菌具體可為生理小種PX099。所述方法中，具體可將所述重組菌或所述出發(fā)菌的菌懸液注射到所述植物的葉片中。所述方法中，實驗組具體可將所述重組菌的菌懸液注射到所述植物的葉片中，對照組具體可將所述出發(fā)菌的菌懸液注射到所述植物的葉片中，7天后觀察植物發(fā)病情況。所述菌懸液具體可為OD600nm＝0.5的菌懸液。所述菌懸液的具體制備方法可為：用10mM的MgCl2水溶液重懸所述重組菌或所述出發(fā)菌。本發(fā)明還保護一種鑒定待測蛋白是否為效應(yīng)蛋白的試劑盒，包括以上任一所述重組載體和水稻白葉枯病菌。所述水稻白葉枯病菌具體可為生理小種PX099。本發(fā)明提供的載體，借助Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)的Ⅲ型分泌系統(tǒng)將待測蛋白質(zhì)強制分泌到植物體內(nèi)。本發(fā)明提供了一種簡單易行且可批量操作的方法，該方法可將分泌蛋白強制分泌到植物體內(nèi)，從而篩選出有重大生物學(xué)意義的效應(yīng)蛋白。該發(fā)明對于植物病原菌致病機制的研究起到了一定的促進作用。附圖說明圖1為實施例2的結(jié)果。圖2為實施例3的結(jié)果。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。水稻白葉枯病菌即Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)。PUFR034載體：參考文獻：RobertDeFeyter,ClarenceI.KadobandDeanW.Gabriel；Small,stableshuttlevectorsforuseinXanthomonas；Gene,88(1990)65-72。IIOneStepCloningKit：Vazyme公司。實施例1、重組質(zhì)粒pLCS的制備1、合成序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子。序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子中，包括如下區(qū)段(5’→3’)：區(qū)段甲：第7-524位核苷酸為區(qū)段甲；區(qū)段甲為啟動子區(qū)域(HrcCpromoter)，其功能為啟動外源基因強制表達；第433-458位核苷酸為PIP-box位點，其功能為是促進植物細胞壁溶解從而使Ⅲ型分泌系統(tǒng)發(fā)揮作用；區(qū)段乙：第525-674位核苷酸為區(qū)段乙；區(qū)段乙為信號肽區(qū)域(TALsignalpeptide)，其功能為促使蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移；區(qū)段丙：第690-965位核苷酸為區(qū)段丙；區(qū)段丙為終止子區(qū)域(NOS轉(zhuǎn)錄終止序列)。序列表的序列1中，第675-680位核苷酸為限制性內(nèi)切酶SacⅠ的酶切識別序列。Hrccpromoter和TALsignalpeptide的物種來源均為XOO生理小種PX099。2、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI雙酶切步驟1得到的雙鏈DNA分子，回收酶切產(chǎn)物。3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI雙酶切PUFR034載體，回收約8.7kb的載體骨架。4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pLCS。經(jīng)測序，對重組質(zhì)粒pLCS進行結(jié)構(gòu)描述如下：在PUFR034載體的EcoRI和KpnI酶切位點之間插入了序列表的序列1第7至965位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。實施例2、驗證重組質(zhì)粒pLCS對目的蛋白的表達和轉(zhuǎn)運效果1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。序列表的序列2中，第1-708位核苷酸編碼mCherry蛋白(紅色熒光蛋白)，第733-753位核苷酸編碼SV40NLS，第757-777位核苷酸編碼SV40NLS，第781-801位核苷酸編碼SV40NLS。SV40NLS即核定位信號。2、以步驟1合成的雙鏈DNA分子為模板，采用F1和R1組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。F1：5’-CGGACGATGTCCGAGCTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’；R1：5’-ACGATCTGCAGCGAGCTCTTAAGATCCTACCTTTCTCT-3’。3、取重組質(zhì)粒pLCS，采用限制性內(nèi)切酶SacⅠ進行酶切，得到線性化質(zhì)粒。4、取步驟2得到的PCR擴增產(chǎn)物和步驟3得到的線性化質(zhì)粒，采用IIOneStepCloningKit并按試劑盒說明書進行重組操作，得到具有序列表的序列3所示DNA分子的重組質(zhì)粒(命名為重組質(zhì)粒甲)。5、將重組質(zhì)粒甲導(dǎo)入水稻白葉枯病菌生理小種PX099，得到重組菌。6、用10mM的MgCl2水溶液重懸步驟5得到的重組菌，得到OD600nm＝0.5的菌懸液。7、取5葉1心的日本晴水稻，剝?nèi)〉箶?shù)第二層的葉鞘，把步驟6得到的菌懸液注射到葉鞘中，3天之后觀察。結(jié)果見圖1。圖1中，左上圖為普通視野下，右上圖為觀察DAPI染色的視野下(DAPI對細胞核染色)，左下圖為觀察紅色熒光的視野下，右下圖為右上圖和左下圖的疊加圖。結(jié)果顯示，在水稻葉鞘細胞核中觀察到紅色熒光蛋白，說明重組質(zhì)粒pLCS可以有效地表達目的蛋白并且將目的蛋白轉(zhuǎn)運至植物細胞內(nèi)。實施例3、檢測待測蛋白是否為效應(yīng)蛋白1、合成序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子。序列表的序列4所示的DNA分子編碼avrxa10蛋白。avrxa10蛋白為已知的效應(yīng)蛋白(具有促進植物病原菌侵染宿主植物的功能的蛋白質(zhì))。2、以步驟1合成的雙鏈DNA分子為模板，采用F2和R2組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。F2：5’-CGGACGATGTCCGAGCTCatggatcccattcgttcgcg-3’；R2：5’-ACGATCTGCAGCGAGCTCtcagatcgtccctccgactg-3’。3、取重組質(zhì)粒pLCS，采用限制性內(nèi)切酶SacⅠ進行酶切，得到線性化質(zhì)粒。4、取步驟2得到的PCR擴增產(chǎn)物和步驟3得到的線性化質(zhì)粒，采用IIOneStepCloningKit并按試劑盒說明書進行重組操作，得到具有序列表的序列5所示DNA分子的重組質(zhì)粒(命名為重組質(zhì)粒乙)。5、將重組質(zhì)粒乙導(dǎo)入水稻白葉枯病菌生理小種PX099，得到重組菌甲。將重組質(zhì)粒pLCS導(dǎo)入水稻白葉枯病菌生理小種PX099，得到重組菌乙。6、用10mM的MgCl2水溶液重懸步驟5得到的重組菌甲，得到OD600nm＝0.5的菌懸液甲。用10mM的MgCl2水溶液重懸步驟5得到的重組菌乙，得到OD600nm＝0.5的菌懸液乙。7、進行如下平行處理：實驗組：取5葉1心的日本晴水稻，把菌懸液甲注射到寬度為5mm的葉片中(每株水稻注射1個葉片，注射量為20微升)，7天之后觀察發(fā)病表型。對照組：取5葉1心的日本晴水稻，把菌懸液乙注射到寬度為5mm的葉片中(每株水稻注射1個葉片，注射量為20微升)，7天之后觀察發(fā)病表型。完成上述操作了，試驗組葉片和對照組的葉片照片見圖2。與對照組葉片相比，實驗組葉片的發(fā)病表型更加嚴重，表明序列表的序列4所示的DNA分子編碼的avrxa10蛋白為具有促進植物病原菌侵染宿主植物的功能的效應(yīng)蛋白。進行10次重復(fù)試驗，結(jié)果一致。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3