一種豬源性抗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 FaeG蛋白的單鏈抗體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種豬源性抗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88FaeG蛋白的單鏈抗體及其制備方法。本發(fā)明的抗產(chǎn)毒素大腸桿菌K88FaeG蛋白的單鏈抗體由抗體的重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL通過(guò)短的連接肽連接而成。輕鏈可變區(qū)VL的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，重鏈可變區(qū)VH的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。獲得的抗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88FaeG蛋白的單鏈抗體分子量約為28kDa，能夠特異性的識(shí)別產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88，可用于阻斷產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88的感染和粘附。
【專利說(shuō)明】
一種豬源性抗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 FaeG蛋白的單鏈抗體及 其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種豬源性抗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88FaeG蛋白的單鏈抗體及其制備方 法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 斷奶仔豬腹瀉(post-weaning diarrhea，PWD)發(fā)生在仔豬斷奶時(shí)或斷奶后的第1 周，臨床上主要癥狀表現(xiàn)為腹瀉、脫水、生長(zhǎng)緩慢或停止生長(zhǎng)，從而引起仔豬的大量死亡，給 全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。超過(guò)50%斷奶仔豬腹瀉病例中是由特定血清型的產(chǎn) 腸毒素大腸桿菌(ETEC)造成的。目前細(xì)菌耐藥性問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，抗生素治療細(xì)菌感染效 果不理想。單鏈抗體是一種基因工程抗體，以其分子量小、特異性高、穿透力強(qiáng)、易于改造等 特點(diǎn)，顯示了巨大的應(yīng)用潛力，越來(lái)越受到人們的重視。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種豬源性抗產(chǎn)腸毒素大腸桿 菌K88FaeG蛋白的基因工程單鏈抗體及其制備方法。本發(fā)明的單鏈抗體能夠與產(chǎn)腸毒素大 腸桿菌K88FaeG蛋白特異性結(jié)合，可用于阻斷產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的感染和粘附。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案具體介紹如下。
[0005] 本發(fā)明提供一種豬源性抗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88FaeG蛋白的單鏈抗體，所述單鏈 抗體具有如SEQ ID No: 1所示重鏈可變區(qū)VH的氨基酸序列、如SEQ ID No:2所示的輕鏈可變 區(qū)VL氨基酸序列和位于重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL之間的連接肽。
[0006] 優(yōu)選的，所述連接肽的序列為:GGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGGTCT。
[0007]優(yōu)選的，所述單鏈抗體具有如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。
[0008]本發(fā)明還提供一種編碼上述單鏈抗體的基因，其具有SEQ ID No :4所示的核苷酸 序列。優(yōu)選的，所述核苷酸序列中包含內(nèi)切酶位點(diǎn)s f i I、N 011，其中S f i I的序列為 GGCCNNNNNGGCC，Not I 的序列為 GCGGCCGC。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種上述單鏈抗體的表達(dá)載體。優(yōu)選的，其為原核表達(dá)載體。更 優(yōu)選的，所述原核表達(dá)載體為pCANTAB-5e-ScF V載體。
[0010] 更進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種上述單鏈抗體的制備方法，具體步驟如下：
[0011] (1)采用RT-PCR直接從產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88感染的豬外周血RNA中擴(kuò)增出抗體編 碼基因的重鏈可變區(qū)VH基因和輕鏈可變區(qū)VL基因；
[0012 ] (2)利用S0E-PCR法將連接序列l(wèi)inker與重鏈可變區(qū)VH基因和輕鏈可變區(qū)VL基因 相連構(gòu)建豬源性單鏈抗體基因；
[0013] (3)將步驟(2)的豬源性單鏈抗體基因克隆到噬菌體抗體展示載體pCANTAB5e中， 構(gòu)建重組噬菌粒pCANTAB5e-ScFv;
[0014] (4)將步驟(3)的重組噬菌粒載體pCANTAB5e-ScFv電轉(zhuǎn)化入E.coli TG1感受態(tài)細(xì) 胞，獲得豬源性噬菌體單鏈抗體庫(kù)；
[0015] (5)將步驟(4)獲得的豬源性噬菌體單鏈抗體庫(kù)用以原核表達(dá)的產(chǎn)腸毒素大腸桿 菌K88FaeG蛋白作為包被抗原進(jìn)行噬菌體ELI SA，得到的陽(yáng)性克隆即為含有抗產(chǎn)腸毒素大腸 桿菌K88FaeG的單鏈抗體；
[0016] (6)分離純化步驟(5)所得陽(yáng)性克隆培養(yǎng)產(chǎn)物即獲得豬源性抗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌 K88蛋白的單鏈抗體。
[0017] 需要說(shuō)明的是，以上各步驟采用的實(shí)驗(yàn)材料均為正規(guī)公司獲得的標(biāo)準(zhǔn)材料，所用 方法均為標(biāo)準(zhǔn)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書所述方法(見(jiàn)相應(yīng)的實(shí)施例），各步驟獲得的中間產(chǎn)品及最 后的終產(chǎn)品均經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)證明可以重復(fù)獲得，其生物學(xué)性質(zhì)保持穩(wěn)定一致。說(shuō)明本發(fā)明 各試驗(yàn)步驟所涉及的中間產(chǎn)品和終產(chǎn)品均可以按照本發(fā)明所陳述的發(fā)法準(zhǔn)確獲得.
[0018] 本發(fā)明的技術(shù)原理是采用RT-PCR直接從產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88感染的豬外周血 RNA中擴(kuò)增出抗體編碼基因的重鏈可變區(qū)（VH)基因和輕鏈可變區(qū)（VL)基因。利用S0E-PCR (重組鏈延伸反應(yīng)）法將連接序列l(wèi)inker與VH基因和VL基因相連構(gòu)建豬源性單鏈抗體 (ScFv)基因，并將其克隆到噬菌粒載體pCANTAB5e中，phage-ELISA篩選抗ETEC單鏈抗體的 陽(yáng)性克隆，測(cè)序后使用DNAstar的Megalin進(jìn)行序列分析，證明該單鏈抗體屬于豬源性抗產(chǎn) 腸毒素大腸桿菌K88蛋白的單鏈抗體。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是:抗豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88的基因工程抗體能與豬產(chǎn)腸毒 素大腸桿菌K88FaeG蛋白特異性結(jié)合，能夠用于豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病K88的粘附阻斷及其 功能驗(yàn)證。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖 1 為RT-PCR電泳圖；Μ為2000bp DNA ladder marker;l為VH基因 RT-PCR產(chǎn)物。
[0021] 圖2為RT-PCR電泳圖；Μ為2000bp DNA ladder marker;1 為VL基因 RT-PCR產(chǎn)物。
[0022] 圖3為VH-Linker-VL PCR電泳圖；Μ為2000bp DNA ladder marker;l為VH-Linker-VL基因 PCR產(chǎn)物。
[0023] 圖4為pCANTAB5e-ScFv雙酶切鑒定；M為2000bp DNA ladder marker;l、2為重組 質(zhì)粒經(jīng)Sfi I和Not I雙酶切。
[0024] 圖5為重組原核表達(dá)載體pCANTAB5e_ScFv質(zhì)粒圖譜。
[0025] 圖6為噬菌體抗體庫(kù)的多樣性分析。
[0026]圖7為抗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88FaeG單鏈抗體的純化電泳圖;Μ為預(yù)染蛋白Marker; 1為純化后的單鏈抗體。
【具體實(shí)施方式】
[0027]實(shí)施例1豬源性抗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88FaeG蛋白的單鏈抗體的制備 [0028] 1、對(duì)GenBank已公布的豬抗體編碼基因重鏈可變區(qū)序列（AF064686 . 1 ; AF064687.1 ;AF064688.1 ;AF064689.1;AF064690.1)和輕鏈可變區(qū)序列（KF561242.1; GQ867594.1;GQ867595.1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增抗體輕、重鏈的引物（表1)，其中VH1F分別與VH1R、VH2R 用于擴(kuò)增VH區(qū)；VL IF、VL2F、VL3F和VL 1R用于擴(kuò)增VL區(qū)；VH3F、VH3R用于VH基因加入酶切位點(diǎn) 和Linker序列；VL4F、VL5F、VL6F在VL1F、VL2F、VL3F擴(kuò)增的VL基因基礎(chǔ)上加入酶切位點(diǎn)， VL2R用于VL基因加入Linker序列。其中，VH3F含有Sfi I酶切位點(diǎn)，VL 2R含有Not I酶切位 點(diǎn)；￥!131?、￥1^4?、￥1^5?、￥1^6?含互補(bǔ)的1^111?^序列（酶切位點(diǎn)和1^111?^序列在表1中用下劃線 標(biāo)示出）。Linker采用（GGGGS) 3,其對(duì)應(yīng)的編碼核苷酸序列為： GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGGTCT。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù) 有限公司合成。
[0029]表1擴(kuò)增抗體可變區(qū)的引物及其擴(kuò)增片段大小 [0030]
[0032]注:下劃線代表Sfi I或Not頂每切位點(diǎn)，方框代表連接肽序列。
[0033] 2、VH和VL基因的擴(kuò)增
[0034] 以cDNA為模版，VH1F、VH1R為引物擴(kuò)增VH基因（見(jiàn)圖1)。引物VL1F、VL2F、VL3F分別 與引物VL1R配對(duì)，擴(kuò)增VL基因（見(jiàn)圖2KPCR反應(yīng)體系為25yL:2XPCR mix 12.5yL，模版cDNA 2yL，上下游引物（25μΜ)各lyL，ddH20 8.5yL。擴(kuò)增程序如下：95°C預(yù)變性3min;94°C變性 4〇8,50°(：退火4〇8,72°(：延伸11^11，30個(gè)循環(huán) ;最后72°(：延伸1〇1^11。1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒 定產(chǎn)物并回收目的基因（根據(jù)Thermo公司提供的膠回收說(shuō)明書操作）。
[0035] 3、ScFv基因的獲得
[0036] 分別以VH和VL基因?yàn)槟０?，VH2F、VH2R為引物PCR擴(kuò)增帶有Linker的重鏈可變區(qū)基 因，VH4F、VL5F、VL 6F分別與VL2R配對(duì)，PCR擴(kuò)增帶有Linker的輕鏈可變區(qū)基因，PCR條件同 上。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收目的基因（含有Linker序列的VH和VL基因）。 以VH2F、VL 2R為引物，通過(guò)重組鏈延伸反應(yīng)（S0E-PCR)將含有Linker序列的VH和VL基因連 接為ScFv基因，并加入Sfi I和Not I酶切位點(diǎn)，VH-Linker-VL擴(kuò)增產(chǎn)物大小為762bp(見(jiàn)圖 3)〇
[0037] 4、豬源性ScFv噬菌體原始文庫(kù)的構(gòu)建
[0038]根據(jù)常規(guī)分子克隆方法(參照J(rèn).薩姆布魯克等主編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》），ScFv 基因和pCANTAB-5e載體分別經(jīng)Sfi I和Not I雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳并用凝膠回收試劑 盒回收酶切產(chǎn)物（見(jiàn)圖4)。將ScFv基因插入pCANTAB-5e載體（北京普如汀生物技術(shù)有限公 司），構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒(參見(jiàn)圖5)，并將其電轉(zhuǎn)化E.coliTGl感受態(tài)細(xì)胞(北京普如汀生物 技術(shù)有限公司），連續(xù)電轉(zhuǎn)化50次，構(gòu)建豬源性ScFv噬菌體原始文庫(kù)。挑取單克隆菌落PCR 驗(yàn)證其陽(yáng)性率，菌落PCR驗(yàn)證正確的克隆進(jìn)行測(cè)序分析來(lái)確定文庫(kù)的多樣性(見(jiàn)圖6)。
[0039] 5、ScFv的富集篩選
[0040]取純化的原核表達(dá)的ETEC K88FaeG蛋白（本實(shí)驗(yàn)室制備），用抗原包被液(50mmol/ L碳酸氫鈉鹽溶液，pH=9.6)稀釋至5yg/mL，加入96孔板，每孔100yL，4 °C包被過(guò)夜;每孔加 入5 %脫脂奶粉溶液200yL，37 °C封閉lh，PBS洗滌3次;每孔加入100yL噬菌體ScFv原始文庫(kù)， 37°C孵育2h，PBS洗滌10次;每孔加入洗脫緩沖液(Gly-HCl pH=2.2) 100yL洗脫，再加入50μ L(Tri s-HCl pH = 9.0)進(jìn)行中和。將部分洗脫的噬菌體感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌TG1，測(cè) 定第一輪的捕獲的噬菌體滴度，其余洗脫的噬菌體進(jìn)行第二輪富集篩選;捕獲的噬菌體滴 度需要達(dá)到10 6cfu/mL;挑取最后一輪淘選的單菌落，即為抗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88FaeG蛋 白的陽(yáng)性ScFv菌落。
[0041 ] 6、ScFv的誘導(dǎo)表達(dá)
[0042]挑取陽(yáng)性ScFv菌落至含氨芐抗生素(終濃度為100μΜ)和葡萄糖(終濃度為(2M)的 2ΥΤ液體培養(yǎng)基中，37 °C振搖培養(yǎng)，菌液OD600至0.6時(shí)感染輔助噬菌體Μ13Κ07 (北京普如汀生 物技術(shù)有限公司）。12h后離心，吸取上清，即為陽(yáng)性ScFv的噬菌體。陽(yáng)性ScFv的噬菌體感染 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HB2151菌液(北京普如汀生物技術(shù)有限公司），培養(yǎng)至菌液OD600為0.6。將菌液 分為兩份，分別為誘導(dǎo)組、和非誘導(dǎo)組。誘導(dǎo)組在菌液中加入IPTG(終濃度100μΜ)，于30°C誘 導(dǎo)過(guò)夜，離心收集菌液。用PBS懸浮菌液，超聲波裂解，離心后收集上清。采用Ni-NTA his band rasin純化ScFv，純化過(guò)程參照默克公司的《pET System Manual》。純化后的樣品進(jìn)行 SDS-PAGE電泳(見(jiàn)圖7)。
[0043]實(shí)施例2抗原特異性ScFv的間接ELISA篩選
[0044] 取純化的原核表達(dá)的ETEC K88FaeG蛋白（本實(shí)驗(yàn)室制備），用抗原包被液(50mmol/ L碳酸氫鈉鹽溶液，pH=9.6)稀釋至5yg/mL，加入96孔板，每孔lOOyL，4 °C包被過(guò)夜;每孔加 入5 %脫脂奶粉溶液200yL，37 °C封閉lh，PBS洗滌3次;將純化蛋白的上清50yL與4 %脫脂奶 粉溶液50yL混勻后加入上述孔中，37°C孵育2h，PBST洗滌3次；加入E-Tag Mouse mAb(E-tag 標(biāo)簽鼠單克隆抗體購(gòu)自RayBiotech公司）100yL(l: 2000)，37°C反應(yīng)2h，PBST洗滌3次;加入 過(guò)氧化氫標(biāo)記的羊抗鼠 IgG二抗(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司）1000yL(l :4000)，37°C反應(yīng)lh， PBST洗滌3次;TMB顯色15min，2mo 1/L硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司讀取OD45Q處吸 光值，將設(shè)未誘導(dǎo)菌液上清為表達(dá)陰性對(duì)照。以P/N (P為陽(yáng)性孔的0D450值，N為陰性孔的 0D450值)表示，P/N彡2.1為陽(yáng)性;1.5彡P(guān)/N< 2.1為可疑;P/N< 1.5為陰性。陽(yáng)性克隆經(jīng)3次 重復(fù)性試驗(yàn)驗(yàn)證，同時(shí)設(shè)豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬沙門菌作為對(duì)照，驗(yàn) 證ScFv的特異性。結(jié)果證明單鏈抗體A能夠特異性的識(shí)別產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病毒，但不與傳 染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬沙門菌發(fā)生交叉免疫反應(yīng)。
[0045] 實(shí)施例3
[0046]對(duì)獲得的單鏈抗體編碼基因進(jìn)行測(cè)序，證明其由762個(gè)核苷酸及據(jù)此推測(cè)的254個(gè) 氨基酸組成，所述核苷酸序列如SEQ ID No:4所示，所述氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。 [0047] 實(shí)施例4
[0048]檢測(cè)單鏈抗體對(duì)產(chǎn)腸毒大腸桿菌K88的黏附阻斷效果。將IPEC-J2細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室 保存)鋪到細(xì)胞培養(yǎng)六孔板中，于37 °C 5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。細(xì)胞生長(zhǎng)至60 % -70 %時(shí)， 棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用無(wú)菌緩沖液洗滌3次，加入2mL無(wú)抗無(wú)血的DMEM培養(yǎng)基，其中兩孔胰 酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)。將產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88稀釋后按50M0I感染細(xì)胞，一組加入針對(duì)產(chǎn)腸毒 素大腸桿菌K88的單鏈抗體(pCANTAB5e-ScFv) 100yL( lOng/yL)，另一組加入與產(chǎn)腸毒素大 腸桿菌K88無(wú)結(jié)合活性的單鏈抗體(pCANTAB5e-ScFv_negative)100yL，共同孵育2h。每隔半 小時(shí)輕輕震蕩3〇 seC(32h后棄去培養(yǎng)基，PBS洗去未結(jié)合的大腸桿菌。然后將細(xì)胞用LB細(xì)菌培 養(yǎng)基處理，裂解細(xì)胞，釋放細(xì)胞表面的細(xì)菌。將細(xì)菌計(jì)數(shù)，計(jì)算黏附的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的 數(shù)量。黏附抑制率計(jì)算公式為：（無(wú)結(jié)合活性單鏈抗體處理組細(xì)菌數(shù)-特異性單鏈抗體處理 組細(xì)菌數(shù))/無(wú)結(jié)合活性單鏈抗體處理組細(xì)菌數(shù)）。試驗(yàn)組內(nèi)重復(fù)兩次，組間三次，證實(shí)單鏈 抗體具有一定的抗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88的活性，可以用于阻斷產(chǎn)腸毒素大腸桿菌對(duì)機(jī)體 的感染和粘附(見(jiàn)表1)。
[0049] 表1 pCANTAB5e_ScFv抗體黏附阻斷試驗(yàn)
[0050]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種豬源性抗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88FaeG蛋白的單鏈抗體，其特征在于，所述單鏈抗 體具有如SEQ ID No: 1所示的重鏈可變區(qū)VH氨基酸序列，如SEQ ID No:2所示的輕鏈可變區(qū) VL氨基酸序列和位于重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL之間的連接肽。2. 如權(quán)利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于，所述連接肽的序列為： GGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGGTCT 〇3. 如權(quán)利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于，該單鏈抗體具有如SEQ ID No:3所示的 氨基酸序列。4. 一種編碼權(quán)利要求1-3之一所述的單鏈抗體的基因，其特征在于，其具有SEQ ID No: 4所示的核苷酸序列。5. 如權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于，所述核苷酸序列中包含內(nèi)切酶位點(diǎn)Sfi I、 NotI，其中 Sf i I 的序列為GGCCNNNNNGGCC，NotI 的序列為GCGGCCGC。6. -種權(quán)利要求1-3之一所述的單鏈抗體的表達(dá)載體。7. 如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于，其為原核表達(dá)載體。8. 如權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述原核表達(dá)載體為pCANTAB-5e-ScFV 載體。9. 一種根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的單鏈抗體的制備方法，其特征在于，具體步驟如 下： (1) 采用RT-PCR法直接從產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88感染的豬外周血RNA中擴(kuò)增出抗體編碼 基因的重鏈可變區(qū)VH基因和輕鏈可變區(qū)VL基因； (2) 利用S0E-PCR法將連接序列1 inker與重鏈可變區(qū)VH基因和輕鏈可變區(qū)VL基因相連 構(gòu)建豬源性單鏈抗體基因； (3) 將步驟（2)的豬源性單鏈抗體基因克隆到噬菌體抗體展示載體pCANTAB5e中，構(gòu)建 重組噬菌粒pCANTAB5e-ScFv; (4) 將步驟(3)的重組噬菌粒載體pCANTAB5e-ScFv電轉(zhuǎn)化入E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞，獲 得豬源性噬菌體單鏈抗體庫(kù)； (5) 將步驟（4)獲得的豬源性噬菌體單鏈抗體庫(kù)用以原核表達(dá)的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌 K88FaeG蛋白作為包被抗原進(jìn)行噬菌體ELISA，得到的陽(yáng)性克隆即為含有抗產(chǎn)腸毒素大腸桿 菌K88FaeG的單鏈抗體； (6) 分離純化步驟(5)所得陽(yáng)性克隆培養(yǎng)產(chǎn)物即獲得豬源性抗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88蛋 白的單鏈抗體。
【文檔編號(hào)】C07K16/12GK106008710SQ201610571104
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月20日
【發(fā)明人】朱建國(guó), 張凡慶, 王苗苗
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)