突變型大腸桿菌忌熱毒素、其制備方法、增加免疫反應的佐劑及疫苗的制作方法【專利摘要】本發(fā)明提供一種突變型大腸桿菌忌熱毒素、其制備方法、增加免疫反應的佐劑及疫苗。所述制備方法及其產物是通過大腸桿菌忌熱毒素基因的定點突變、將大腸桿菌忌熱毒素A亞單位及B亞單位的信號肽置換為大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽、以及改造大腸桿菌外膜蛋白質信號肽而達成。此外，本發(fā)明具有可應用于佐劑及疫苗，可使其大量生產且降低成本等優(yōu)點?！緦＠f明】突變型大腸桿菌忌熱毒素、其制備方法、增加免疫反應的佐劑及疫苗【
技術領域：
】[0001]本發(fā)明是關于一種突變型大腸桿菌忌熱毒素及其制備方法，特別是關于一種提升突變型大腸桿菌忌熱毒素的產量以降低蛋白質佐劑與疫苗的生產成本及其方法。【
背景技術：
】[0002]大腸桿菌屬在分類學上歸屬于腸道細菌科(Enterobacteriaceae),為兼性厭氧、不產孢的革蘭氏陰性菌。大多數(shù)的大腸桿菌對人畜無害，但部分血清型的大腸桿菌則會引起腹瀉、食物中毒及腸道外感染等癥狀。致病型大腸桿菌依發(fā)病型態(tài)的不同，可分為下痢性大腸桿菌(DiarrheagenicE.coli)及腸道外致病大腸桿菌(ExtraintestinalpathogenicE.coli,ExPEC)兩類。其中，下痢性大腸桿菌又可分為腸致病性大腸桿菌(enteropathogenicE.coli；EPEC)、腸毒素產生性大腸桿菌(enterotoxigeicE.coli；ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(enteroinvasiveE.coli；EIEC)、腸道出血性大腸桿菌(enterohemorrageicE.coli；EHEC)及腸附著性大腸桿菌(enteroadherentaggregativeE.coli；EAggEC)等五類。腸道外致病大腸桿菌可分為尿道致病性大腸桿菌(UropathogenicE.coli;UPEC)、腦膜炎大腸桿菌(NeonatalmeningitisE.coli;NMEC)、敗血性大腸桿菌(SepticemicE.coli；SEC)及細胞脫附性大腸桿菌(cell-detachingE.coli；CDEC)等四類(Kaperetal.,2004；PavankumarandSankaran,2008)。[0003]腸毒素產生性大腸桿菌會產生熱穩(wěn)定毒素(heatstabletoxin；ST)和忌熱毒素(不耐熱腸毒素，heatlabiletoxin；LT)(YamamotoandNakazawa,1997)。熱穩(wěn)定毒素可依照其對甲醇的溶解與否及對蛋白酶的抗性再區(qū)分為STI(STa)及STII(STb)。其中STI是由18~19個氨基酸所組成的肽，分子量約在1500~2000Daltons，可溶解于甲醇中，對蛋白酶具有抗性。STII則是由48個氨基酸所組成的肽，無法溶解于甲醇中，對蛋白酶具有敏感性(DubreuiI，2008)。熱穩(wěn)定毒素在100°C下加熱30分鐘仍不會失去活性。忌熱毒素與霍亂弧菌(Vibriocholerae)所產生的霍亂毒素(choleratoxin；CT)具有相似的結構及作用機制，依據(jù)其與CT抗血清中和反應與否，又可區(qū)分為LTI及LTII。其中LTI可與CT抗血清反應；依照來源宿主的不同，又可區(qū)分為LTp-1及LTh-1；LTp-1是由豬只來源的ETEC所產生，LTh-1則是由人類來源的ETEC所產生。LTh-1及LTp-1氨基酸的相似度達95%以上,但毒性有別。體外及體內試驗的結果顯示，LTp-1的毒性低于LTh-1(Lasaroetal.，2008)。LTII則無法與CT抗血清反應；依據(jù)氨基酸組成及抗原性的不同又可區(qū)分為LTIIa、LTIIb及LTIIc。這些忌熱毒素在65°C下加熱30分鐘即失去活性。[0004]不同菌株產生毒素的能力有所不同；如鞭毛抗原K88陽性反應的菌株通常會產生LT及STI,鞭毛抗原K99或987P1陽性反應的菌株僅會產生STI(YamamotoandKakazawa,1997)。[0005]忌熱毒素LTI屬于A-B毒素(A-Btoxin)，為高分子量的復合物，是由一個A亞單位(LT-A)及五個B亞單位(LT-B)所組成。A亞單位的分子量約為30kDa，由Al(I~192)及A2(195~240)兩個多肽鏈以雙硫鍵結合所組成，主要扮演毒素的角色。此亞單位具有二磷酸腺核苷核糖轉移酶(ADP-ribosyltransferase)活性,在進入細腸細胞后，A亞單位的雙硫鍵會被破壞，且被宿主的蛋白酶剪切為Al及A2片段。Al會活化腺苷酸環(huán)化酶(adenylatecyclase),使細胞中的環(huán)AMP(cAMP)增加。cAMP的增加會活化蛋白質激酶A(proteinkinaseA),將離子通道磷酸化,進而促使細胞中的Na+、K+及水分向腸腔內轉移，水份與離子的大量流失會導致腹瀉、脫水和電解質紊亂。B亞單位的分子量約為12kDa，其能與腸細胞膜上的GMl神經(jīng)節(jié)苷酯(GMlganglioside)受體(receptor)結合,協(xié)助Al亞單位進入細胞內。研究顯示，LTI除了造成人類及動物的腹瀉外，亦具有做為大腸桿菌疫苗及疫苗佐劑的潛力。[0006]1972年，Northrup及Fauci等學者發(fā)現(xiàn)將霍亂毒素(choleratoxin；CT)與綿羊紅血球細胞(sheepredbloodcells；SRBC)混合后,經(jīng)靜脈注射后可增進抗SRBC抗體的效價。1984年，Elson及Ealding等學者發(fā)現(xiàn)CT具有黏膜佐劑的效果。1988年，Lycke等學者發(fā)現(xiàn)氨基酸組成與結構和CT相似的LTI亦具有黏膜佐劑的效果，且可避免口服耐受性的問題。后續(xù)的研究結果顯示，LTI亦可作為注射佐劑。有關LTI增強免疫反應的機制仍未闡明，目前僅知(I)LT的A亞單位及B亞單位與佐劑活性有關(Rappuolietal.，1999)。(2)LT可促進抗原呈現(xiàn)細胞表達MHC-1I分子，并刺激⑶4+T細胞的增殖反應(Yamamotoetal.,1999)o(3)LT會刺激細胞激素的產生，可誘發(fā)THl及TH2免應反應(Yamamotoetal.，2001)。(4)TH17細胞與大腸桿菌忌熱毒素的佐劑活性有關(Breretonetal.,2011)。[0007]雖然LTI具有佐劑的效果，但以腸毒素產生性大腸桿菌生產LTI作為佐劑具有多項缺點，包括:(1)操作腸毒素產生性大腸桿菌具有感染的風險。(2)不同菌株的毒素生產量有別且產量低(約為60iig~2.5mg)(Lasaroetal.，2006)。(3)天然毒素雖能增進免疫效果，但具有毒性，不適合直接作為疫苗佐劑。以重組DNA技術生產低毒性或無毒性毒素可改善上述的缺點。例如中國臺灣專利案1304838號，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)生產無毒性LTI，此毒素LT-A的第61號氨基酸由絲氨酸(Serine)突變?yōu)榫彼?Arginine)或賴氨酸(Lysine);或是美國專利案US7291588號，`利用細菌或酵母菌生產無毒性LTI，此毒素LT-A的第72號氨基酸由丙氨酸(alanine)突變?yōu)榫彼?arginine)。然而,該些發(fā)明皆無法大量地量產突變型大腸桿菌忌熱毒素；緣此，本發(fā)明的主要目的在于提升突變體的產量以降低蛋白質佐劑的生產成本?！?br/>發(fā)明內容】[0008]有鑒于此，本發(fā)明的目的是開發(fā)一種可降低毒性甚至無毒的大腸桿菌忌熱毒素，其利用突變其氨基酸序列所制得，其可使突變體的產量提升以降低蛋白質佐劑的生產成本。[0009]同時，本發(fā)明的另一目的是制備可同時誘發(fā)體液性免疫反應及細胞性免疫反應的佐劑，其可與抗原組合為疫苗。[0010]為達上述目的，本發(fā)明提供一種制備突變型大腸桿菌忌熱毒素的方法，其可包含:(a)提供大腸桿菌忌熱毒素的DNA序列，其至少包含一個A亞單位及一個B亞單位；(b)將A亞單位的第63號氨基酸突變?yōu)橘嚢彼岬拿艽a子；(C)將A及B亞單位中轉譯為信號肽的DNA分別取代為轉譯為大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽的DNA;(d)將大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽的第9號氨基酸突變?yōu)槔i氨酸的密碼子；以及(e)將步驟(d)所制得的突變大腸桿菌忌熱毒素的DNA置入大腸桿菌表達系統(tǒng)以制得突變型大腸桿菌忌熱毒素。[0011]較佳地，大腸桿菌忌熱毒素可包含一個A亞單位及五個B亞單位。[0012]在本發(fā)明的一較佳實施例中，當執(zhí)行(e)步驟時，可先將突變大腸桿菌忌熱毒素的DNA嵌入質粒，再將質粒轉化入大腸桿菌表達系統(tǒng)。[0013]在本發(fā)明的一較佳實施例中，在(e)步驟之后，所產生的突變型大腸桿菌忌熱毒素可采用固定化半乳糖樹脂進行純化。[0014]較佳地，步驟(a)的大腸桿菌忌熱毒素的DNA序列可包含SEQIDN0.23、24或25。[0015]較佳地，大腸桿菌忌熱毒素的A亞單位可包含氨基酸序列SEQIDN0.26。[0016]較佳地，大腸桿菌忌熱毒素的B亞單位可包含氨基酸序列SEQIDN0.27。[0017]較佳地，大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽可包含氨基酸序列SEQIDN0.14。[0018]在本發(fā)明的一較佳實施例中，大腸桿菌忌熱毒素的A亞單位的第63號氨基酸的密碼子可為絲氨酸。[0019]在本發(fā)明的一較佳實施例中，大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽的第9號氨基酸的密碼子為丙氨酸。[0020]在本發(fā)明的一較佳實施例中，當執(zhí)行(b)步驟時，可利用引物進行重疊延伸聚合酶鏈式反應；其中，上述的引物可包含SEQIDN0.1、2、3、4、5及6。[0021]在本發(fā)明的一較佳實施例中，當執(zhí)行(C)步驟時，可利用引物進行重疊延伸聚合酶鏈式反應；其中，上述的引物可包含SEQIDN0.7、8、9、10、11、12及13。[0022]在本發(fā)明的一較佳實施例中，當執(zhí)行(d)步驟時，可利用引物進行重疊延伸聚合酶鏈式反應；其中，上述的引物可包含SEQIDN0.15、16、17及18。[0023]此外，本發(fā)明另提供一種突變型大腸桿菌忌熱毒素，其可包含:至少一個A亞單位及至少一個B亞單位；其中A亞單位的第63號氨基酸可為賴氨酸；A亞單位及B亞單位的信號肽為大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽，且大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽的第9號氨基酸可為纈氨酸。[0024]較佳地，大腸桿菌忌熱毒素可包含一個A亞單位及五個B亞單位。[0025]于本發(fā)明的一較佳態(tài)樣中，大腸桿菌外膜蛋白質A的信號肽可包含氨基酸序列SEQIDN0.14。[0026]較佳地，本發(fā)明的突變型大腸桿菌忌熱毒素可包含SEQIDN0.30的DNA序列。[0027]較佳地，本發(fā)明的突變型大腸桿菌忌熱毒素可為經(jīng)減毒的大腸桿菌忌熱毒素。[0028]再者，本發(fā)明另可提供一種增加個體免疫反應的佐劑，其可為上述突變型大腸桿菌忌熱毒素。[0029]較佳地，佐劑可誘發(fā)體液性免疫反應及/或細胞性免疫反應。[0030]最后，本發(fā)明再提供一種疫苗，其可包含:抗原及上述的佐劑。[0031]其中，抗原可包含豬肺炎霉?jié){菌黏附素P97的C端。[0032]其中，此疫苗可為細菌疫苗或病毒疫苗。[0033]較佳地，細菌可包含病原性大腸桿菌(Escherichiacoli)、空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)、大腸彎曲桿菌(Campylobactercoli)、沙門氏桿菌(Salmonellasp.)、豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)、巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)、第二型豬鏈球菌(Streptococcussuistype2)、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)、單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、豬肺炎霉衆(zhòng)菌(Mycoplasmahyopneumoniae)、豬鼻霉衆(zhòng)菌(Mycoplasmahyorhinis)、丹毒菌(Erysipeloidrixinsidiosia)、博德氏支氣管敗血癥桿菌(Bordetellabronchiseptica)、氣腫疽桿菌(Clostridiumchauvoei)、破傷風梭菌(Clostridiumtetani)、赤痢螺旋菌(Treponemahyodysenteriae)、雞副嗜血桿菌(HaemophilusparagalIinarum)、水禽雷氏桿菌(Riemerellaanatipestifer)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肉毒梭狀芽抱桿菌(Clostridiumbotulinum)、嬰I鶴披衣菌(Chlamydiapsittaci)、雞敗血性霉衆(zhòng)菌(Mycoplasmagallisepticum)、骨膜炎霉衆(zhòng)菌(Mycplosmasynoviae)、家禽結核菌(Mycobacteriumavian)、白色念珠菌(Candidaalbicans)或其組合。[0034]較佳地，病毒可包含血球凝集性腦炎病毒(haemagglutinatingencephalomyelitisvirus)、日本腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus)、豬腸病毒(swineenterovirusvirus)、假性狂犬病病毒(pseudorabiesvirus)、口蹄疫病毒(footandmousediseasevirus)、豬流行性感冒病毒(swineinfluenzavirus)、第二型豬環(huán)狀病毒(porcinecircovirustype2)、豬生殖與呼吸綜合癥病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)、豬痘病毒(swinepoxvirus)、豬細小病毒(porcineparovirus)、豬痕病毒(classicalswinefever)、白血病/肉瘤群病毒(leukosis/sarcomagroupvirus)、傳染性法氏囊病病毒(infectiousbursaldiseasevirus)、家禽傳染性支氣管炎病毒(avianinfectiousbronchitisvirus)、雞馬立克氏病病毒(Marek'sdiseasevirus)、關節(jié)炎病毒(arthritisvirus)、雞傳染性貧血病毒(chickeninfectiousanemiavirus)、禽痘病毒(fowlpoxvirus)、新城疫病毒(Newcastlediseasevirus)、雞傳染性喉氣管炎病毒(infectiouslaryngotracheitisvirus)、腫頭癥候群病毒(swollenheadsyndromevirus)、雞產蛋下降癥候群病毒(eggdropsyndromevirus)或其組合。[0035]本發(fā)明通過量產突變型大腸桿菌忌熱毒素的方式來降低制作佐劑的成本，且具備毒性小及免疫效果良好等優(yōu)點，可做為疫苗佐劑?！緦＠綀D】【附圖說明】[0036]圖1顯示本發(fā)明171、196及286菌株的內生性質粒；[0037]圖2顯示本發(fā)明利用PCR擴增171、196及286菌株的elt操縱子(operon)；[0038]圖3顯示本發(fā)明171菌株elt操縱子的核苷酸序列(SEQIDN0.23)；eltA的序列以斜體表示；[0039]圖4顯示本發(fā)明196菌株elt操縱子的核苷酸序列(SEQIDN0.24);eltA的序列以斜體表示；[0040]圖5顯示本發(fā)明286菌株elt操縱子的核苷酸序列(SEQIDN0.25)；eltA的序列以斜體表示；[0041]圖6顯示本發(fā)明171、196及286菌株EltA的氨基酸序列(SEQIDN0.26)；[0042]圖7顯示本發(fā)明171、196及286菌株EltB的氨基酸序列(SEQIDN0.27)；[0043]圖8顯示本發(fā)明大腸桿菌忌熱毒素基因突變策略及PCR產物的分析；圖片A:基因突變使用的引物組合；圖片B:利用DNA電泳分析PCR產物；[0044]圖9顯示本發(fā)明突變大腸桿菌忌熱毒素DNA序列(SEQIDN0.28);突變位置以粗體字標示，且eltA的序列以斜體表示；[0045]圖10顯示本發(fā)明利用蛋白質電泳偵測重組突變大腸桿菌忌熱毒素的表達情形；[0046]圖1IA顯示本發(fā)明置換大腸桿菌忌熱毒素A亞單位及B亞單位信號肽DNA使用的策略；[0047]圖1lB為本發(fā)明置換大腸桿菌忌熱毒素A亞單位及B亞單位信號肽DNA的PCR產物的分析圖；[0048]圖12顯示本發(fā)明融合OmpA信號肽DNA的eltA及eltB的DNA序列(SEQIDN0.29)；0mpA信號肽以粗體字表示，且eltA的序列以斜體表示；[0049]圖13顯示本發(fā)明融合突變OmpA信號肽DNA的eltA及eltB的DNA序列(SEQIDN0.30);突變OmpA信號肽以粗體字表示，且eltA的序列以斜體表示；[0050]圖14顯示本發(fā)明重組突變大腸桿菌忌熱毒素的純化結果?！揪唧w實施方式】[0051]以下將配合圖式詳細敘述例示實施例。然而，這些實施例可以包含于不同的形式中，且不應被解釋為用以限制本發(fā)明。這些實施例的提供使得本發(fā)明的揭露完整與完全，本領域的技術人員將能經(jīng)由這些實施例了解本發(fā)明的范疇。[0052]本發(fā)明是關于一種制備突變型大腸桿菌忌熱毒素的方法，其可包含:(a)提供大腸桿菌忌熱毒素的DNA序列，其至少包含一個A亞單位及一個B亞單位；(b)將A亞單位的第63號氨基酸突變?yōu)橘嚢彼岬拿艽a子；(c)將A及B亞單位中轉譯為信號肽的DNA分別取代為轉譯為大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽的DNA;(d)將大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽的第9號氨基酸突變?yōu)槔i氨酸的密碼子；以及(e)將步驟(d)所制得的突變大腸桿菌忌熱毒素的DNA置入大腸桿菌表達系統(tǒng)以制得突變型大腸桿菌忌熱毒素。[0053]此外，本發(fā)明另提供一種突變型大腸桿菌忌熱毒素，其可包含:至少一個A亞單位及至少一個B亞單位；其中A亞單位的第63號氨基酸可為賴氨酸；A亞單位及B亞單位的信號肽為大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽，且大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽的第9號氨基酸可為纈氨酸。[0054]較佳地，本發(fā)明的大腸桿菌忌熱毒素可包含一個A亞單位及五個B亞單位。[0055]再者，本發(fā)明另可提供一種增加個體免疫反應的佐劑，其可為上述突變型大腸桿菌忌熱毒素。[0056]最后，本發(fā)明再提供一種疫苗，其可包含:抗原及上述的佐劑。[0057]本文中「LT」一詞，是指大腸桿菌忌熱毒素。LT至少由單一A亞單位及單一B亞單位所構成，較佳為單一A亞單位及五個相同的B亞單位構成。[0058]本文中「突變型大腸桿菌忌熱毒素」一詞，相較于野生型大腸桿菌忌熱毒素之下，是指經(jīng)突變、經(jīng)減毒、毒性較低或不具毒性的大腸桿菌忌熱毒素。[0059]本文中「elt」一詞，是指大腸桿菌忌熱毒素的結構基因。[0060]「rmLT」一詞是指重組天然產生的LT所制成的突變型。用于與rmLT相關的「實質上無毒性」一詞是指實質上較其野生型相對物低的毒性。[0061]后述的實例是用于闡明本發(fā)明的多種態(tài)樣，并使得本領域技術人員得以據(jù)以實施，以下的實例僅為例示性，并非用于限制本發(fā)明意欲主張的申請專利范圍。[0062]實例[0063]本發(fā)明的一種突變型大腸桿菌忌熱毒素及其制備方法，特別是關于一種提升突變型大腸桿菌忌熱毒素的產量以降低蛋白質佐劑的生產成本及其實驗方法步驟與實驗的結果討論，其將以具體實例說明的方式闡述，其過程及結果僅為例示性，并非用于限制本發(fā)明意欲主張的申請專利范圍。[0064]實例I[0065]菌株的分離[0066]自發(fā)生豬只下痢的豬場收取豬腸。以滅菌的接種環(huán)鉤取豬腸液，并于麥康凱瓊脂(MacConkeyagar)培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)。隔夜培養(yǎng)后，挑選單一紅色菌落進行生化試驗，包括D引哚試驗(indoletest)、甲基紅試驗(methylredtest)、佛普二氏反應(Voges-Prokauerreaction)及檸檬酸試驗。菌株進行測試后，若吲哚試驗為陽性反應、甲基紅試驗為陽性反應、佛普二氏反應為陰性反應及檸檬酸試驗為陰性反應，則判定為大腸桿菌。進一步以鞭毛抗原K88抗血清進行血清凝集試驗，若凝集試驗為陽性反應,代表此菌株為K88+的大腸桿菌。將不同豬場的菌株分別編號為171、196及286。[0067]實例2[0068]腸毒素產生性大腸桿菌質粒的抽取[0069]利用質粒提取純化試劑盒PlasmidMiniprepPurificationKitII(GeneMark,Taiwan)進行大腸桿菌質粒的抽取，操作流程依照廠商提供的方法進行。流程中提及的溶液1、溶液I1、溶液II1、洗滌溶液A、洗滌溶液B及沖提溶液均為試劑盒中所附的試劑。取1.5mL隔夜培養(yǎng)的菌液至微量離心管，離心(21，000Xg，3分鐘，室溫)收集菌體，并倒除上清液，重復此步驟二次。將菌體重新懸浮于200iiL溶液I中。之后加入200iiL溶液II，緩和混合數(shù)次。接著加入200iiL溶液III，緩和混合數(shù)次。離心(21，000Xg，10分鐘，室溫)收集上清液。將純化管柱(spincolumn)放置于收集管(collectiontube)上,并將上清液置入純化管柱(spincolumn)中，經(jīng)離心(21，000Xg,2分鐘,室溫)后,倒除濾液。接著加入500iiL洗漆溶液A至純化管柱(spincolumn)中，離心(14000rpm,2分鐘，室溫)后，倒除濾液，此步驟可有效降低核酸內切酶(endonuclease)的污染。緊接著加入700iiL洗滌溶液B，經(jīng)離心(21，000Xg，2分鐘，室溫)后，倒除濾液。之后，繼續(xù)離心(21，000Xg，5分鐘，室溫)以去除殘留的酒精。最后將純化管柱(spincolumn)置于滅菌的微量離心管中,加入適量的沖提溶液至純化管柱(spincolumn)中并離心(21，000Xg，2分鐘，室溫)以沖提質粒DNA。將質粒貯存于_20°C中備用。[0070]實例3[0071]利用聚合酶鏈式反應擴增elt操縱子(operon)[0072]大腸桿菌忌熱毒素LTp-1的結構基因包括eltA及eltB。eltA基因的上游區(qū)域被稱之為A-box，含有基因轉錄所需的啟動子(promoter);eltB基因的下游區(qū)域被稱之為B-box,含有終止基因轉錄所需的終止子(terminator)。這些區(qū)域的核苷酸序列在不同菌株間有很高的同源性(Schloret〃/.，2000)。針對同源性為100%的區(qū)域設計兩條引物，包括ELjTORF(5’-AAGTCGCGACTAATAAAAATMTCAGGTTGCC-3’)(SEQIDN0.31)/ELT0RR(5’_GATAACCCTGCCATTTTCATCCAGTT_3’)(SEQIDN0.32)。以腸毒素產生性大腸桿菌的質粒DNA作為模板，利用ELTORF及ELTORR引物組合進行elt操縱子的擴增。在50yLPCR反應混合物中包含I倍ExTaq?緩沖液，200yM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP,IuM擴增引物，IOOng腸毒素產生性大腸桿菌的質粒DNA及1.25UTakaRaExTaq?DNA聚合酶。PCR的反應條件為:94°C下5分鐘(I個步驟);94°C下30秒、55°C下30秒、72°C下I分鐘40秒(35個循環(huán));以及72°C下7分鐘(I個步驟)。將PCR產物以PCRClean-Upkit(GeneMark,Taiwan)回收后，貯存于_20°C中備用。[0073]實例4[0074]elt操縱子(operon)的克隆(TA克隆，TAcloning)[0075]本實驗利用益生TA克隆試劑盒(TAcloningkit)進行。實驗步驟參考廠商提供的yT&A克隆載體試劑盒操作手冊進行。取5iiL經(jīng)PCR清潔處理試劑盒(cleanupkit)回收純化的PCR產物(eltoperonDNA)與2yLyT&A載體(vector)、IyL連接緩沖液A(ligationbufferA)、IuL連接緩沖液B和IuLT4DNA連接酶(lunit/uL)混合均勻后，于22°C反應30分鐘進行連接反應。將連接混合物(ligationmixture)轉化入大腸桿菌XLl-blue(Protech,Taiwan)中，轉化的條件依廠商提供的流程進行。轉化后的菌體加入ImLSOC再生培養(yǎng)液中，于37°C、250rpm的條件下震蕩60分鐘。之后，取適量菌液涂布于含氨芐西林(ampicillin)(最終濃度為100yg/mL)的固態(tài)培養(yǎng)基上，于37°C下培養(yǎng)16小時。之后，以菌落聚合酶鏈式反應(colonyPCR)篩選轉化株。菌落聚合酶鏈式反應實驗步驟如下所述。首先，先準備一微量離心管加入反應緩沖液、dNTP、引物、TakaraExTaq?DNA聚合酶(Takara，Japan)及加入滅菌水調整至適當體積，分裝于PCR小管(10yL/管)。隨后再以牙簽自培養(yǎng)皿上將菌落點至PCR小管，進行PCR反應。PCR反應條件為:95°C反應5分鐘(I個步驟)；95°C反應30秒、55°C反應30秒、72°C，反應I分鐘50秒(25個循環(huán))；72°C反應7分鐘(I個步驟)。利用DNA電泳確認有無預估大小的DNA片段。以菌落聚合酶鏈式反應確認轉化株中的重組質粒帶有嵌入DN`A后，再抽取轉化株中的質粒并進行DNA定序(源資國際生物科技股份有限公司)。將含有171、196及286菌株elt操縱子(opeixm)的質粒分別命名為TA-171ELT、TA-196ELT及TA-286ELT。[0076]實例5[0077]大腸桿菌忌熱毒素基因的定點突變[0078]利用重疊延伸聚合酶鏈式反應(overlapextensionpolymerasechainreaction,0EPCR)進行定點突變，突變的位置包括大腸桿菌忌熱毒素基因的第63號氨基酸-絲氨酸(Serine)的密碼子(codon),使其由變?yōu)橘嚢彼?lysine)的密碼子；此外,基因中的NdeI切位亦進行沉默突變(silentmutation)，使其由CATATG改變?yōu)镃GTATG(密碼子改變但不改變氨基酸)，以方便基因的克隆。首先設計EltAF(SEQIDN0.1)、S63KF(SEQIDN0.2)、S63KR(SEQIDN0.3)、NdeImutf(SEQIDN0.4)、NdeImutR(SEQIDN0.5)及EltBR(SEQIDN0.6)等六條引物；引物的序列如下列表一所示。[0079]表一、大腸桿菌忌熱毒素基因定點突變所使用的引物[0080]【權利要求】1.一種制備突變型大腸桿菌忌熱毒素的方法，其包含:(a)提供一大腸桿菌忌熱毒素的DNA序列，其至少包含一個A亞單位及一個B亞單位；(b)將該A亞單位的第63號氨基酸突變?yōu)橘嚢彼岬拿艽a子；(c)將該A及B亞單位中轉譯為信號肽的DNA分別取代為轉譯為大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽的DNA;及(d)將該大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽的第9號氨基酸突變?yōu)槔i氨酸的密碼子'及(e)將該步驟(d)所制得的突變大腸桿菌忌熱毒素的DNA置入大腸桿菌表達系統(tǒng)以制得突變型大腸桿菌忌熱毒素。2.如權利要求1所述的方法，其中當執(zhí)行該(e)步驟時，是先將該突變大腸桿菌忌熱毒素的DNA嵌入質粒，再將該質粒轉化入該大腸桿菌表達系統(tǒng)。3.如權利要求1所述的方法，其中在該(e)步驟之后，所產生的該突變型大腸桿菌忌熱毒素是采用固定化半乳糖樹脂進行純化。4.如權利要求1所述的方法，其中該突變型大腸桿菌忌熱毒素包含一個A亞單位及五個B亞單位。5.如權利要求1所述的方法，其中該步驟(a)的大腸桿菌忌熱毒素的DNA序列包含SEQIDN0.23,24或25。6.如權利要求1所述的方法，其中該大腸桿菌忌熱毒素的A亞單位包含氨基酸序列SEQIDN0.26。7.如權利要求1所述的方法，其中該大腸桿菌忌熱毒素的B亞單位包含氨基酸序列SEQIDN0.27。8.如權利要求1所述的方法，其中該大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽包含氨基酸序列SEQIDN0.14。9.如權利要求1所述的方法，其中該A亞單位的第63號氨基酸為絲氨酸。10.如權利要求1所述的方法，其中該大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽的第9號氨基酸為丙氨酸。11.如權利要求1所述的方法，其中當執(zhí)行該(b)步驟時，是利用引物進行重疊延伸聚合酶鏈式反應。12.如權利要求11所述的方法，其中該引物包含SEQIDN0.1、2、3、4、5及6。13.如權利要求1所述的方法，其中當執(zhí)行該(c)步驟時，是利用引物進行重疊延伸聚合酶鏈式反應。14.如權利要求13所述的方法，其中該引物包含SEQIDN0.7、8、9、10、11、12及13。15.如權利要求1所述的方法，其中當執(zhí)行該(d)步驟時，是利用引物進行重疊延伸聚合酶鏈式反應。16.如權利要求15所述的方法，其中該引物包含SEQIDN0.15、16、17及18。17.一種突變型大腸桿菌忌熱毒素，其包含:至少一個A亞單位及至少一個B亞單位；其中該A亞單位的第63號氨基酸為賴氨酸；該A亞單位及B亞單位的信號肽為一大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽，且該大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽的第9號氨基酸為纈氨酸。18.如權利要求17所述的突變型大腸桿菌忌熱毒素，其包含一個A亞單位及五個B亞單位。19.如權利要求17所述的突變型大腸桿菌忌熱毒素，其中該大腸桿菌外膜蛋白質的信號肽包含氨基酸序列SEQIDN0.14。20.如權利要求17所述的突變型大腸桿菌忌熱毒素，其具有SEQIDN0.30的DNA序列。21.如權利要求17所述的突變型大腸桿菌忌熱毒素，其是使用權利要求1至16中任一項的方法所制得。22.如權利要求17所述的突變型大腸桿菌忌熱毒素，其為經(jīng)減毒的大腸桿菌忌熱毒素。23.—種增加免疫反應的佐劑，其包含權利要求17至20中任一項所述的突變型大腸桿菌忌熱毒素。24.如權利要求23所述的佐劑，其誘發(fā)體液性免疫反應及/或細胞性免疫反應。25.一種疫苗，其包含:抗原及權利要求23的佐劑。26.如權利要求25所述的疫苗，其中該抗原包含豬肺炎霉?jié){菌黏附素P97的C端。27.如權利要求25所述的疫苗，其中該疫苗為細菌疫苗或病毒疫苗。28.如權利要求27所述的疫苗，其中該細菌包含病原性大腸桿菌、空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌、沙門氏桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、第二型豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、單核細胞增生李斯特菌、豬肺炎霉?jié){菌、豬鼻霉?jié){菌、丹毒菌、博德氏支氣管敗血癥桿菌、氣腫疽桿菌、破傷風梭菌、赤痢螺旋菌、雞副嗜血桿菌、水禽雷氏桿菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、鸚鵡披衣菌、雞敗血性霉?jié){菌、骨膜炎霉?jié){菌、家禽結核菌、白色念珠菌或其組合。29.如權利要求27所述的疫苗，其中該病毒包含血球凝集性腦炎病毒、日本腦炎病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬腸病毒、假性狂犬病病毒、口蹄疫病毒、豬流行性感冒病毒、第二型豬環(huán)狀病毒、豬生殖與呼吸綜合癥病毒、豬痘病毒、豬細小病毒、豬瘟病毒、白血病/肉瘤群病毒、傳染性法氏囊病病毒、家禽傳染性支氣管炎病毒、雞馬立克氏病病毒、關節(jié)炎病毒、雞傳染性貧血病毒、禽痘病毒、新城疫病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、腫頭癥候群病毒、雞產蛋下降癥候群病毒或其組合?！疚臋n編號】A61P31/04GK103773790SQ201210537762【公開日】2014年5月7日申請日期:2012年12月11日優(yōu)先權日:2012年10月24日【發(fā)明者】林俊宏,王志鵬,謝明偉,方健宇,曾皓真,杜清富申請人:財團法人臺灣動物科技研究所