影響斷奶仔豬的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌f41性腹瀉病抗性的主效snp標(biāo)記及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動物分子生物學(xué)技術(shù)及育種領(lǐng)域，涉及影響斷奶仔豬的產(chǎn)腸毒素大腸 桿菌F41性腹瀉病抗性的主效SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 畜禽傳染病每年給全世界畜禽生產(chǎn)造成巨額的經(jīng)濟(jì)損失，發(fā)達(dá)國家由此造成的損 失占年交易額的17% (17億英鎊），在發(fā)展中國家高達(dá)35% -50%。仔豬腹瀉病是養(yǎng)豬生產(chǎn) 中的常見疾病，因腹瀉病引起的仔豬死亡率達(dá)11. 5% -29. 5%，其中因大腸桿菌引起的發(fā) 病率和死亡率占整個豬腹瀉發(fā)病率與死亡率的56. 2%和24. 7%。大腸桿菌病嚴(yán)重影響仔 豬生長發(fā)育，導(dǎo)致生長效率下降，生長發(fā)育停滯，有的形成僵豬，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損 失。雖然藥物治療及傳統(tǒng)的免疫接種對預(yù)防和治療斷奶前仔豬腹瀉病取得了一定的效果， 但隨著人們對動物福利和綠色環(huán)境保護(hù)意識的增強(qiáng)，世界各國開始逐步重視健康養(yǎng)殖業(yè)生 產(chǎn)，同時藥物和疫苗在疾病控制中所帶來的諸如耐藥性和有害殘留等負(fù)面效應(yīng)問題也越來 越受到人們的關(guān)注。此外，致病性大腸桿菌（Eschoerchia coli，E.coli)的抗原特性是可 變的，已發(fā)現(xiàn)的E. coli菌體0抗原血清型就有164種，給研制疫苗及藥物治療帶來很大困 難。因此，從根本上開展豬對E. coli抗性的遺傳機(jī)制研宄，將開辟仔豬腹瀉抗病育種新途 徑。
[0003] 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引發(fā) 新生及斷奶前仔豬腹瀉的主要致病菌，根據(jù)其菌毛所產(chǎn)生的黏附素主要有K88、F41、 K99、987P、F18 等亞型（Moon et al. 1999, Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 6, 557-560)。ETEC F41是其中的一個亞型，是引起仔豬腹瀉的重要病原菌 之一。ETEC F41利用其菌毛黏附素結(jié)合到小腸上皮細(xì)胞特異性受體上，在體內(nèi)大量繁殖、分 泌腸毒素，腸毒素通過胞吞作用滲入小腸細(xì)胞，導(dǎo)致小腸上皮細(xì)胞分泌功能亢進(jìn)，大量水和 電解質(zhì)溶液滲入腸腔，致使腸腔中大量液體積蓄，超過腸細(xì)胞的重吸收能力從而引發(fā)腹瀉 疾病。
[0004] Morris(Morris et al. Journal of General Microbiology, 1978, 107:173-175) 于1978年首次報道了 F41菌毛，該菌毛主要黏附幼畜（仔豬、羔羊等）的空腸和回腸 。De Graaf 等（De Graaf et al. Infection and Immunity, 1982, 36:751-758)于 1982 年從 B41菌株的突變株中提純了該菌毛并命名為F41抗原，F(xiàn)41菌毛呈細(xì)絲狀結(jié)構(gòu)，平均直徑 為3. 2nm，其分子質(zhì)量約30kDa，等電點為pH4. 6,能凝集豚鼠、綿羊、人和馬的紅細(xì)胞。van Zijderveld等（van Zijderveld et al. Vet Q. 1998, 20Suppl 3:S73_8)用單克隆抗體鑒別 出5種F41菌毛抗原決定簇（F41-1~F41-5)，同時證實F41-1抗原決定簇介導(dǎo)了 F41菌對 豬小腸上皮細(xì)胞的黏附和豬紅細(xì)胞的凝集，受體性質(zhì)是血型糖蛋白和D-半乳糖。
[0005] 上述研宄均是主要針對病原體的，并沒有針對動物主體從遺傳的角度進(jìn)行研宄， 不能從根本上解決仔豬腹瀉病的問題。因此，目前存在的問題是需要尋找影響仔豬腹瀉病 性狀的基因以及單核苷酸多態(tài)性（SNPs)位點，以期建立標(biāo)記輔助選擇技術(shù)從而通過開展 斷奶仔豬的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F41性腹瀉病的抗病育種工作來從根本上解決仔豬腹瀉病 的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種影響斷奶仔豬的產(chǎn) 腸毒素大腸桿菌F41性腹瀉病抗性的主效SNP標(biāo)記，該主效SNP標(biāo)記位于豬4號染色體上 的ST3GAL1基因上；同時本發(fā)明還提供了鑒定上述主效SNP標(biāo)記的引物；并且本發(fā)明還提 供了上述主效SNP標(biāo)記在抗斷奶仔豬的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F41性腹瀉病性狀相關(guān)的種豬選 育中的應(yīng)用。
[0007] 為此，本發(fā)明第一方面提供了影響斷奶仔豬的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F41性腹瀉病抗 性的主效SNP標(biāo)記，其位于豬4號染色體上的ST3GAL1基因上，包括主效SNP標(biāo)記I和/或 主效SNP標(biāo)記II ;其中，主效SNP標(biāo)記I的位點為如SEQ ID NO: 1所示的DNA序列（核苷酸 序列）的第513位；主效SNP標(biāo)記II的位點為如SEQ ID NO: 2所示的DNA序列的第173位。
[0008] 本發(fā)明中，所述主效SNP標(biāo)記I為T與A的突變；所述主效SNP標(biāo)記II為A與G的 突變。
[0009] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述主效SNP標(biāo)記I的位點為豬4號染色體上的 ST3GAL1基因上的如SEQ ID NO: 1所示的DNA序列的第513位（即如SEQ ID NO: 1所示的 DNA序列中標(biāo)記為w加方框的位置），且其為T與A的突變（對應(yīng)于國際豬基因組10. 2版 本參考序列4號染色體上第7762963個核苷酸位點[T I A]突變，即g. 7762963 [T I A])。
[0010] 在本發(fā)明的另一個實施例中，所述主效SNP標(biāo)記II的位點為豬4號染色體上的 ST3GAL1基因上的如SEQ ID NO: 2所示的DNA序列的第173位（即如SEQ ID NO: 2所示的 DNA序列中標(biāo)記為r加方框的位置），且其為A與G的突變（對應(yīng)于國際豬基因組10. 2版 本參考序列4號染色體上第7768128個核苷酸位點[A I G]突變，即g. 7768128 [A I G]。 [0011] 本發(fā)明第二方面提供了鑒定本發(fā)明第一方面所述的主效SNP標(biāo)記的引物，其中， SNP標(biāo)記I上游引物序列為5'-TCC TCA ACT ACT CGC ACA CCG-3'，下游引物序列為5'-AAC AGA TGC TGA ACG GGT GA-3'，以及 SnaPshot 反向延伸引物序列為 5'-TTT TTT TTT TTT TTT TTG TAA GTG TCT TCC TCC AGG-3'；SNP 標(biāo)記 II 上游引物序列為 5'-CGT GAC GTG CGT GTA TCC TTC-3'，下游引物序列為 5' -GAG CAG GTG GTT TCG GTA GAG-3'。
[0012] 本發(fā)明第三方面提供了鑒定本發(fā)明第一方面所述的主效SNP標(biāo)記在與抗斷奶仔 豬的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F41性腹瀉病性狀相關(guān)的種豬選育改良中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明中，優(yōu)選所述豬為杜洛克豬或含有杜洛克血緣的豬。
[0014] 本發(fā)明第四方面提供了一種種豬遺傳改良的方法，其中，種豬繼代選育豬4號染 色體上的ST3GAL1基因中的SEQ ID NO: 1上的第513位的AA型個體和/或其SEQ ID NO: 2 上的第173位的GG型個體，淘汰SEQ ID NO: 1上的第513位的AT基因型和TT基因型個體 和/或淘汰SEQ ID NO: 2上的第173位的AG基因型和AA基因型個體。
[0015] 本發(fā)明第五方面提供了一種檢測豬的抗斷奶仔豬的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F41性腹 瀉病性狀的方法，包括檢測如SEQ ID NO: 1所示的DNA序列中的5'端第513位核苷酸為A 還是T，或者檢測如SEQ ID N0:2所示的DNA序列中的5'端第173位核苷酸為A還是G，確 定基因型，然后通過基因型確定豬的抗斷奶仔豬的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F41性腹瀉病性狀。
[0016] 本發(fā)明第六方面提供了位于豬4號染色體上的ST3GAL1基因上的DNA序列，其中， 所述序列為SEQ ID NO: 1的第513位核苷酸為A的DNA序列，或所述序列為SEQ ID NO: 2 的第173位核苷酸為G的DNA序列。
[0017] 本發(fā)明第七方面提供了一種本發(fā)明第六方面所述的DNA序列在與抗斷奶仔豬的 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F41性腹瀉病性狀相關(guān)的種豬選育中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明中，優(yōu)選所述豬為杜洛克豬或含有杜洛克血緣的豬。
【附圖說明】
[0019] 下面將結(jié)合附圖來說明本發(fā)明。
[0020] 圖1為本發(fā)明鑒別的豬ST3GAL1SNP A513T突變位點的序列峰圖。
[0021] 圖2為本發(fā)明鑒別的豬ST3GAL1SNP A173G突變位點的序列峰圖。
[0022] 圖3為SNP A513T位點的SNaPshot判型圖；圖中附圖標(biāo)記的含義如下：a AA型； b AT 型；c TT 型。
[0023] 圖4為SNP A173G位點的PCR-BcII-RFLP瓊脂糖凝膠電泳判型圖；圖中附圖標(biāo)記 的含義如下：1、2、3和IOGG型；4和5AA型；6、7、8、9和IlGA型；12分子量標(biāo)記。
[0024] 圖5為ETEC F41與刷狀緣（小腸上皮細(xì)胞組織）的黏附檢測結(jié)果；圖中附圖標(biāo)記 的含義如下：(a)不黏附細(xì)菌的刷狀緣顯微照片；(b)黏附細(xì)菌的刷狀緣顯微照片。
【具體實施方式】
[0025] 為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結(jié)合實施例和附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明，這些實 施例僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
[0026] 如前所述，現(xiàn)有的研宄均是主要針對病原體的，并沒有針對動物主體從遺傳的角 度進(jìn)行研宄，不能從根本上解決仔豬腹瀉病的問題。本發(fā)明的發(fā)明人為了開辟解決仔豬腹 瀉病的問題的新途徑，嘗試?yán)矛F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)尋找影響仔豬腹瀉病性狀的基因以及 單核苷酸多態(tài)性（SNPs)位點，并對其與仔豬腹瀉病性狀的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了深入的研宄，獲得 兩個影響斷奶仔豬對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F41腹瀉病抗性的主效SNP標(biāo)記。
[0027] 首先，本發(fā)明的發(fā)明人利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)搜尋影響斷奶仔豬對產(chǎn)腸毒素大 腸桿菌F41腹瀉病抗性的基因，具體方法如下：
[0028] 本發(fā)明的發(fā)明人前期利用151個微衛(wèi)星標(biāo)記在大規(guī)模白色杜洛克X二花臉資源 家系群體中開展全基因組掃描，將ETEC F41受體基因初步定位在豬4號染色體Sw2509和 S0301標(biāo)記間約5. 04Mb的區(qū)域（