一種優(yōu)化的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌多價抗原基因序列及其在預防斷奶仔豬腹瀉中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種合成的密碼子優(yōu)化的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌多價抗原基因序列及 其應用，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 斷奶仔豬腹瀉是長期困擾豬場和養(yǎng)殖戶的一個難題，不僅帶來直接的死亡損 失和巨額的藥費開支，還間接影響到康復豬下一階段的生長速度、育成率，危害相當嚴 重，成為全球范圍內(nèi)影響提高養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟效益的重要制約因素。腸產(chǎn)毒性大腸桿菌 (enterotoxigenicEsckrichiacoli，ETEC)是斷奶仔豬腹瀉的主要病原體，也是斷奶仔豬 腹瀉的重要誘因；其中以F4+、F18+ETEC占據(jù)明顯優(yōu)勢地位，因此控制F4+、F18+ETEC感染成 為防治斷奶仔豬腹瀉的關鍵環(huán)節(jié)。據(jù)報道，從斷奶仔豬腹瀉樣品中分離的ETEC多數(shù)表達 Stx2e毒素、STa毒素突變體、LT毒素、STb毒素等。新生仔豬從母體獲得的免疫力在斷奶 之后就不能有效抵抗病原微生物的感染，疫苗接種將成為是特異性預防ETEC的有效手段， 而安全有效的疫苗是成功地預防、控制ETEC引起的斷奶仔豬腹瀉的先決條件，然而目前還 沒有商品化的疫苗取得成功。
[0003] 國內(nèi)外的科研人員一直都在探索預防斷奶仔豬腹瀉主動免疫的策略和方法，在基 于F4+ETEC黏附素F4或者其主要成分的FaeG蛋白的亞單位疫苗或基因工程疫苗、核酸疫苗 研宄以及攜帶黏附素的無毒大腸桿菌口服活疫苗研宄等領域均取得積極進展。這些疫苗免 疫哺乳仔豬雖可以誘導一定程度的免疫應答，但是還不足以保護仔豬免受感染。分析其原 因，除了斷奶前后仔豬免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完善之外，至少包含以下幾點：①研宄使用的蛋白 類抗原口服后，在穿過胃腸屏障時損失較大，所剩免疫原無法有效被仔豬的免疫系統(tǒng)所識 另IJ;②不能在感染發(fā)生的部位誘導產(chǎn)生足夠多的slgA，而在黏膜免疫應答中slgA才是抵抗 感染的主力軍；③母源抗體干擾：針對菌毛粘附素的母源抗體，可能會使疫苗菌株在腸內(nèi) 無法定居，達不到激活免疫應答的有效細菌數(shù)量。④目前的研宄大都是基于F4、F4菌毛或 者其主要亞單位FaeG、FedF的，免疫原組成單一。事實上，抗毒素抗體在抵抗ETEC感染過 程中同樣起到重要作用。⑤沒有把免疫原有效地傳遞給APC，也沒有充分利用腸道的非特異 性免疫，無法激活更多的初始T細胞參與?；谏鲜鲈颍壳皣鴥?nèi)外研宄者都在尋求一種 更加安全和有效的可用于預防斷奶仔豬腹瀉的疫苗，以克服現(xiàn)有疫苗研宄中存在的缺點和 不足，其中，利用乳酸菌活載體構建的基因工程活載體疫苗被認為是一種前景的研宄方向。
[0004] 乳酸菌作為人和動物腸道主要的益生菌群之一，具有多種健康功效，諸如乳酸菌 能非特異性提高人和動物的胃腸道粘膜免疫功能，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸菌素、細菌素、乳酸和 其它多種有機酸類具有抑菌、抗腹瀉作用，在調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)，增強腸道粘膜免疫功能， 預防腸道傳染性疾病發(fā)揮重要作用；乳酸菌本身對黏膜有良好的黏附和腸道定植功能，并 且乳酸菌細胞壁的胞壁酰二肽亦具有免疫佐劑作用等。因此，乳酸菌可以作為表達外源抗 原的活載體，攜帶外源抗原基因的乳酸菌質(zhì)?？杀磉_相應外源蛋白并能誘導特異性的局部 黏膜和系統(tǒng)免疫應答，這為利用乳酸菌進行異性的疾病預防奠定了重要的理論和實踐基 礎。但是，目前乳酸菌活載體疫苗研宄的一個局限就是對其遺傳背景研宄減少，異源基因表 達量普遍較低，免疫原性較弱，免疫效果還比較差。如何提高異源基因表達量，尤其是抗原 的分泌表達量，提高免疫原性成為構建和設計乳酸菌活載體疫苗研宄的關鍵所在。
[0005] 迄今為止，還沒有包含有引起斷奶仔豬腹瀉的ETECF4+的主要結構蛋白FaeG、 F18+受體結合域RBD、Stx2e毒素、STa毒素突變體、LT毒素B亞單位、STb毒素6種抗原的融 合基因的報道，也未見到同時使用靶向M細胞的分子肽C01、靶向腸道細胞的分子肽YadA31 兩種靶向肽增強免疫應答的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一是提供一種優(yōu)化的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌多價抗原基因序列，該 基因含有編碼豬產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌抗原F4+FaeG(V94E)、F18受體結合域RBD、Stx2e毒 素、STa毒素突變體、LT毒素B亞單位、STb毒素共計6種抗原以及靶向M細胞的分子肽C01、 靶向腸道細胞的分子肽YadA31的基因，各基因間由柔性肽GGGGSlinker連接而成。
[0007] 本發(fā)明的目的之二是提供一種含有并且能夠高效表達上述基因的重組乳酸乳球 菌和重組大腸桿菌。
[0008] 本發(fā)明目的之三是將上述重組乳酸乳球菌和重組大腸桿菌應用于預防或治療 ETEC引起的斷奶仔豬腹瀉。
[0009] 本發(fā)明上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：
[0010] 本發(fā)明的一種優(yōu)化的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌多價抗原基因序列，含有編碼豬產(chǎn)腸毒 素性大腸桿菌抗原FaeG、F18受體結合域RBD、Stx2e毒素、STa毒素突變體、LT毒素B亞單 位、STb毒素共計6種抗原以及靶向M細胞的分子肽C01、靶向腸道細胞的分子肽YadA31的 基因，各基因間由柔性肽GGGGS連接而成，所述多價抗原基因的核苷酸序列為SEQIDNO: 1 所示。
[0011] 進一步的，本發(fā)明還提出了一種產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌多價抗原，其由SEQIDN0:1 所示的核苷酸序列編碼。
[0012] 含有本發(fā)明所述的優(yōu)化的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌多價抗原基因序列的宿主細胞也 在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0013] 其中，優(yōu)選的，所述的宿主細胞為重組乳酸乳球菌或重組大腸桿菌。
[0014] 將SEQIDNO:1所示的堿基序列與乳酸乳球菌表達載體相連接，得到重組乳酸乳 球菌表達載體；將重組乳酸菌載體電轉(zhuǎn)化導入宿主菌中即可篩選到得到一種重組乳酸乳球 菌，該重組乳酸菌可以分泌的形式表達上述基因所編碼的抗原蛋白。該重組菌即可作為有 效活性成分制備基因工程活載體疫苗免疫仔豬。
[0015] 將SEQIDNO:1所示的堿基序列與大腸桿菌表達載體相連接，得到重組大腸桿菌 表達載體；將重組大腸桿菌表達載體轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21中，篩選，鑒定，即可得到能夠高效 表達帶有靶向分子的ETEC多價抗原的一種重組大腸桿菌。大量培養(yǎng)后，誘導表達，經(jīng)純化 即可獲得表達上述基因所編碼的抗原蛋白的包涵體蛋白。后者即可作為有效活性成分制備 基因工程亞單位疫苗免疫仔豬。
[0016] 再進一步的，本發(fā)明還提出了所述的優(yōu)化的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌多價抗原基因序 列在制備豬產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌多價抗原或基因工程活載體疫苗中的應用。及
[0017] 所述的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌多價抗原在制備預防或治療腸產(chǎn)毒性大腸桿菌引起 的斷奶仔豬腹瀉的藥物中的用途。以及
[0018] 所述的宿主細胞在制備預防或治療腸產(chǎn)毒性大腸桿菌引起的斷奶仔豬腹瀉的藥 物中的用途。
[0019] 相較于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果在于：
[0020] 1、該基因涵蓋了引起斷奶仔豬腹瀉ETEC中的以占據(jù)明顯優(yōu)勢地位F4+、F18+ETEC 負責黏附的菌毛關鍵部位和四種最為常見的毒素基因，其表達產(chǎn)物誘導產(chǎn)生的抗體不但 可以抵抗F4+、F18+ETEC黏附，中和其產(chǎn)生的毒素，還可以中和其他非F4+、F18+ETEC產(chǎn)生的 Stx2e毒素、STa毒素、LT毒素、STb毒素，將會誘導產(chǎn)生更加廣泛的、更加全面的保護性應 答反應。
[0021] 2、優(yōu)化的雙靶向型ETEC多價抗原編碼基因在重組乳酸乳球菌中的表達量提高， 并且以分泌形式表達目的蛋白量得到明顯提高。表達的蛋白也具有良好的抗原性。
[0022] 3、用本發(fā)明制備的重組乳酸菌免疫動物，具有良好的免疫原性，口服動物可以誘 導產(chǎn)生特異性體液免疫和細胞免疫應答，也可產(chǎn)生局部黏膜免疫應答。靶向分子具有提高 免疫效果的作用，并且這兩個靶向分子具有協(xié)同增強免疫應答的能力。本發(fā)明制備的重組 乳酸菌可以作為基因工程活載體疫苗使用。
[0023] 4、優(yōu)化的雙靶向型ETEC多價抗原編碼基因插入大腸桿菌表達載體，導入宿主菌 后，依然能夠?qū)崿F(xiàn)重組融合蛋白的大量表達，表達的蛋白具有抗原性；用本發(fā)明所制備的 重組大腸桿菌表達所得的包涵體直接作為活性成分免疫動物，就可以誘導動物產(chǎn)生免疫應 答，同樣具有良好的免疫原性，同時靶向分子具有提高免疫效果的作用。該包涵體可以作為 基因工程亞單位疫苗使用。
[0024] 5、采用本發(fā)明重組蛋白以包涵體形式用作基因工程亞單位疫苗經(jīng)口服、滴鼻、肌 肉注射等途徑，或者以重組乳酸乳球菌用作基因工程活載體疫苗經(jīng)口服、滴鼻等途徑，用于 預防斷奶仔豬F4+、F18+ETEC感染，能夠有效的保護仔豬抵抗至少2X101(ICFUETEC攻擊，疫 苗免疫后產(chǎn)生的免疫應答可以縮短感染豬的排毒時間，對減少豬場內(nèi)感染機會，豬群快速 恢復健康狀態(tài)具有重要意義。此外，口服免疫乳酸菌活載體疫苗還可以提高和改善試驗豬 攻毒后的平均日增重。
[0025] 6、本發(fā)明的制備方法簡單，生產(chǎn)成本低廉。
【附圖說明】
[0026] 圖1為基因組織結構不意圖；
[0027] 圖2為基因點突變引起的親水性變化分析；
[0028] 圖3為pNZ8112載體圖譜；
[0029] 圖4為重組乳酸乳球菌培養(yǎng)上清（a)與菌體（b)中表達目的蛋白的westernBlot 鑒定圖；
[0030] 其中泳道1蛋白分子量標準；2含PNZ8112載體的重組乳酸乳球菌誘導后培養(yǎng)上 清（a)與菌體（b) ;3pNZ8112-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb/NZ9000 誘導后培養(yǎng)上清 (a)與菌體（b) ;4pNZ8112-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-col/NZ9000 誘導后培養(yǎng)上 清（a)與菌體（b) ;5pNZ8112-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-col-YadA31/NZ9000 誘 導后培養(yǎng)上清（a)與菌體（b) ;6pNZ8112-FaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-col-YadA31/ NZ9000誘導后培養(yǎng)上清（a)與菌體（b)
[0031] 圖5是優(yōu)化的基因在重組大腸桿菌中表達的SDS-PAGE電泳圖；
[0032] 其中泳道1蛋白分