稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子標(biāo)記及其方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及水稻稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分 子標(biāo)記及其方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 稻瘟病是危害最嚴(yán)重、分布最廣泛的稻作病害之一，嚴(yán)重影響了水稻的產(chǎn)量和質(zhì) 量。全球每年因稻瘟病危害造成的水稻產(chǎn)量損失達(dá)到水稻總產(chǎn)量的10%~30%。在我國， 稻瘟病年發(fā)病面積達(dá)300~600萬hm 2,嚴(yán)重年份可達(dá)800萬hm2,損失稻谷數(shù)億公斤，嚴(yán)重 威脅著我國的糧食安全。培育和推廣種植抗病品種是控制稻瘟病最安全、經(jīng)濟(jì)而有效的措 施。
[0003] 水稻對稻瘟病的抗性分為質(zhì)量抗性和數(shù)量抗性。質(zhì)量抗性一般由單個(gè)或少數(shù)幾個(gè) 主效基因控制，能夠抑制稻瘟病菌的侵入和繁殖，因而呈現(xiàn)高水平的完全抗性。其缺點(diǎn)是對 稻瘟病小種菌具有很強(qiáng)的?；裕率咕哂羞@類抗性的水稻品種往往大面積推廣3~5后 就喪失抗性，給水稻生產(chǎn)造成新的損失。數(shù)量抗性基因，又稱田間抗性或部分抗性，通常受 多個(gè)微效基因或數(shù)量抗性位點(diǎn)（QTL)控制。這類抗性不能完全抑制稻瘟病菌的侵入，但可 以限制稻瘟病菌的繁殖及病斑的擴(kuò)展，進(jìn)而減輕水稻發(fā)病的程度。數(shù)量抗性對稻瘟病菌小 種無專化性或?qū)；院苋酰哂袕V譜和持久抗病的特點(diǎn)是具有這類抗性的水稻在生產(chǎn)上往 往具有持久抗病的優(yōu)點(diǎn)。因此，數(shù)量抗性基因的發(fā)掘和利用對于培育廣譜持久抗稻瘟病品 種尤為重要。
[0004] 傳統(tǒng)的水稻抗病育種依賴于抗性表型的鑒定，這不僅要求育種者具有豐富的經(jīng)驗(yàn) 和敏銳的洞察力，而且鑒定結(jié)果極易受環(huán)境條件和人為因素的影響，從而降低了目標(biāo)基因 的選擇效率。另外，由于受可鑒別不同基因的鑒別菌系的限制，單純地依賴表型鑒定很難實(shí) 現(xiàn)多個(gè)抗性基因的聚合。隨著分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，它便捷、直接、不受環(huán) 境影響的優(yōu)點(diǎn)使其應(yīng)用價(jià)值及前景越來越受到關(guān)注。開發(fā)并應(yīng)用與抗性基因緊密連鎖的分 子標(biāo)記，特別是基于基因自身序列的功能性分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，不僅可以大大提高抗 源篩選、抗性基因鑒定及育種選擇效率，而且使得通過基因聚合手段培育持久、廣譜抗病 良種成為可能。
[0005] 迄今，國內(nèi)外利用分子標(biāo)記技術(shù)已鑒定和定位了 70多個(gè)水稻稻瘟病抗性基因，克 隆了 Pia、Pib、Pita、Pil、Pi9、Pi2、Piz-t、Pi-d2、Pi-d3、Pi36、Pi37、Pik、Pik-m、Pik-p、 Pik-h、Pi5、Pi54、Pit、Pish、Pi64 等 20 個(gè)主效抗性基因，以及 pi21、Pbl、Pi63 和 Pi35 等 4 個(gè)數(shù)量抗性基因；并開發(fā)了針對 Pita、Pib、Pik、Pikm、Pikp、Pil、Pit、Pi5、Pi25 和 Pi64 等10個(gè)主效抗性基因的功能性標(biāo)記。但是，迄今尚無關(guān)于數(shù)量抗性基因功能性標(biāo)記開發(fā)的 報(bào)道。
[0006] 在已克隆的4個(gè)數(shù)量抗性基因中，Pbl基因編碼一個(gè)非典型的NBS-LRR蛋白，它 源自秈稻品種Modan，對穗瘟具有較強(qiáng)的抗性，對葉瘟也有部分抗性，在田間表現(xiàn)較好的 持久抗病性，從而使得含有該基因的品種在日本不同地區(qū)種植了 30年仍然未喪失抗性 (Hayashi等2010 ;Fuji等2005)。pi21基因是一個(gè)隱性的部分抗性基因，編碼一個(gè)含有 重金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域和假定的蛋白-蛋白互作結(jié)構(gòu)域的富含脯氨酸的蛋白，它源自粳稻品 種Owarihatamochi (Fukuoka等，2009)。pi21基因具有非小種專化性，它對防衛(wèi)反應(yīng)的一 些特殊機(jī)制可能賦予其持久抗病性，從而使得含有該基因的品種可以在日本種植幾十年而 不喪失抗性。Pi63基因編碼一個(gè)典型的NBS-LRR蛋白，它源自日本水稻品種Kahei，該品 種含有多個(gè)QTL抗性位點(diǎn)，對稻瘟病表現(xiàn)出較強(qiáng)的田間抗性，Pi63基因是其中貢獻(xiàn)率最大 的QTL，基因克隆表明Pi63的抗性水平與基因本身的表達(dá)水平有關(guān)，表現(xiàn)出劑量效應(yīng)依賴 的抗性模式（Xu等2014)。Pi35基因也編碼一個(gè)NBS-LRR家族蛋白，它源自日本粳稻品 種Hokkail88 (Nguyen等，2006)。Pi35是最近被鑒定和克隆的一個(gè)新的稻瘟病部分抗性 基因，該基因是Pish的等位變異基因，其多個(gè)功能性堿基多態(tài)性（multiple functional polymorphisms)的共同作用對稻癌病菌提供了高水平的持久抗性（Fukuoka等，2014)。攜 帶Pi35基因的2個(gè)粳稻品種北海188(Hokkai 188)和藤系138(Fukei 138)在日本自育 成至今近半個(gè)世紀(jì)以來一直表現(xiàn)穩(wěn)定且高水平的葉瘟抗性，是日本水稻育種的骨干抗源 (Mikami等，1990 ;Nguyen等，2006 ;Fukuoka等，2014)。Pi35基因的克隆為在育種上有效利 用該基因奠定了基礎(chǔ)，但迄今尚未見其功能性標(biāo)記開發(fā)的報(bào)道。為了加快Pi35基因在育種 中的應(yīng)用進(jìn)程，提高后代的選擇效率，降低育種成本，開發(fā)出可以準(zhǔn)確有效的鑒定數(shù)量抗性 基因的功能性分子標(biāo)記，對通過分子育種手段快速、高效培育持久、廣譜抗稻瘟病品種具有 特別重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的首要目的是提供一種鑒定稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子標(biāo)記 Pi35-dCAPS。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用上述稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子標(biāo)記 Pi35-dCAPS鑒別或篩選含有稻瘟病抗性基因Pi35的水稻品種的方法。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子標(biāo)記 Pi35-dCAPS 的應(yīng)用。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一種稻瘟病抗性基因Pi35的功 能性分子標(biāo)記，利用所述分子標(biāo)記擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物序列如SEQ ID N0.9所示，并且通過特異 限制性內(nèi)切酶Tail酶切后成為2個(gè)片段，大小分別為244bp和28bp。
[0011] 所述分子標(biāo)記與從特定水稻品種中擴(kuò)增出來的稻瘟病抗性基因Pi35呈現(xiàn)一致帶 型。本發(fā)明通過對多個(gè)水稻稻瘟病抗性基因Pi35的等位基因序列與Pi35(基因登錄號 FW369319)序列做比對的方法，分析得到能區(qū)分其他等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的 Pi35功能特異性的一處單堿基差異（3780T)，再通過設(shè)計(jì)引物得到SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2引物序列，對水稻總DNA擴(kuò)增、酶切以及瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到可以特異鑒定Pi35 基因的功能性分子標(biāo)記Pi35-dCAPS，具體步驟如下 ：
[0012] (1)通過水稻數(shù)據(jù)庫（http://www. gramene. org/)及常規(guī)PCR法擴(kuò)增并測序獲得 多個(gè)水稻品種的Pi35等位基因的編碼區(qū)DNA序列；
[0013] 所用引物對的核苷酸序列如下所示：
[0014] SEQ ID NO. 3 ：CCTTCATCCCTCAACGTTTTTGTCTCCAAG
[0015] SEQ ID NO. 4 ：ATCGGTATGGAACACTCCAATCCAACTTGT
[0016] (2)利用多序列比對軟件工具Clustal W，將步驟⑴所獲得的序列翻譯成蛋白序 列后進(jìn)行比對，得到Pi35抗性基因所特異的1個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，即Pi35編碼區(qū)的3780T位點(diǎn)， 對應(yīng)氨基酸位點(diǎn)為1260Cys ;
[0017] (3)根據(jù)步驟⑵得到的1個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)出引物對SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 ;并用這1對引物分別對不同水稻品種的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物，然后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切、電泳檢測，得到與稻瘟病抗性基因Pi35呈特異性帶型的 核苷酸片段；
[0018] (4)對步驟（3)所獲得的分子標(biāo)記在不同水稻品種中進(jìn)行驗(yàn)證，確定Pi35的功能 性分子標(biāo)記Pi35-dCAPS。
[0019] 上述的方法，步驟（1)中所述的水稻品種為藤系138、日本晴和麗江新團(tuán)黑谷 (LTH);所述的PCR擴(kuò)增，其中擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系如下：2XPCR Buffer for KOD FX 25iil， (1階？8(211116&。11)10111，引物（1(^111〇1，5￡0 10勵(lì).3+5￡0 10勵(lì).4)2111，1(00卩父酶（川/ 111，1'(^080)1111，0嫩模板（100叩/111)2111，加(1(111 20至50111，擴(kuò)增反應(yīng)條件：941：2111111; 98°C 10s -59°C 15s -68°C7min，35 個(gè)循環(huán)；68°C5min，10°C保存；PCR產(chǎn)物大小為 6941bp。
[0020] 步驟（3)中所述的常規(guī)PCR擴(kuò)增，其中擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系如下：2XPCR Buffer for K0DFX10iil，dNTPs(2mMeach)4iiU|*(10pmol，SEQIDN0.1+SEQIDN0.2)liil，K0D FX 酶（1U/iil，T0Y0B0) 0? 4 iil，DNA 模板（100ng/ill) 2 iil，加 ddH20 至 20 ill ;擴(kuò)增反應(yīng)條 件：94°C 2min ;98°C 10s - 59°C 15s - 68°C 30s，35 個(gè)循環(huán)；68°C 5min，1(TC保存；
[0021] 步驟（3)中所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為272bp，經(jīng)Tail酶切，酶切體系和條件為PCR 產(chǎn)物 15ii l，10XBuffer 1，Tail 酶 lii 1，ddH2022 ii 1，于 65°C酶切 3h 后；酶切后成為 2 個(gè)片段，大小分別為28bp和244bp，取適量酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，得 到與稻瘟病抗性基因Pi35呈特異性帶型的核苷酸片段，則待測水稻植株或品種含有稻瘟 病抗性基因Pi35。
[0022] 本發(fā)明提供一種鑒別或篩選含有稻瘟病抗性基因Pi35的水稻品種的方法，該方 法是：以待測水稻植株或品種的總DNA為模板，采用如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示序 列的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為272bp，并經(jīng)特異限制性內(nèi)切酶Tai I 酶切后成為2個(gè)片段，大小分別為244bp和28bp，則待測水稻植株或品種含有稻瘟病抗性基 因Pi35 ;否則待測水稻植株或品種不含有稻瘟病抗性基因Pi35。
[0023] 所述的方法，其特征在于：采用如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示序列的引物對 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系如下：2XPCR Buffer for K0D FX 10iil，dNTPs(2mM 6&吐）4111，引物（1(^111〇1，卩+101111，1(00卩父酶（川/111，1'0￥080)0.4111，0嫩模板（1001^/ ii l)2ii 1，加 ddH20 至 20ii 1，擴(kuò)增反應(yīng)條件：94°C 2min ;98°C 10s - 59°C 15s - 68°C 30s， 35 個(gè)循環(huán)；68°C 5min，10°C保存。
[0024] 所述的方法，采用特異的限制性內(nèi)切酶Tail酶切所述的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其酶切體 系和條件如下：PCR 產(chǎn)物 15ii 1，lOXBuffer l，TaiI 酶 1 ii l，ddH022 ii 1，65°C 酶切 3h 后 經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0025] 本發(fā)明還提供一種鑒別或篩選含有稻瘟病抗性基因Pi35的水稻品種的引物對， 所述引物對由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示序列的兩條引物組成，具體序列如下。
[0026] SEQ ID NO. 1 :GCCGTCCTCCCTCCAGCATATATGTATACG (倒數(shù)第二個(gè)堿基 C 為人為引入 的突變堿基位點(diǎn)）
[0027] SEQ ID NO. 2 ：GGTGTCTGCAAAACAAAGGAAACGTGAAG
[0028] 本發(fā)明還提供一種含有所述的引物對的鑒別或篩選含有稻瘟病抗性基因Pi35的 水稻品種的試劑盒。
[0029] 本發(fā)明還提供一種所述的引物對，所述的試劑盒，或所述的分子標(biāo)記的應(yīng)用，將其 用于培育水稻抗稻瘟病品種的分子標(biāo)記輔助育種、基因聚合育種或轉(zhuǎn)基因育種中，還可用 于在大量的水稻種質(zhì)資源