專利名稱：：大腸桿菌定居因子抗原蛋白轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法及產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及表達(dá)毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白及其衍生物轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法，并進(jìn)而通過直接食用或腸道給藥的方式利用這些含有大腸桿菌定居因子抗原蛋白的轉(zhuǎn)基因植物及其衍生物從而引起人或哺乳動物對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)。腹瀉病廣泛流行于世界各地，是當(dāng)今全球性的公共衛(wèi)生問題之一。它們不僅是發(fā)展中國家嬰幼兒發(fā)病和死亡的主要原因，也是發(fā)達(dá)國家常見的食物性細(xì)菌感染和中毒的主要傳染性疾病。引起傳染性腹瀉的病原很多，但其中最常見的病原之一是毒素源性大腸桿菌(E.coli，ETEC)，據(jù)最新的統(tǒng)計資料表明，全球每年因ETEC感染引起的腹瀉病例高達(dá)6.5億人次，導(dǎo)致80余萬5歲以下嬰幼兒死亡。ETEC的致病因子包括兩類毒性因子，即腸毒素和定居因子(colonizationfactor，CS)表面抗原。其中腸毒素包括耐熱腸毒素(heat-stabletoxin，ST)和熱敏腸毒素(heat-labiletoxin，LT)兩種。ST是含19個氨基酸殘基的蛋白小肽，因其分子量小而幾乎沒有免疫原性，當(dāng)它與靶細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合后，活化鳥苷酸環(huán)化酶-環(huán)鳥苷酸系統(tǒng)(guanylate-cyclasecGMPsystem)，通過cGMP途徑，影響細(xì)胞生理功能，導(dǎo)致水和電解質(zhì)流失而致病。LT由一個A亞基和5個B亞基蛋白構(gòu)成，它們分別行使不同的生物學(xué)功能。B亞基可與靶細(xì)胞膜上的受體-神經(jīng)節(jié)苷酯(GM-1)結(jié)合，形成蛋白通道，然后A亞基進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)激活腺苷酸環(huán)化酶-環(huán)腺苷酸系統(tǒng)(adenylatecyclasecAMPsystem)，引起細(xì)胞脫水和電解質(zhì)平衡失調(diào)，從而產(chǎn)生水樣類腹瀉。LTB亞基無毒且具有很強的免疫原性，因此是生產(chǎn)口服類疫苗的理想抗原蛋白[1]。菌毛抗原(定居因子)在毒素源性大腸桿菌與哺乳動物腸道表皮細(xì)胞相互識別過程中起重要作用。只有在相互識別之后，大腸桿菌才能夠?qū)⒍舅貙?dǎo)入到靶細(xì)胞中。已知能夠侵染人的ETEC可產(chǎn)生20種不同血清型的定居因子，其中CS6是其中最常見的7種定居因子之一。CS6或單獨存在或與其它定居因子(CS4，CS5，CFA/III)同時產(chǎn)生，但只有含有CS6的ETEC才能夠引起人的腹瀉[2]。有實驗表明，用CS6陽性菌株免疫動物，能引起腸道抗定居免疫反應(yīng)，而攻毒實驗也證明CS6是CFA/IV三種抗原中最重要的保護(hù)性抗原[3]。故專家建議，新研制的ETEC疫苗一定應(yīng)該把CS6包括在內(nèi)。已知CS6全基因可以編碼cssA、cssB、cssC和cssD4種蛋白。cssC是伴侶蛋白，它主要保護(hù)cssA和cssB不受蛋白酶所降解和護(hù)送它們通過細(xì)胞周質(zhì)到外膜，cssD是引導(dǎo)蛋白，它在接收cssA和cssB亞基后，把它們呈現(xiàn)到細(xì)菌細(xì)胞的外膜表面。盡管CS6菌毛抗原蛋白的詳細(xì)結(jié)構(gòu)目前還不是很清楚，但可以確定的是，cssA和cssB亞基才是構(gòu)成定居因子的主要成份。另外，值得提出的是，其它定居因子只含有一種蛋白亞基成份，而CS6則含有多種成份，這也許可能就是CS6對ETEC非常重要的原因之一。大量的實驗研究表明，人或其它哺乳動物在受到病原感染后會產(chǎn)生多種免疫應(yīng)答反應(yīng)以抵御這種病原的入侵。該過程至少涉及以下三種免疫機制之一粘膜、體液或細(xì)胞。粘膜免疫應(yīng)答產(chǎn)生分泌型抗體IgA，可保護(hù)呼吸道、消化道、生殖系統(tǒng)和腺體表面不受侵染。粘膜抗體可阻止病原在粘膜表面定居從而構(gòu)成第一道防御屏障。粘膜抗體的產(chǎn)生可通過分泌性腺體和組織的局部免疫而獲得，也可通過刺激腸道和呼吸道淋巴組織產(chǎn)生。另一方面，體液免疫主要涉及IgG和IgM，它們在血液中參與侵入病原的吞噬，病毒中和或有補體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。研究人員已經(jīng)注意到口服接種也可誘導(dǎo)血液和粘膜抗體的產(chǎn)生，通常的情況是口服接種需要比較多的抗原，這是因為這些抗原被實際吸附和利用的數(shù)量比較少。因此，在一般情況下，口服接種所需要的抗原數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過注射接種[4]。然而，也有例外，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，一些蛋白只需要口服少量就能夠產(chǎn)生體液和粘膜免疫應(yīng)答，原因是這些蛋白能夠與粘膜表面的糖脂或糖蛋白特異性結(jié)合，因此，這些蛋白也被稱為粘膜性抗原，例如病毒性血凝素。口服和肌肉注射劑量比較實驗表明，粘膜類抗原也能夠非常有效地引起體液免疫，與肌肉注射相比，二者之間只有輕微的差別。大腸桿菌定居因子抗原蛋白、特別是CS6B亞基抗原蛋白可能也屬于粘膜性抗原。基因工程研究領(lǐng)域的最新進(jìn)展使植物表達(dá)外源基因成為可能。含有外源基因的植物細(xì)胞可再生出完整植株，并將外源基因穩(wěn)定地遺傳給后代。迄今有些單子葉和雙子葉植物都已經(jīng)進(jìn)行了成功的轉(zhuǎn)化。例如煙草、馬鈴薯、番茄、大豆、苜蓿和玉米等。農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的雙子葉植物轉(zhuǎn)化已有眾多報道。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法可有效地進(jìn)行外源基因的導(dǎo)入、遺傳轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選和轉(zhuǎn)基因植株的再生。單子葉植物經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化比較困難，但也可以利用其它的轉(zhuǎn)化方法如PEG和電融合法。有人成功地將外源基因?qū)胗衩住⑺竞托←湹脑|(zhì)體中。然后從轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生出完整的植株。一些新的轉(zhuǎn)化方法如微管注射法和基因槍法在單子葉植物轉(zhuǎn)化和再生中可能更加有效。植物是一種多樣化、低成本和可再生的材料資源，而生物技術(shù)的迅速發(fā)展則使我們進(jìn)一步拓寬了植物的使用范圍，國外在植物中采用這種“分子農(nóng)業(yè)”的方法，已經(jīng)成功地生產(chǎn)了越來越多的有用物質(zhì)，其中包括一些高價值藥用蛋白多肽，如人的細(xì)胞生長因子、促紅細(xì)胞生成素、干擾素、生長激素、單克隆抗體和可作為疫苗用的抗原蛋白等[5-24]，一些研究機構(gòu)和公司已經(jīng)開始從這些藥物蛋白的生產(chǎn)中獲得巨大的經(jīng)濟效益。已有人嘗試在植物中表達(dá)乙型肝炎病毒包膜小蛋白(S)，發(fā)現(xiàn)在植物中產(chǎn)生的HBsAg抗原與源自人血液或基因工程酵母中的HBsAg具有相似的抗原特性和物理特性，并進(jìn)而提出了“食物疫苗”的概念，為此，還申請了相關(guān)專利[25]。然而，在本發(fā)明之前，還沒有人利用植物表達(dá)毒素源性大腸桿菌定居因子、特別是CS6B亞基抗原蛋白，而這類蛋白有可能通過食用或腸道給藥的方式使人體或其他哺乳動物產(chǎn)生專門針對毒素源性大腸桿菌的保護(hù)性抗體。在本發(fā)明之前，盡管已有人提出“食物疫苗”的概念，但在具體操作中存在很大困難，因為植物中的表達(dá)的抗原蛋白含量不確定，且植物不同個體或同一植物個體的不同器官之間存在很大差異，人或動物直接食用這種轉(zhuǎn)基因植物就會產(chǎn)生很大風(fēng)險，長時間食用含少量抗原蛋白的植物材料會引起免疫耐受性，而短時間食用過多抗原蛋白又會引起超敏反應(yīng)。本發(fā)明首次提出將含有毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白的轉(zhuǎn)基因植物食用部分加工成膠囊、沖劑或其它制劑的方法，由于可對其中所含的抗原蛋白進(jìn)行嚴(yán)格的定量，從而對人或哺乳動物的食用間隔和食用量有了明確的規(guī)定，由此克服了直接食用轉(zhuǎn)基因植物存在的上述缺點。本發(fā)明提供表達(dá)毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建方法以及如何應(yīng)用含該重組抗原蛋白轉(zhuǎn)基因植物的方法。本項發(fā)明特別適用于中國或其它發(fā)展中國家。本發(fā)明利用可以食用的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白，該重組蛋白在免疫原性方面與天然蛋白類似。按照一個優(yōu)先的實施方案，就是本發(fā)明提供了表達(dá)毒素源性大腸桿菌定居因子CS6B亞基抗原蛋白轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法以及如何具體應(yīng)用這種含重組抗原蛋白轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)細(xì)菌抗原蛋白，如果將其加工成口服膠囊、沖劑或其它制劑，則具有廉價、安全和使用方便的特點，會使更多的人或動物得到保護(hù)。按照一個優(yōu)先的實施方案，人或哺乳動物只需食用這些轉(zhuǎn)基因植物的果實、汁液、根、莖、葉或植物的其它部分，或以腸道給藥的方式利用這些轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物粗提取物(可定量)制備的膠囊、沖劑或其它制劑便可獲得對疾病的免疫能力。這里的植物是指人們?nèi)粘Ｋ秤玫模瑫r由于避免了提純過程，降低了生產(chǎn)成本和存在的其它一些不利因素。按照一個實施方案，本發(fā)明涉及利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)含大腸桿菌抗原蛋白膠囊、沖劑或其它制劑的方法。生產(chǎn)這種膠囊、沖劑或其它制劑的轉(zhuǎn)基因植物材料可以有多種方式，可以是完整植物，或植物的一部分如果實、葉子、莖和塊莖，或植物某一部分的粗提物、或經(jīng)完全純化以及部分純化源自轉(zhuǎn)基因植物的毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白?？傊?，采用何種方式主要取決于該抗原蛋白本身的免疫原性，產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)所需這種源自轉(zhuǎn)基因植物的抗原的劑量以及在這種成份中所含的干擾免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)的多少，如糖類、熱原和毒素等，并盡量降低免疫耐受性的產(chǎn)生。本發(fā)明所指的抗原蛋白是指在轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)的，首先是編碼細(xì)菌抗原蛋白的基因被分離出來，然后插入到一個含有選擇標(biāo)記的質(zhì)粒上，啟動子位于該基因的上游，它操縱該基因在植物中的表達(dá)。外源基因在植物各器官或可食用部分中表達(dá)后，人或動物可食用這部分植物組織。本發(fā)明提供了在植物細(xì)胞中生產(chǎn)細(xì)菌定居因子抗原蛋白的方法，按照一個優(yōu)先的實施方案，本發(fā)明提供了在植物細(xì)胞中生產(chǎn)定居因子CS6B亞基重組抗原蛋白的方法，而該蛋白已知在天然狀態(tài)下可引起哺乳動物產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。或者說，本發(fā)明所指的細(xì)菌重組蛋白可作為抗原，具有與源自毒素源性大腸桿菌CS6B亞基蛋白一樣的免疫原性。或者更確切說，本發(fā)明的抗原蛋白與源自毒素源性大腸桿菌或其它常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的該抗原蛋白一樣，均能夠通過口服和腸道給藥的方式引起免疫應(yīng)答反應(yīng)。按照一個優(yōu)先的實施方案，這種細(xì)菌重組蛋白是一種抗原蛋白，它可以在植物細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生，且具有與源自毒素源性大腸桿菌或其它常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的該抗原蛋白相似的免疫原性。本發(fā)明的抗原可在植物中表達(dá)產(chǎn)生，而表達(dá)產(chǎn)生該抗原的植物至少有一部分是可以直接食用或經(jīng)過粗加工后可以食用，例如番茄和苜蓿等。這種植物或植物的食用部分不應(yīng)具有毒性，因此，許多常見的食用植物都包括在本發(fā)明所定義的植物范圍之內(nèi)。此外，在某些情況下，如馬鈴薯，在這里也被認(rèn)為是可食用植物，盡管它的某些部分被認(rèn)為是有毒的(馬鈴薯塊莖部分是無毒的，因此屬于本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)，但它的果實是有毒的)，在這種情況下，這種植物也應(yīng)包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。本發(fā)明的重組抗原蛋白可以是該細(xì)菌天然抗原蛋白的全部。然而，在某些具體實施方案中，抗原也可能只是該天然蛋白分子的一部分。有時，抗原可與另外一個多肽或蛋白分子如細(xì)菌熱敏毒素B亞基(LTB)蛋白多肽結(jié)合在一起形成融合蛋白。蛋白的融合可以通過蛋白翻譯后加工、共價結(jié)合的方式，或者通過DNA重組技術(shù)使基因在翻譯表達(dá)前就連接在一起，這兩種技術(shù)是本領(lǐng)域?qū)＜以缫咽熘募夹g(shù)。在本發(fā)明的其它實施方案中，一種表達(dá)毒素源性大腸桿菌定居因子CS6B亞基重組抗原蛋白的轉(zhuǎn)基因植物被構(gòu)建。就本發(fā)明而言，一種轉(zhuǎn)基因植物至少應(yīng)該在該植物的部分細(xì)胞中表達(dá)了毒素源性大腸桿菌定居因子重組抗原蛋白。按照本發(fā)明的某些優(yōu)先實施方案，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物至少有一部分是可以食用的，其所表達(dá)的抗原是毒素源性大腸桿菌定居因子CS6B亞基重組抗原蛋白，它能夠引起免疫應(yīng)答反應(yīng)，特別是粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)，就如同天然蛋白或其它表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的抗原蛋白一樣。本發(fā)明涉及到了一種食物的組成問題，該食物中至少含有轉(zhuǎn)基因植物的某些食用部分，這里的轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)能夠表達(dá)毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白。就本發(fā)明而言，植物或植物的某一部分被認(rèn)為應(yīng)該具有某些營養(yǎng)價值，它能夠為人或其它哺乳動物提供代謝所需的能量，維生素和其他輔助因子。盡管萵苣并不大量提供能量、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪，但就因為它含有重組抗原蛋白而被人們特意食用的話，萵苣也應(yīng)包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。萵苣的粗纖維對哺乳動物的健康是有利的，即使哺乳動物并不能夠消化萵苣的粗纖維。本發(fā)明涉及到了一種膠囊、沖劑或其它制劑的組成成份問題，膠囊、沖劑或其它制劑中至少含有轉(zhuǎn)基因植物的某些食用部分，這里的轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)能夠表達(dá)毒素源性大腸桿菌定居因子重組抗原蛋白。就本發(fā)明而言，膠囊、沖劑或其它制劑中含有的抗原蛋白應(yīng)該能夠精確定量，以避免人或哺乳動物食用后產(chǎn)生免疫耐受性。按照本發(fā)明的一個優(yōu)先實施方案，本發(fā)明的膠囊、沖劑或其它制劑所含有的抗原是毒素源性大腸桿菌定居因子CS6B亞基抗原蛋白，它能夠引起免疫應(yīng)答反應(yīng)，特別是粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)，就如同天然蛋白或其它表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的抗原蛋白一樣。因此，按照一個更加具體的實施方案，本發(fā)明所指的食物將至少包括轉(zhuǎn)基因植物的一部分，它具有某些營養(yǎng)價值，并含有毒素源性大腸桿菌定居因子CS6B亞基本身或與其他蛋白形成的融合蛋白或衍生物，而該抗原蛋白能夠與人或哺乳動物粘膜細(xì)胞膜表面的糖基化分子受體結(jié)合。在任何情況下，本發(fā)明的食物都包括植物的根、莖、葉、果實或所說的植物種子。對本發(fā)明所使用的方法和其它相關(guān)事項極為重要的是一些質(zhì)粒載體的構(gòu)建，它們在獲得本發(fā)明所指的轉(zhuǎn)基因植物以及轉(zhuǎn)基因植物的加工應(yīng)用中起重要作用。用于轉(zhuǎn)化植物的質(zhì)粒載體由編碼毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白基因或其衍生物的DNA序列和操縱該DNA序列在所說的植物中表達(dá)的一個植物啟動子組成。在某些具體實施方案中，質(zhì)粒載體還包括一個選擇或標(biāo)記基因，主要用于轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞的檢測。在某些具體實施方案中，本發(fā)明的植物啟動子是花椰菜花葉病毒35S啟動子。正如上面所述，按照某些具體的實施方案，本發(fā)明的質(zhì)粒載體用于轉(zhuǎn)化可食用植物，它編碼的抗原是一種粘膜抗原，更進(jìn)一步說，質(zhì)粒載體所編碼的抗原能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)，特別是粘膜性免疫應(yīng)答反應(yīng)，就象天然蛋白和源自其它表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的該抗原蛋白一樣。本發(fā)明提供的DNA片段可用于基因槍法轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明也提供了獲得轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，它包括以下步驟1.構(gòu)建一個質(zhì)粒載體或者一段DNA序列，其中都含有編碼毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白基因或其衍生物的基因，而且該基因被置于一個植物啟動子的操縱之下；2.用質(zhì)粒載體或上述DNA片段轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。按照一個優(yōu)先的實施方案，還包括從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株的方法。本發(fā)明提供了各種植物細(xì)胞或植物的轉(zhuǎn)化方法。盡管在下面描述的某些優(yōu)先實施方案中僅利用了特定的轉(zhuǎn)化方法，但顯而易見的是，本領(lǐng)域?qū)＜宜缫咽熘钠渌参镛D(zhuǎn)化方法也應(yīng)包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)，這些方法包括微管注射、PEG融合、電融合。按照某些優(yōu)先實施方案，使用的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，特別指Ti質(zhì)粒參與的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。在其它一些優(yōu)先實施方案中，還可以使用基因槍法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物。本發(fā)明在詳細(xì)介紹轉(zhuǎn)化方法時僅提到了馬鈴薯和番茄，然而，正如本領(lǐng)域?qū)＜宜缫咽熘闹参镛D(zhuǎn)化方法那樣，許多種植物都可以利用本發(fā)明提供的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。因此，所有這些植物都應(yīng)包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)，這些植物可以是了單子葉植物或雙子葉植物。就象下面實例中所要詳細(xì)描述的那樣，本發(fā)明植物轉(zhuǎn)化方法中所用的質(zhì)粒載體是一個Ti質(zhì)粒系統(tǒng)。按照一個實施方案，本發(fā)明使用的質(zhì)粒是一個雙元整合性載體。按照一個更加優(yōu)先的實施方案，本發(fā)明所使用的質(zhì)粒是pBI121。本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因食物的生產(chǎn)方法。它包括以下步驟1.構(gòu)建一個質(zhì)粒載體或者一段DNA序列，其中都含有編碼毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白基因或其衍生物的基因，而且該基因被置于一個植物啟動子操縱之下；2.用質(zhì)粒載體或上述DNA片段轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；3.從轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植物；4.收獲轉(zhuǎn)基因植物的食用部分；5.食用一定量的這種轉(zhuǎn)基因植物，盡量避免產(chǎn)生免疫耐受性，以達(dá)到預(yù)防疾病的效果。本發(fā)明也提供了含確定數(shù)量抗原蛋白膠囊、沖劑或其它制劑的生產(chǎn)方法，它包括以下步驟1.構(gòu)建一個質(zhì)粒載體或者一段DNA序列，其中都含有編碼毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白基因或其衍生物的基因，而且該基因被置于一個植物啟動子操縱之下；2.用質(zhì)粒載體或上述DNA片段轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；3.從轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植物；4.自轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或完整植物中提取出抗原蛋白加工成膠囊、沖劑或其它制劑。按照一個優(yōu)先的實施方案，含有抗原蛋白的完整轉(zhuǎn)基因植物或者其某些食用部分可直接進(jìn)行冷凍、干燥和粉碎，然后加工成膠囊、沖劑或其它制劑，并確定其中含有的該抗原蛋白數(shù)量。為了詳細(xì)描述本發(fā)明的某些優(yōu)先實施方案，并以相應(yīng)的繪圖作參考圖1CS6B亞基抗原蛋白基因的克隆及細(xì)菌表達(dá)載體pETCS6B的構(gòu)建。圖2植物表達(dá)載體pBICS6B的構(gòu)建過程，它含有毒素源性大腸桿菌定居因子CS6B亞基抗原基因。其中GUS代表β-Glucuronidase(葡糖醛酸酶)基因；CS6B代表毒素源性大腸桿菌定居因子CS6B亞基蛋白基因。圖3質(zhì)粒pBICS6B所含的2個結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控表達(dá)序列。其中Nos-Pro代表胭脂堿合成酶啟動子；npt-II代表新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；Nos-Ter代表胭脂堿合成酶終止子；35SPro代表花椰菜花葉病毒35S啟動子；RB代表DNA右邊界序列；LB代表DNA左邊界序列。圖4不同株系轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片中CS6B亞基抗原蛋白mRNA的Northern雜交結(jié)果。1和2為非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株，3-6為轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株。圖5不同株系轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中定居因子CS6B亞基抗原蛋白的含量。圖6PCR檢測CS6B亞基抗原蛋白基因在不同轉(zhuǎn)基因番茄株系中的整合情況。其中1為1kbDNALadder，2為陰性對照擴增產(chǎn)物，3為陽性對照植物擴增結(jié)果，4-8為不同轉(zhuǎn)基因番茄擴增產(chǎn)物。為倍比稀釋后的樣品。圖7定居因子CS6B亞基重組抗原蛋白在植物汁液中的穩(wěn)定性測定。其中含抗原蛋白的馬鈴薯塊莖(0.1g)在400ul磷酸緩沖液中磨碎后，室溫下(15-20℃)放置1-7天后，取100ul上清液酶聯(lián)反應(yīng)后測定OD405nm光吸收值。圖8定居因子CS6B亞基重組抗原蛋白在高溫下的穩(wěn)定性測定。其中含抗原蛋白的馬鈴薯塊莖(0.1g)在400ul磷酸緩沖液中磨碎后，不同溫度下放置3小時后，取100ul上清液酶聯(lián)反應(yīng)后測定OD405nm光吸收值。圖9經(jīng)親和層析純化出的植物重組CS6B亞基抗原蛋白的PAGE分析。其中1為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白(Pharmacia)；2為BL21(DE3)菌株表達(dá)產(chǎn)物陰性對照(IPTG誘導(dǎo))；3為含質(zhì)粒pET-28b(+)的BL21(DE3)菌株表達(dá)產(chǎn)物陰性對照(IPTG誘導(dǎo))；4為含質(zhì)粒pETCS6B的BL21(DE3)菌株表達(dá)產(chǎn)物陰性對照(未經(jīng)IPTG誘導(dǎo))；5為含質(zhì)粒pETCS6B的BL21(DE3)菌株表達(dá)產(chǎn)物(IPTG誘導(dǎo))；6為從BL21細(xì)胞中純化出重組CS6B亞基蛋白；7為從轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中純化出的重組CS6B亞基蛋白；8為轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中的總蛋白提取物9為非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中的總蛋白提取物；。圖10飼喂不同劑量抗原蛋白后小鼠抗體產(chǎn)生情況的曲線表示本發(fā)明包括以下幾個組成部分1.利用DNA重組技木構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體，它含有毒素毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白基因或其衍生物，人或其它哺乳動物在食用該抗原蛋白后有可能產(chǎn)生針對毒素源性大腸桿菌的特異性中和抗體；2.選擇適宜的受體植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使編碼抗原蛋白的基因穩(wěn)定地整合入受體植物的染色體中并可遺傳給后代；3.從轉(zhuǎn)化的受體植物細(xì)胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植物，而且該植物能夠穩(wěn)定、高效地產(chǎn)生毒素源性大腸桿菌定居因子蛋白抗原；4.人或哺乳動物直接食用這種轉(zhuǎn)基因植物或以腸道給藥的方式口服以該轉(zhuǎn)基因植物食用部分或其提取物為主要活性成份加工而成的膠囊、沖劑或其它制劑后，有可能預(yù)防毒素源性大腸桿菌造成的腹瀉。本發(fā)明提供了表達(dá)毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白或其衍生物轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建方法，這種轉(zhuǎn)基因植物作為食物或加工成膠囊、沖劑或其它制劑后被食用有可能引起人或哺乳動物的免疫應(yīng)答。這種免疫應(yīng)答的結(jié)果使人或哺乳動物對毒素源性大腸桿菌造成的腹瀉具有抵抗能力。這種免疫應(yīng)答是由于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白或其衍生物后而產(chǎn)生的結(jié)果，而毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白的產(chǎn)生則是由于該蛋白基因整合入植物的基因組中并在植物啟動子調(diào)控下能夠穩(wěn)定地表達(dá)的結(jié)果。1.利用植物生產(chǎn)重組外源蛋白在植物中生產(chǎn)重組藥用蛋白多肽最早的例子之一是利用植物貯藏蛋白天然的高水平表達(dá)特性，生產(chǎn)人的神經(jīng)肽-亮氨酸腦啡肽。它是一個含有5個氨基酸殘基的小分子多肽，在油菜中先以種子貯藏蛋白2S清蛋白的形式被生產(chǎn)出來，后經(jīng)胰蛋白酶水解被從貯藏蛋白質(zhì)上切割下來，再通過HPLC予以回收，在臨床上可作為止痛劑或鎮(zhèn)靜劑使用。繼早期的研究之后，在植物中表達(dá)人和動物的抗體又成為人們關(guān)注的焦點。免疫球蛋白如IgG、IgM、IgG/IgA嵌合抗體、Fab片段、單鏈抗體和單域抗體等均已實現(xiàn)了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物含量最高達(dá)植物可溶性蛋白的2％以上。這類抗體具有生物學(xué)活性，在純化后可用作藥物、診斷試劑和親合劑等。此外，在植物中表達(dá)抗體還有可能增強作物的抗病毒能力、提高產(chǎn)量以及改良其它農(nóng)藝性狀等。在植物中生產(chǎn)重組藥用蛋白的另外一條途徑是使用基因工程植物病毒作為表達(dá)載體，這類裁體可瞬時高效表達(dá)大量外源蛋白，是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)等所不能做到的，已有十幾種植物病毒被改造成不同類型的外源蛋白表達(dá)載體，包括花椰菜花葉病毒(CaMV)、煙草花葉病毒(TMV)和豇豆花葉病毒(CpMV)等，其中超過150多種的蛋白多肽在TMV載體中成功表達(dá)[26]。利用融合蛋白表達(dá)策略已生產(chǎn)出含有瘧疾、動物口蹄疫病毒、鼻病毒及人免疫缺陷病毒(HIV)抗原決定簇的嵌合外殼蛋白，這類融合蛋白的生產(chǎn)方式將來可能是生產(chǎn)疫苗的一條重要和經(jīng)濟有效的途徑。本發(fā)明不僅允許在一種植物中生產(chǎn)一種大腸桿菌定居因子抗原蛋白，而且可以在一種植物中同時生產(chǎn)多種細(xì)菌抗原蛋白。將多種抗原蛋白的基因構(gòu)建在同一個表達(dá)載體上，然后用其轉(zhuǎn)化植物，從而在一個轉(zhuǎn)基因植物中可同時表達(dá)多種細(xì)菌抗原蛋白。例如，毒素源性大腸桿菌含有定居因子CS6B亞基表面抗原蛋白和熱敏毒素B亞基抗原蛋白，這兩種抗原蛋白基因就可以構(gòu)建在同一個植物表達(dá)載體上，分別受不同的植物啟動子控制，然后同時導(dǎo)入植物，從而在一個轉(zhuǎn)基因植物中就可以同時產(chǎn)生這兩種抗原蛋白；也可以將這編碼這兩種抗原蛋白的基因在轉(zhuǎn)化前就相互融合，但并不改變各自的移碼框架，在導(dǎo)入植物后，在植物體內(nèi)便可表達(dá)由這兩種蛋白形成的一個融合蛋白，由此，便可進(jìn)一步提高這兩種蛋白彼此的免疫原性。此外，轉(zhuǎn)基因植物也可以通過多次轉(zhuǎn)化或者同時用多個含有不同抗原基因的表達(dá)載體同時轉(zhuǎn)化的方法獲得。2.受體植物的選擇利用不同的外源DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)，現(xiàn)已轉(zhuǎn)化了多種植物，包括許多雙子葉植物和一些單子葉植物。考慮到遺傳轉(zhuǎn)化操作的難易程度，本發(fā)明更傾向于使用雙子葉植物作為受體植物，盡管某些單子葉植物如小麥、玉米和水稻可能更適于作為人們的食物或加工成膠囊、沖劑或其它制劑。選擇受體植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化要考慮到抗原蛋白是否能夠在它的食用部分中表達(dá)。因為，抗原蛋白在植物的某一部分如果實、葉子、莖、種子、或根中表達(dá)后，人或哺乳動物可直接食用該部分的植物組織或者在加工以后做成膠囊、沖劑或其它制劑供人們口服。按照一個并不優(yōu)先的實施方案，抗原蛋白也可在不能食用的植物中表達(dá)，然后從中完全純化出所需的抗原蛋白加工成膠囊、沖劑和其它制劑。在選擇受體植物時，還要考慮其它一些因素。受體植物的食用部分最好不需加熱就可以食用，因為加熱會引起抗原蛋白變性，從而降低它的免疫原性。此外，因為毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白在人或動物剛出生時最易誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)的產(chǎn)生，因此，含有該抗原蛋白的植物部分最好能加工成液體的方式被飲用。適于本發(fā)明轉(zhuǎn)化的受體植物包括所有可作為人或動物食物的雙子葉植物和單子葉植物，植物的一部分或全部可食用，這些植物包括馬鈴薯、番茄、胡蘿卜、萵苣、黃瓜、小麥、大豆、水稻、玉米和香蕉等，但不僅限于此。3.植物轉(zhuǎn)化方法有許多種方法可以將外源基因?qū)雴巫尤~植物和雙子葉植物。將外源基因穩(wěn)定整合入植物染色體基因組DNA的主要方法包括1)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；2)DNA直接攝入法，包括PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)融合法、電激法、微管注射法以及使用基因槍將DNA直接送入植物細(xì)胞和組織等。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是利用質(zhì)粒載體將特定的DNA片段整合入植物染色體基因組DNA。植物組織的轉(zhuǎn)化方法因植物和農(nóng)桿菌系統(tǒng)而異。最常用的方法是葉盤法，它適用于任何易于再生成完整植株的植物外植體。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法特別適用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化。正如上面已提到的各種DNA直接攝入轉(zhuǎn)化方法，電激法是先將原生質(zhì)體置于放在一個強電場中，在電流作用下將外源DNA送入原生質(zhì)體內(nèi)。微管注射法是用微管將DNA直接注射入細(xì)胞中?；驑尫ㄊ菍NA先吸附在硫酸鎂或鎢粒上，這些顆粒被加速射入植物細(xì)胞或組織中。按照本發(fā)明的一個優(yōu)先實施方案，農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒系統(tǒng)被選用。農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒中含有一段叫做轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)的，它可以進(jìn)入植物細(xì)胞中并整合入植物的染色體中。轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建分為兩步，首先是構(gòu)建一個可以在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒，這個質(zhì)粒含有毒素源性大腸桿菌定居因子CS6B亞基蛋白或其衍生物的基因；該目的基因的兩端含有T-DNA邊界序列，它負(fù)責(zé)目的基因在植物基因組中的插入位點。通常另外一個選擇標(biāo)志基因(如抗卡那霉素抗性基因)也被包含在T-DNA的左右邊界序列中，該基因在植物細(xì)胞中表達(dá)后可提供一個選擇標(biāo)記證實植物或植物細(xì)胞是否含有整合的T-DNA序列。載體構(gòu)建的第二步是將質(zhì)粒從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌中。這可以通過三親交配的方式或DNA直接導(dǎo)入方式完成。為了T-DNA的轉(zhuǎn)移，所用的農(nóng)桿菌菌株中還要含有一套誘導(dǎo)基因，它們在T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中起重要作用。熟悉植物遺傳轉(zhuǎn)化的人應(yīng)該知道轉(zhuǎn)化用的農(nóng)桿菌菌株可以有多種選擇，質(zhì)粒構(gòu)建也有多種方式，其目的都是為了更有利于植物的遺傳轉(zhuǎn)化。同樣，人們也應(yīng)該知道除了根癌農(nóng)桿菌外，在有些情況下，還有其它農(nóng)桿菌如發(fā)根型農(nóng)桿菌更適于一些植物的轉(zhuǎn)化。植物組織的轉(zhuǎn)化方法因植物和農(nóng)桿菌介導(dǎo)系統(tǒng)而異。最常用的是植物葉盤轉(zhuǎn)化法，它適于多種易于再生的植物外植體。在某些情況下，還需要加入一些輔助細(xì)胞。其他的轉(zhuǎn)化方法包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，繼而由原生質(zhì)體再生出植物細(xì)胞及完整植株。本發(fā)明不僅僅限于使用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，還應(yīng)包括其它物理性的手段將外源基因直接導(dǎo)入植物細(xì)胞或原生質(zhì)體的方法以及其它將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法。4.基因表達(dá)啟動子在受體植物和轉(zhuǎn)化方法確定之后，一個組成型的、發(fā)育調(diào)節(jié)型的或組織特異型的表達(dá)啟動子被選擇以便外源基因能夠在植物中表達(dá)。所有已知能操縱外源基因在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動子都可以在應(yīng)用在本發(fā)明中。這些啟動子可從植物或病毒中獲得，如花椰菜花葉病毒35S啟動子(包括經(jīng)過拼接、加倍和突變改造后的35S啟動子)；光誘導(dǎo)基因啟動子如核糖二磷酸羧化酶小亞基(rbcS)；逆境誘導(dǎo)基因如乙醇脫氫酶(Adh1)或玉米肌動蛋白基因啟動子等，但不僅限于此。本發(fā)明也可利用已知在植物可食部分高效表達(dá)的啟動子如馬鈴薯質(zhì)體基因啟動子。用于植物轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒通常含有一個選擇標(biāo)志基因。許多有此功能的基因已被開發(fā)出來。下面以轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和番茄生產(chǎn)毒素源性大腸桿菌定居因子CS6B亞基蛋白抗原為例，描述一個優(yōu)先的實施方案，但本發(fā)明的應(yīng)用不僅限于此。選擇毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)是因為毒素源性大腸桿菌造成的腹瀉是一種常見的人或哺乳動物疾病，目前還沒有口服性疫苗可供使用。選擇馬鈴薯和番茄作為受體植物是為了舉例說明在植物的不同部分可表達(dá)毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白。實施例11.定居因子CS6B亞基抗原蛋白細(xì)菌表達(dá)載體pETCS6B的構(gòu)建根據(jù)已公布的、編碼人源毒素源性大腸桿菌定居因子CS6完整菌毛抗原蛋白的DNA核苷酸序列(見GenBank，U04846)，合成了一對特異性引物(由上海生工生物工程公司合成)，其中上游引物(5’端引物)為5’-AACCATGGGAAACTGGCAATATAAATCTCTGG-3’，下游引物(3’端引物)為5’-AACTCGAGATTGCTGTAAAATGATACAGTC-3’，并以含有CS6菌毛抗原全部編碼序列的質(zhì)粒DNA為模板(由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所張兆山研究員提供)，通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增，獲得了人源毒素源性大腸桿菌定居因子CS6B亞基抗原蛋白基因，該基因片段被直接插入到pMD18-T質(zhì)粒中(Takara，大連寶生物工程有限公司)，按照該公司提供的方法，通過藍(lán)白系統(tǒng)篩選，得到含有該基因的細(xì)菌克隆pMD18-CS6B，然后，通過核苷酸序列分析，確定定居因子CS6B亞基抗原蛋白基因是正確和完整的(上海生工生物工程公司完成)。因為在擴增CS6B亞基基因的5’端和3’端引物中分別引入了NcoI和XhoI限制性酶切位點，所以pMD18-CS6B質(zhì)粒DNA經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切后，可將定居因子CS6B亞基抗原蛋白基因切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離獲得該DNA片段，隨后插入到質(zhì)粒pET-28b(+)中(NcoI和XhoI雙酶切)，便構(gòu)建成細(xì)菌性表達(dá)載體DETCS6B。質(zhì)粒pET-28b(+)購自美國Novagen公司，其為高效細(xì)菌性表達(dá)載體，并受IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。該質(zhì)粒多酶切位點的兩端分別都含有一個6個組氨酸的蛋白標(biāo)簽，外源基因插入到合適的多酶切位點后，在不改變移碼框架的情況下，可與位于N端或C端的6組氨酸標(biāo)簽形成融合蛋白，便于外源重組蛋白的提純。2.CS6B亞基抗原蛋白在細(xì)菌中的高效表達(dá)利用質(zhì)粒pETCS6B轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株(購自Novagen公司)，從LB固體平板培養(yǎng)基上(10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化鈉，加蒸餾水至1升，pH7.0并含卡那霉素50mg和15g瓊脂)。挑取轉(zhuǎn)化后形成的細(xì)菌單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基上(含卡那霉素50mg/L)，振蕩培養(yǎng)過夜；次日，取部分培養(yǎng)液按1∶100比例加到新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含Kan50mg/L)中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6時，加入IPTG(購自Sigma公司)，使其終濃度為1mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時后，離心，收集菌體，懸浮于1×SDS上樣緩沖液(50mmol/LTris-HCL，pH6.8，100mmol/LDTT，2％SDS，0.1％溴酚藍(lán)，10％甘油)，在100℃水浴中煮3min破碎菌體，離心，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析是否有重組蛋白產(chǎn)生，實驗中分別以pET28b(+)轉(zhuǎn)化的BL21菌株(IPTG誘導(dǎo))、pETCS6B轉(zhuǎn)化的BL21菌株(未加IPTG誘導(dǎo))以及BL21空白菌株作為陰性對照。3.CS6B重組蛋白的純化大量培養(yǎng)含pETCS6B質(zhì)粒的BL21細(xì)菌細(xì)胞，在經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，收集BL21菌體，隨后將菌體懸浮于細(xì)菌裂解緩沖液(0.05mol/LTris-HCl緩沖液，pH8.0)，超聲波破碎菌體，12000rpm離心15min，保留沉淀(包涵體)。加入包涵體溶解液(0.05mol/LTris-HCl緩沖液，1mmol/LPMSF，8mol/L尿素，10mmol/LDTT，pH8.0)，室溫處理4小時；12000rpm，離心15min，取上清。由于CS6B亞基重組蛋白的C端含有6個組氨酸的標(biāo)簽，因此其純化可以利用組氨酸親和層析柱的方法來進(jìn)行。His6融合蛋白純化試劑盒ProBondTMPurificationSystem購自美國Invitrongen公司，純化過程完全按照試劑盒所提供的方法進(jìn)行。匯集洗脫后的蛋白液，經(jīng)冷凍干燥，然后溶解在0.05mol/LTris-HCl緩沖液中(含10mmol/LEDTA，pH7.0)，至終濃度為1mg/ml。4.抗血清的制備供試小白鼠(BALB/c)購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，全部為雄性，體重為20g左右。取上述經(jīng)His6柱親和層析后CS6B亞基蛋白，每個小鼠腹腔注射入0.1ml，每隔10天注射1次，在第6次注射后第7天，從小鼠眼部取血，匯集在10ml離心管中，37℃放置1小時，然后置于4℃過夜，次日，5000rpm離心15min，收集上部血清，分裝后，置于-20℃冰箱中長期保存。實施例21.CS6B亞基抗原蛋白植物表達(dá)載體pBICS6B的構(gòu)建為了構(gòu)建高效植物表達(dá)載體，根據(jù)已知的CS6B亞基核苷酸序列，合成了一對引物(由上海生工生物工程公司合成)，其中上游引物(5’端引物)為5’-AAATCTAGAAACAATGGGAAACTGGCAATATAAATCTCTGG-3’，下游引物(3’端引物)為5’-AAAGAGCTCATTGCTGTAAAATGATACAGTC-3’，并以質(zhì)粒pMD18-CS6BDNA為模板，經(jīng)過PCR，擴增獲得CS6B亞基抗原蛋白基因，因在5’端和3’引物中分別引入了XbaI和SacI位點，所以擴增產(chǎn)物用上述兩個酶直接酶切后，直接定向插入到質(zhì)粒pBI121的原GUS基因位點內(nèi)(經(jīng)XbaI和SacI雙酶切)，便構(gòu)建成雙元表達(dá)載體pBICS6B。質(zhì)粒pBI121購自美國Clonetech公司，它的XbaI限制性酶切位點位于花椰菜花葉病毒35S啟動子和GUS基因起始密碼之間，而SacI則位于GUS基因終止序列和NOS終止子之間。選用質(zhì)粒pBI121是因為用XbaI和SacI雙酶切可將GUS基因刪除，而隨后可插入另外一個新的外源蛋白基因，新基因?qū)⒛軌蛟谥参锛?xì)胞內(nèi)高效表達(dá)。質(zhì)粒pBI121還含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因(nptII)，它編碼的酶可為植物細(xì)胞提供卡那霉素抗性，從而可將含有T-DNA的細(xì)胞和組織與未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織區(qū)分開來。nptII基因有自己的啟動子和多聚腺酸信號序列，它們均源自胭脂堿(Nopaline)合成酶(NOS)基因。質(zhì)粒pBICS6B含有1)新霉素合成酶基因II(nptII)，它提供給植物細(xì)胞卡那霉素抗性；2)人源毒素源性大腸桿菌定居因子CS6B亞基抗原蛋白基因及操縱該基因的花椰菜花葉病毒35S啟動子；3)T-DNA左右邊界序列，它可將nptII基因和CS6B亞基抗原蛋白基因轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi)并整合到植物染色體中。pBICS6B的結(jié)構(gòu)如圖3所示。2.將表達(dá)載體pBICS6B導(dǎo)入農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)含有定居因子CS6B亞基抗原蛋白基因的質(zhì)粒pBICS6B被通過三親交配的方式轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌LBA4404菌株中，該菌株購自美國Clonetech公司。菌株LBA4404現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用，它是改造后的農(nóng)桿菌菌株，含有完整Vir基因，但T-DNA已經(jīng)被刪除。Vir基因可反式調(diào)節(jié)T-DNA自質(zhì)粒pBICS6B向植物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移。農(nóng)桿菌在含有25mg/L鏈霉素的50mlYEP(蛋白胨10克，酵母提取物10克，NaCl5克，加蒸餾水至1升，pH7.0)培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，在OD600nm值達(dá)到0.4-0.7時，4000g離心收集細(xì)菌細(xì)胞，將農(nóng)桿菌細(xì)胞重新懸浮在1ml不含任何抗生素的YEP培養(yǎng)基中待用。含有表達(dá)載體pBICS6B的DH5α(購自美國GIBCO公司)和含有輔助質(zhì)粒pRK2013(購自美國Clonetech公司)的HB101(購自美國Clonetech公司)分別接種在含有50mg/L卡那霉素50mlLB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，在OD600nm值達(dá)到0.4-0.7時，4000g離心收集細(xì)菌細(xì)胞，然后將細(xì)胞分別懸浮在1ml不合任何抗生素的LB培養(yǎng)基中待用。取上述三種細(xì)胞懸浮液各200ul，置于同一1.5ml離心管中，28℃靜置培養(yǎng)過夜，取該培養(yǎng)物5-10ul，均勻涂抹在YEP固體培養(yǎng)基平板上，該培養(yǎng)基中同時含有25mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素，28℃培養(yǎng)2天后，含有pBICS6B質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌落開始產(chǎn)生。用堿裂解法從農(nóng)桿菌中提取質(zhì)粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶酶切可檢測pBICS6B質(zhì)粒DNA是否存在。3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化植物的遺傳轉(zhuǎn)化首先是植物組織器官或細(xì)胞與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，在培養(yǎng)約2天后，將植物外植體移置相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基中。植物外植體可以是原生質(zhì)體、愈傷組織或其它器官組織，因植物而異。選用帶葉子的器官是最常用的方法。葉片轉(zhuǎn)化主要依據(jù)Horsch等人的方法(27)。馬鈴薯無菌苗(中薯3號，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所)保存在22℃光照培養(yǎng)箱中，給予16小時中等強度光照，每隔3星期剪取頂端幼芽，重新扦插在不含任何抗生素的MS固體培養(yǎng)基中，生長2星期的葉片最適于轉(zhuǎn)化。番茄(中蔬5號，種子購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所)則以7-10日齡的子葉或下胚軸無菌外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。無論馬鈴薯還是番茄均以葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)化為最好。含有表達(dá)載體pBICS6B的農(nóng)桿菌LBA4404接種在50mlYEP培養(yǎng)基(含50mg/ml卡那霉素和25mg/ml鏈霉素)中28℃培養(yǎng)2天，4000g離心5分鐘收集菌體，用25ml液體MS培養(yǎng)液(不含抗生素)洗滌一次，再用MS重新懸浮至OD600nm＝0.2-0.4。將有傷口的葉片浸入稀釋后的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中數(shù)分鐘，用無菌濾紙吸干葉片上多余的菌液，然后將葉片移置不含任何抗生素的再生培養(yǎng)基上23-25℃共培養(yǎng)2天。將葉片移置新鮮的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中含有100ug/ml卡那霉素和500ug/ml羧芐青霉素，以后每兩周更換一次選擇培養(yǎng)基。當(dāng)葉片傷口處愈傷有幼芽形成并長至足夠大時，將幼芽切下(通常在轉(zhuǎn)化后6-10星期)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生長。當(dāng)根出現(xiàn)后，將再生植株移置無菌條件下生長或轉(zhuǎn)移到土壤中，給予適宜的溫度、光照和營養(yǎng)條件下生長。4.表達(dá)CS6B亞基抗原蛋白轉(zhuǎn)基因工程植株的篩選在轉(zhuǎn)化大約四個月后(番茄產(chǎn)生果實需10個月)?？蓹z測轉(zhuǎn)基因植株是否含有CS6B亞基抗原蛋白。1)生物化學(xué)和免疫學(xué)檢測從轉(zhuǎn)基因植物的葉片、莖、塊莖或果實采集樣品。并將樣品在水或緩沖液(如PBS磷酸緩沖液，1L中含0.2gKH2PO4，2.9gNa2HPO4·12H2O，8.0gNaCl，0.2gKCl，pH7.4)中磨碎后，勻漿液在10000g離心10分鐘，取上清液，除留一小部分用于Lowry法定量可溶性蛋白外，其余用于CS6B亞基抗原蛋白蛋白含量的測定。通過酶聯(lián)免疫法測定植物中CS6B亞基抗原蛋白的含量。2)CS6B亞基抗原蛋白基因的檢測轉(zhuǎn)基因植物中CS6B亞基抗原蛋白基因的整合情況可通過PCR擴增目的片段基因或Southern雜交印跡反應(yīng)進(jìn)行檢測，自轉(zhuǎn)基因植物和對照植物中分別提取其基因組DNA，以此作為模版，用特異性的CS6B亞基基因引物(見上文)進(jìn)行擴增，或用XbaI和SacI單酶切后，瓊脂糖電泳分離DNA片段，然后再轉(zhuǎn)移到尼龍膜上后，以地高辛(Digoxigenin)標(biāo)記的CS6B亞基蛋白核酸編碼序列作為探針(BM公司)。此外，可收集轉(zhuǎn)基因植株自交種子，通過卡那霉素抗性萌發(fā)實驗或PCR分析其后代的外源基因純合情況。5.表達(dá)CS6B亞基抗原蛋白轉(zhuǎn)基因植物的繁殖和培育在篩選出高效和穩(wěn)定表達(dá)CS6B亞基抗原蛋白的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯或番茄植株后，為生產(chǎn)該抗原蛋白必須大量繁殖該轉(zhuǎn)基因植株。馬鈴薯是通過營養(yǎng)繁殖的，因此，可通過扦插的方法，在短時間內(nèi)便可獲得大量幼苗和微型薯，且不必?fù)?dān)心由于有性生殖而引起后代的遺傳重組問題。番茄或其它依靠種子繁殖的轉(zhuǎn)基因植物要獲得穩(wěn)定表達(dá)的后代，則需要較長時間，因為種子繁殖有缺點，其后代缺乏均一性，外源基因按照孟德爾遺傳規(guī)律傳給后代?；旧?，每個種子遺傳上是不同的，具有它自己的遺傳特性。因此，轉(zhuǎn)基因植物最好要經(jīng)過幾代篩選，在得到純系后，外源基因才能穩(wěn)定地傳給后代。6.含CS6B亞基抗原蛋白轉(zhuǎn)基因食品的制備CS6B亞基抗原蛋白可通過大量繁殖轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行生產(chǎn)，植物食用部分在收獲后可直接食用、或者直接加工、或經(jīng)部分提純、或完全提純后再加工成膠囊、沖劑以及其它制劑。馬鈴薯塊莖雖然不能夠生吃，但在冷凍干燥后，磨成細(xì)粉并加工成膠囊、沖劑或其它制劑。而番茄果實則可以加工成瓶裝番茄汁方便飲用。在一定時間內(nèi)，人們通過口服一定量的膠囊、沖劑或番茄汁或直接食用番茄(在一段時間內(nèi)一次或多次)，其中含有的CS6B亞基抗原蛋白有可能激發(fā)人體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，人們也就具備了對人源毒素源性大腸桿菌的免疫能力。實施例31.馬鈴薯的轉(zhuǎn)化在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下，利用葉盤法轉(zhuǎn)化馬鈴薯，然后通過在選擇培養(yǎng)基上[MS中基礎(chǔ)成分中添加植物激素(Sigma公司)6-BA1.5mg/L和NAA0.1mg/L，并含有200ug/ml卡那霉素和500ug/ml羧卞青霉素]連續(xù)培養(yǎng)和篩選，完整的卡那霉素抗性馬鈴薯植株被再生出來。按照Horsch等人的方法，利用葉盤法轉(zhuǎn)化馬鈴薯。馬鈴薯無菌苗在重新扦插于MS固體培養(yǎng)基中生長2周后，用剪刀自葉柄與莖相連部位處將葉片剪下。含有表達(dá)載體pBICS6B的農(nóng)桿菌菌株LBA4404接種在50mlYEP中，28℃培養(yǎng)2天，4000g離心5分鐘，收集菌體，然后重新懸浮在液體的MS培養(yǎng)基中至OD600nm＝0.4，將剪下葉片浸入稀釋后的農(nóng)桿菌中5分鐘，然后取出，用濾紙吸干，葉面朝上置于MS固體培養(yǎng)基上，28℃共培養(yǎng)2天。然后將葉片移置新鮮的選擇培養(yǎng)基上，以后每隔2個星期更換一次選擇性培養(yǎng)基直到葉柄傷口處長出愈傷并分化出幼苗。當(dāng)幼苗出現(xiàn)并長到足夠大時，將幼苗切下來(通常在共培養(yǎng)后4-8個星期)，移到生根培養(yǎng)基上(MS含有100ug/ml卡那霉素)，當(dāng)根長出后，幼苗被移到無菌的營養(yǎng)土中生長并輔之以適當(dāng)?shù)臏囟群凸庹諚l件。2.轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的RNA分析利用地高辛標(biāo)記的CS6B亞基蛋白基因DNA片段做探針(標(biāo)記方法見BM公司試劑盒)，對pBICS6B表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后的部分卡那霉素抗性馬鈴薯植株RNA進(jìn)行了雜交分析。轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的葉片總RNA被提取，方法見參考文獻(xiàn)(28)。大約1.0g葉片在液氮中用研缽磨成粉末，加入10mlRNA提取緩沖液(0.2MTris-HCl，pH6.8；0.2MNaCl；20mMEDTA；2％SDS)，隨即加入10ml飽和酚緩沖液(10mMTris-HCl，pH8.0；1mMEDTA飽和)進(jìn)行抽提，然后用10ml的氯仿抽提。3000g離心，收集上層水相，加入0.3M醋酸鉀(pH5.2)緩沖液和2.5倍體積的無水乙醇，10000g離心收集沉淀，風(fēng)干后，沉淀重新懸浮在2ml的水中，隨后加入2ml6M的醋酸銨緩沖液和10ml無水乙醇，10000g離心收集沉淀。沉淀在干燥后，重新懸浮在0.4ml水中，RAN濃度可通過測定260nm的吸光值進(jìn)行估算，假定1mg/ml的RNA吸光值是25單位。取10ugRNA樣品，約5ul，與2倍體積RNA樣品緩沖液(10ml去離子甲酰胺，3.5ml37％甲醛，2ml5XMOPS)混合后，65℃加熱5分鐘，冷卻后，加入3ulRNA加樣緩沖液(50％甘油，1mMEDTA，0.4％溴酚藍(lán))，然后經(jīng)過1％的RNA瓊脂糖凝膠電泳。核酸通過毛吸管法轉(zhuǎn)移到尼龍膜(HybondN+)上，所用的緩沖液為20XSSC，pH7.2(3M氯化鈉，0.3M檸檬酸鈉)，轉(zhuǎn)移時間為16小時。核酸通過紫外線照射后被交連在尼龍膜上，將膜置于預(yù)雜交液中[5XSSC，0.1％(w/v)N-Lauroylsarcosine，0.02％SDS，100ug/ml鮭魚精DNA]，68℃預(yù)雜交3小時，然后更換新的雜交液[5XSSC，0.1％(w/v)N-Lauroylsarcosine，0.02％SDS，1％的封閉劑(BM試劑盒中提供)]，5ml雜交液中加入變性的地高辛標(biāo)記的DNA探針60ng進(jìn)行雜交，探針長452bp，它是來自質(zhì)粒pMT18-CS6B的NcoI和XhoI的酶切片段，包括了CS6B亞基基因的全部編碼序列。在雜交液中68℃雜交24小時后，取出雜交膜，于200ml2XSSC，0.1％SDS緩沖液中室溫下洗膜2次，然后于100ml0.1XSSC，0.1％SDS緩沖液中68℃洗膜2次。顯色反應(yīng)基本依據(jù)試劑盒中提供的方法(BM)，尼龍膜先于洗脫緩沖液中平衡5分鐘，然后用50ml1X封閉緩沖液封閉30分鐘，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛抗體至濃度為75mU/ml，室溫下反應(yīng)30分鐘，用洗脫緩沖液2次，每次15分鐘。將膜移置20ml顯色緩沖液(0.1MTris-HCl，pH9.5；0.1MNaCl；50mMMgCl2)中平衡5分鐘，更換新的底物緩沖液(200ulNBT/BCIP底物加入10ml顯色緩沖液)，遮光條件下顯色16小時，待所期望的條帶出現(xiàn)后，用水終止反應(yīng)。經(jīng)質(zhì)粒pBICS6B轉(zhuǎn)化后獲得的轉(zhuǎn)基因植株和陰性對照植株的RNA雜交結(jié)果如圖示4。不同轉(zhuǎn)基因植株的RNA雜交信號有差異，這可能是由于基因的插入位點和基因的拷貝數(shù)不同引起的。和標(biāo)準(zhǔn)RNA分子量相比，轉(zhuǎn)錄的RNA約有450bp長，與預(yù)先估計的相一致。陰性對照植物的RNA沒有觀察到雜交信號。mRNA的穩(wěn)定、大量表達(dá)并能夠與編碼CS6B亞基蛋白的DNA核酸探針特異性雜交的結(jié)果表明，mRNA的穩(wěn)定性不會成為CS6B亞基基因在馬鈴薯中表達(dá)的一個問題。3.不同轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株CS6B亞基抗原蛋白含量的測定取不同轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株葉片0.1g，各加入1ml去離子水，在4℃下用玻璃勻漿器磨碎。勻漿液10000g4℃離心5分鐘，利用Lowry法(蛋白測定試劑盒購自Sigma公司，貨號為P5656)，取部分上清液測定可溶性蛋白含量。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定馬鈴薯葉片中CS6B亞基抗原蛋白的含量，取葉片0.2g，以1∶3(W/V)的比例在包被緩沖液中磨碎(1.59gNa2CO3，2.93gNaHCO3，加蒸餾水至1升)，勻漿液10000g4℃離心5分鐘，取上清液200ul加入酶聯(lián)反應(yīng)板的小孔中，每個樣品設(shè)兩個重復(fù)，然后將酶聯(lián)板置于4℃下包被過夜，次日，用PBST緩沖液(8gNaCl，0.2gKH2PO4，2.9gNa2HPO4·12H2O，0.2gKCl，0.5mlTween20，加蒸餾水至1升)洗3次，每次3分鐘，甩干后，每個小孔中加入200ul小鼠抗CS6B亞基蛋白抗血清(見實施例1)，抗血清在使用前經(jīng)PBST按1/1000倍稀釋。37℃反應(yīng)2小時，用PBST洗3次，每次3分鐘，甩干后，每個小孔中各加入200ul堿性磷酸酶標(biāo)記的抗小鼠IgG(購自Sigma公司)，酶標(biāo)抗體在使用前經(jīng)PBST按1/5000倍稀釋，37℃反應(yīng)1小時，用PBST洗4次，每次3分鐘，甩干后，小孔中各加入顯色底物緩沖液(9.7ml二乙醇胺，加蒸餾水80ml，用HCl調(diào)pH至9.8，然后加入底物p-硝基苯至終濃度0.6mg/ml)，室溫下顯色1小時，然后每個小孔各加入50ul3MNaOH中止反應(yīng)，405nm下讀取光吸收值。以His6親和層析柱純化出的標(biāo)準(zhǔn)含量的CS6B亞基抗原蛋白(見實施例1)為陽性對照，陽性對照被稀釋成不同蛋白水平(0.2-32ng)，在顏色反應(yīng)后，讀取405nm光吸收值，制備一條標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線。如圖5中所示，通過比較發(fā)現(xiàn)，陰性對照植物中(柱1)沒有發(fā)現(xiàn)含有CS6B亞基抗原蛋白，而在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株中則可以檢測到不同含量的CS6B亞基抗原蛋白，含量約為植物可溶性蛋白10-30ng/mg(柱2至柱5)。不同轉(zhuǎn)基因馬鈴薯之間差異比較大這可能是由于基因插入的拷貝數(shù)和插入位點不同引起的。4.轉(zhuǎn)基因馬鈴薯不同組織器官CS6B亞基抗原蛋白含量的測定取轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片、莖和塊莖組織各0.2g，處理和測定方法同上。表1中列出了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯不同組織器官中CS6B亞基抗原蛋白的含量。表1.馬鈴薯葉子、莖和塊莖中CS6B亞基抗原蛋白的含量馬鈴薯葉子中的CS6B亞基抗原蛋白表達(dá)量最高約為可溶性蛋白的0.003％，為160ng/g鮮重。莖中的CS6B亞基抗原蛋白盡管表達(dá)量占植物可溶性蛋白的0.006％，但因莖中含有的可溶性蛋白量比較低，故每g鮮重只含有75ngCS6B亞基抗原蛋白，約為葉片的一半。馬鈴薯塊莖中的CS6B亞基抗原蛋白含量最高，約為810ng/g鮮重，這就為加工和利用馬鈴薯塊莖生產(chǎn)抗大腸桿菌腹瀉口服疫苗提供了極大的方便。5.CS6B亞基抗原蛋白轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的繁殖轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的繁殖已在實施例2中描述。實施例41.番茄的轉(zhuǎn)化番茄(Lycopersicomesculentum)的轉(zhuǎn)化方法如同實施例3的1中所描述的那樣，也是在農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)下利用葉盤法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌侵染生長7-10天后子葉或下胚軸無菌外植體，該外植體不需預(yù)培養(yǎng)，而是在切下后立即浸入農(nóng)桿菌菌液中5-10分鐘，取出后用濾紙吸干多余的菌液，后移置Z1培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基中加入1mg/L玉米素)，25℃遮光條件下共培養(yǎng)2天。然后將外植體轉(zhuǎn)移到SM培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基中加入1mg/L玉米素，100mg/L卡那霉素和500mg/L羧芐青霉素)誘導(dǎo)愈傷組織形成和幼苗分化(29)。切下的幼苗在RM培養(yǎng)基(1/2MS基本培養(yǎng)基中加入0.2mg/LNAA，100mg/L卡那霉素和500mg/L羧芐青霉素)誘導(dǎo)生根，待長至一定高度，然后轉(zhuǎn)移到滅菌土壤中，給予適宜的條件培養(yǎng)生長。2.PCR檢測CS6B亞基抗原蛋白基因在番茄中的整合情況番茄基因組DNA的提取方法基本依據(jù)Chee的方法(30)。取3g番茄新鮮葉片，放入研缽中用液氮研磨，磨碎后的粉末移置20ml離心管中，然后加入9mlCTAB提取液(100mMTris-HCl，pH7.5含5MNaCl，10mMEDTA，10ml/Lβ-巰基乙醇，10g/LCTAB)，劇烈振蕩1分鐘，使之充分混勻。在60℃水浴中溫浴90分鐘，期間每30分鐘振蕩一次。從水浴中取出離心管，室溫下放置4-5分鐘，使之冷卻，然后加入4.5ml氯仿，輕輕搖動，使之充分混勻。室溫下5000g離心10分鐘。收集上清液于另一20ml離心管中，加入4.5ml氯仿，重復(fù)上述步驟。收集上清液，加入10ml冰冷的異丙醇，輕搖10-15分鐘，5000g離心5分鐘，收集沉淀，用3ml76％乙醇含0.2MNaOAc和2ml76％乙醇含10mMNH4OAc各洗沉淀一次，最后加入TE(pH8.0)緩沖液溶解DNA，將DNA濃度調(diào)至1ug/ul。取上述番茄基因組DNA1ug約1ul作為模版，加入CS6B亞基抗原蛋白基因核酸編碼序列特異性引物各1ul(見實施例2)，10XPCR緩沖液3ul，dNTP(各2.5mM)3ul，Taq酶0.5ul約1.5U，加水至總體積30ul。94℃30秒，50℃45秒，72℃1.5分鐘，共進(jìn)行35個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取5ul擴增樣品進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖6所示，陰性對照植物中(泳道2)沒有發(fā)現(xiàn)特異性的條帶，而在轉(zhuǎn)基因番茄植株中則可擴增出1個約450bp的特異性條帶(泳道4-8)，該結(jié)果表明CS6B亞基抗原基因已整合進(jìn)入番茄基因組DNA中。2.葉子和果實中CS6B亞基抗原蛋白含量的測定用研缽將植物組織磨碎，在磨碎過程中加入液氮，植物組織粉末中加入10倍體積滅菌無離子水進(jìn)行稀釋。植物勻漿液10000g4℃離心5分鐘，依據(jù)試劑盒(Sigma公司，p5656)提供的方法，取部分上清液測定可溶性蛋白含量。轉(zhuǎn)基因植株中CS6B亞基抗原蛋白含量的檢測方法同實施例3中的3。表2中列出了轉(zhuǎn)基因番茄葉子和果實中CS6B亞基抗原蛋白的含量。取在溫室中生長的轉(zhuǎn)基因番茄的綠葉和紅色果實進(jìn)行可溶性蛋白和CS6B亞基抗原蛋白含量的測定，就象上文中所描述的那樣。非轉(zhuǎn)基因植物葉子和果實中檢測不到CS6B亞基抗原中蛋白。表2番茄葉子和果實中的CS6B亞基蛋白的含量番茄葉子中的CS6B亞基抗原蛋白含量略高于馬鈴薯葉片，表達(dá)量為可溶性蛋白的0.0039％。在成熟果實中CS6B亞基抗原蛋白的含量約占可溶性蛋白的0.005％，或為105ng/g鮮重。因為果實的密度比較高，番茄果實中的CS6B亞基抗原蛋白的表達(dá)量集中了番茄植株CS6B亞基蛋白的大部分，一個重100克的番茄果實含有大約10ugCS6B亞基重組抗原蛋白。實施例51.重組CS6B亞基抗原蛋白在植物組織中的穩(wěn)定性測定重組CS6B亞基抗原蛋白在完整的植物細(xì)胞中可長時間保存。如以馬鈴薯塊莖方式4℃下低溫保存，保存期長達(dá)一年，抗原也不會有任何損失。但當(dāng)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞后，細(xì)胞器中的各種蛋白酶就會被釋放出來，它們能降解植物汁液中所含的重組抗原蛋白。因此，檢測重組抗原蛋白在植物汁液中的穩(wěn)定性，對于今后在加工過程中盡可能保證抗原蛋白不受損失至關(guān)重要。從圖7中可以看出，重組的CS6B亞基抗原蛋白在植物汁液中放置的時間越長，蛋白的損失就會越大。在室溫下放置1天后與新研磨的汁液中抗原蛋白含量差別不大，但從第2天起，抗原蛋白的量會急劇減少，到第七天后，基本上檢測不到抗原蛋白了。該結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖加工過程中，應(yīng)盡快使其脫水干燥，才可以有效防止重組抗原蛋白不會被細(xì)胞中釋放出的蛋白酶降解破壞。盡管高溫可加速轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖脫水干燥，但重組CS6B亞基抗原蛋白對高溫的忍受能力是有限的。從圖8可以看出，當(dāng)溫度超過50℃時，處理時間達(dá)3小時，植物汁液中能夠檢測到的抗原蛋白的數(shù)量急劇下降，這表明該抗原蛋白可忍受的極限高溫是50℃。超過此溫度，蛋白會變性，從而失去與特異性抗體的反應(yīng)能力。綜合上述，可以得出如下結(jié)論，干燥馬鈴薯塊莖以低溫、快速最為適宜，在此條件下可有效保護(hù)重組抗原蛋白不受損失。2.含CS6B亞基抗原蛋白膠囊的制備馬鈴薯塊莖不便于食用，可考慮加工成膠囊。1000g鮮重馬鈴薯塊莖在冷凍干燥后可獲得干物質(zhì)約140g，該干物質(zhì)進(jìn)而在低溫下被磨成150-200目的干粉，經(jīng)測定，每100mg這種轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖制成的干粉中約含有580ngCS6B亞基抗原。該干粉可直接灌入腸溶性或胃溶性的膠囊外殼內(nèi)。根據(jù)具體情況，每個膠囊可灌入100-500mg轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖制成的干粉，例如，一個300mg的膠囊約含有1.7ug的CS6B亞基抗原蛋白。成人一次需服用至少5粒，才有可能獲得足夠的免疫劑量。為了提高每個膠囊內(nèi)CS6B亞基抗原蛋白的含量，新鮮馬鈴薯塊莖也可在加入等重量水后，在4℃低溫情況下進(jìn)行徹底粉碎，低速離心收集上清液，經(jīng)迅速冷凍干燥后，每100mg這種提取物中約含有10-20ugCS6B亞基抗原蛋白，成年人每次只需服用1粒100mg的膠囊，就有可能達(dá)到足夠的免疫劑量。3.含CS6B亞基抗原蛋白沖劑的制備膠囊的容積比較小，如果直接灌入轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖制成的干粉，則每粒膠囊所含有的重組抗原蛋白較少，成人每次需服用多粒膠囊才能夠達(dá)到足夠的免疫劑量，因此，增加一次性食用量在某些情況下可能是必需的。此時，可采用沖劑包裝形式，每袋內(nèi)裝入5-10g由轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖制成的干粉。以5g包裝為例，含有CS6B亞基抗原蛋白29ug。成人每次只需服用1袋，便可獲得足夠的免疫劑量。在服用時，為避免高溫導(dǎo)致蛋白變性，可伴以溫開水稀釋后服下。4.含CS6B亞基抗原蛋白的其它制劑含CS6B亞基抗原蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄果實在直接食用時存在一些問題，因為不可能對每個番茄中的抗原蛋白含量進(jìn)行測定，因而也就無法確定人每次食用幾個番茄果實較為適宜。在這種情況下，可考慮將番茄果實加工成果茶或其它飲料方式，只需對每批產(chǎn)品進(jìn)行抽樣檢測，便可作為人服用劑量的指導(dǎo)依據(jù)。當(dāng)然，馬鈴薯塊莖或其它轉(zhuǎn)基因植物也可以加工成飲料的方式便于服用，其前提是必須保證在液體情況下重組CS6B亞基抗原蛋白不會被蛋白酶所降解，在室溫條件下能夠長期儲存。植物來源的CS6B亞基抗原蛋白還可以有其它應(yīng)用方式，例如，抗原蛋白在經(jīng)過完全純化或部分純化后，可作為食品添加劑，摻入奶粉、豆粉、果汁和酸奶等食物以及飲料中制備成各種特殊功能性食品。實施例61.利用親和層析法從轉(zhuǎn)基因馬鈴薯或番茄中提純CS6B亞基抗原蛋白CS6B亞基抗原蛋白小鼠抗血清的制備見實施例1，取2ml該小鼠抗血清與8mlPBS緩沖液混合后，置于50ml小燒杯中，連續(xù)攪拌下緩慢加入等量飽和硫酸銨溶液，室溫下攪拌1小時，10000rpm離心15分鐘，取沉淀，重新懸浮于10mlPBS緩沖液中，連續(xù)攪拌下緩慢加入5ml飽和硫酸銨溶液，室溫下攪拌1小時，10000rpm離心15分鐘，取沉淀，重新懸浮于2mlPBS緩沖液中，然后置于透析袋中對2L的PBS緩沖液進(jìn)行透析過夜，期間更換2次PBS緩沖液，透析完成后，將抗體IgG自透析袋中吸出，測定280nm吸光值，然后將IgG濃度調(diào)至1mg/ml。按照產(chǎn)品說明書中提供的方法，該小鼠抗體被固定在經(jīng)CNBr活化的Sepharose4B上(PharmaciaBiotech公司產(chǎn)品)。取1000克轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖或番茄葉片，加入等量PBS緩沖液(含有0.1％TritonX-100；0.5mMPMSF)，在4℃下勻漿。勻漿液經(jīng)40,000g離心后收集上清液。上清液經(jīng)冷凍干燥后，重新溶解在20mlTSA緩沖液(20mMTris-HCl，pH8.0，140mMNaCl，0.025％NaN3)中，然后與上述活化的抗體-凝膠復(fù)合物在4℃下充分混合16小時。反應(yīng)物上柱后，用5倍柱體積pH8.0和pH9.0的Tris緩沖液(50mMTris-HCl，0.1％TritonX-100，500mMNaCl)分別洗柱，接著用10ml三乙醇胺緩沖液(50mM三乙醇胺，pH11.5，0.1％TritonX-100，150mMNaCl)進(jìn)行洗脫，洗脫液分別收集在10個1.5ml離心管中。通過酶聯(lián)吸附反應(yīng)檢測每個離心管中抗原蛋白的有無。將有免疫反應(yīng)的洗脫液匯集在一起，裝入透析袋中進(jìn)行4℃透析過夜，透析緩沖液為2升PBS。透析完成后從透析袋中吸出透析物，經(jīng)冷凍干燥后，重新溶解在1mlPBS緩沖液中，然后從中取出20ul進(jìn)行SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)植物中獲得的重組CS6B亞基抗原蛋白分子量約為16KD，與大腸桿菌所產(chǎn)生的天然CS6B亞基蛋白相一致(1)。2.小鼠的注射免疫接種試驗供試小白鼠(BALB/c)購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，兩種性別，但每批實驗各處理組的小鼠均為雄性或雌性，體重在15-20克左右。取上述經(jīng)過純化后的CS6B亞基抗原蛋白100ng，加入PBS緩沖液至終體積200ul，不加入任何佐劑，以腹腔注射方式免疫每只小鼠，每組接種5只小鼠。每隔10天注射接種1次，在第5次接種后10天通過眼部取血方式收集小鼠抗血清。表3注射免疫接種后小鼠抗血清效價的測定(1)表中數(shù)字為3次實驗的平均值(OD405nm吸光值)抗血清的效價通過酶聯(lián)吸附反應(yīng)進(jìn)行測定，純化的CS6B亞基抗原蛋白經(jīng)包被緩沖液(見上文)稀釋后，每個小孔內(nèi)加入200ul(含抗原蛋白20ng)，4℃下包被過夜。次日，用PBST緩沖液洗3次，每次2分鐘，甩干后，加入經(jīng)PBST(含0.2％BSA)稀釋成不同濃度的上述小鼠抗血清200ul，37℃反應(yīng)2小時。用PBST洗3次，甩干后，加入經(jīng)PBST(含0.2％BSA)1/5000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗鼠酶標(biāo)抗體(Sigma公司產(chǎn)品)200ul，37℃反應(yīng)1小時，用PBST洗4次，甩干后，加入200ul底物緩沖液，室溫下反應(yīng)30分鐘，然后加入50ul3MNaOH終止反應(yīng)，讀取各小孔405nm光吸收值。如表3所示，植物來源的CS6B亞基抗原蛋白具有相當(dāng)強的免疫原性，所制備的小鼠抗血清在稀釋倍數(shù)達(dá)1/10,000時，檢測20ngCS6B亞基抗原蛋白時，OD405nm的吸光值比陰性對照的高2倍之多。而以其他蛋白如BSA或卵清蛋白替代CS6B亞基蛋白包被酶聯(lián)反應(yīng)板后，則不能發(fā)生任何特異性血清學(xué)反應(yīng)(結(jié)果未列出)。同時，用PBS緩沖液免疫的小鼠血清(陰性對照)在相同稀釋度的情況下，其吸光值也表現(xiàn)為非特異性反應(yīng)。3.小鼠的口服免疫接種實驗供試小鼠與上面注射接種實驗相同。因自然取食無法確定每個小鼠的免疫劑量(各小鼠吃的量不一致)，故口服免疫接種采取一次性口腔注入的方法。取0.5g或1g轉(zhuǎn)基因馬鈴薯新鮮塊莖與等量PBS緩沖液混合后，利用玻璃勻漿器研磨成糊狀，然后利用針尖為圓球形的注射器(購自北京化學(xué)試劑商店)將勻漿液通過小鼠口腔小心注入小鼠食道內(nèi)(在操作過程中避免對小鼠消化道造成任何傷害)。小鼠在口服接種前先饑餓24小時，接種后2小時之內(nèi)不予進(jìn)水。對照轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖(不含有CS6B亞基抗原蛋白基因)進(jìn)行同樣處理，以相同方式分別注入小鼠食道內(nèi)。所有處理組均每隔10天口服接種1次，共接種8次。在每次口服接種后的第7天，從小鼠尾靜脈取血3滴，將每組(5只小鼠)小鼠的血匯集在一起，然后與100ulPBS緩沖液混合后，37℃下放置1小時，離心收集上部血清，抗血清的效價通過酶聯(lián)吸附反應(yīng)進(jìn)行測定，方法同上。檢測結(jié)果如表4和圖10所示，用含有CS6B亞基抗原蛋白的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖口服飼喂小鼠是可以誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生的，而且口服接種1g轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的效果要好于口服接種0,5g的。表4不同抗原以口服方式接種后小鼠體內(nèi)抗體產(chǎn)生情況的比較(1)表中數(shù)字為3次實驗的平均值(OD405nm吸光值)4.小鼠食用轉(zhuǎn)基因馬鈴薯后的安全性評價小鼠(BALB/c)每次飼喂1ml的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖(0.5g)汁液，每隔10天飼喂1次，連續(xù)飼喂3個月，并在此后觀察3個月年，沒有發(fā)現(xiàn)供試小鼠有畸變、死亡或其它異常情況發(fā)生。同樣地，小鼠每3天飼喂1ml轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖(0.5g)汁液1次，連續(xù)飼喂2周，此后的長時間觀察也未發(fā)現(xiàn)小鼠有畸變、死亡和其它異常情況發(fā)生，見表5。表5小鼠食用轉(zhuǎn)基因馬鈴薯后的安全性評價(1)每組供試的小鼠有5只。(2)“-”代表沒有參考文獻(xiàn)1.張兆山等，大腸桿菌熱敏腸毒素和耐熱腸毒素基因融合及其免疫原性研究，高技術(shù)通訊，2000，10(1)15-182.楊曉等，表達(dá)毒素源性大腸桿菌定居因子抗原CS6的一組基因的克隆，微生物學(xué)報，1995，35(5)390-3933.SvennerholmA，etal.，Inf.Imm.，1988，56(2)523-5284.deAizpuruaandRussell-Jones，J.Exp.Med.，1988，167440-4515.Grill，L.K.，PBIBulletin，1998，113-146.Haq，K.I.，etal.，Science，1995，268714-7167.Mason，H.S.，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，935335-53408.Ma，J.K.，etal.，Science，1995，268716-7199.Ma，S.W.andJevnnikar，A.M.，PBIBulletin，1998，16-810.Gans，P.R.，etal.，InTransgenicPlantAProductionSystemforIndustrialandPharmaceuticalProteins，editedbyM.R.L.OwenandJ.Pan.，JohnWileyandSonsLtd.，NewYork，NY.1996，pp281-29711.Krebbers，E.andvandeKerckhove，L.，TrendsinBioechnology，1990，81-312.Parmenter，D.L.，etal.，PlantMolecularBiology，1995，291167-118013.Higo，K.I.，Saito，Y.andHigo，H.，Biosci.Biotechnol.Biochem，1993，81-314.Matsumomo，S.，etal.，Biosci.Biotechnol.Biochem，1993，571249-125215.Bosch，D.，Smal.J.andKrebbers，E.，TransgenicResearch，1994，3304-31016.Sijmons，P.C.，etal.，Bio/Technology，1990，8217-22117.Dezoeen，G.A.，etal.，Virology，1989，172213-22218.Kumagai，M.H.，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90427-43019.Hamamoto，H.，etal.，Bio/Technology，1993，11930-93220.Sugiyama，Y.，etal.，F(xiàn)EBSLetters，1995，359247-25021.Turpen，T.H.，etal.，Bio/Technology，1995，1353-5722.Porta，C.，etal.，Virology，1994，202949-95523.Dasgaard，K.，etal.，NatureBiotechnology，1997，15248-25224.Fernandez-Fernandez，M.R.，etal.，F(xiàn)EBSLetters，1998，427229-23525.Man-kit，L.D.，Arntzen，C.J.andMason，H.S.，WO94/20135，199426.Mason，H.S.，Man-kit，L.D.andArntzen，C.J.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，8911745-1174927.Horsch，R.B.，etal.，Science，1985，2271229-123128.Mason，H.，etal.，PlantMolecularBiology，1988，11845-85629.王躍駒，碩士研究生論文，1998，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院30.Chee，P.P.，Drong，R.F.andSlightom，J.L.，PlantMolecularBiologyManual，1991，C31-28本發(fā)明的進(jìn)一步描述只是一些特別的優(yōu)先實施方案，是按照專利申請要求以及為了解釋和說明本專利的內(nèi)容。很顯然，在不背離本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)，可在此基礎(chǔ)上，做進(jìn)一步的改進(jìn)和變化。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<120>轉(zhuǎn)大腸桿菌定居因子CS6B亞基植物的生產(chǎn)方法及產(chǎn)品<160>2<210>1<211>441<212>DNA<213>人源毒素源性大腸桿菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)<220><221>CDS<222>(1)...(438)<400>1ggaaactggcaatataaatctctggatgtaaatgtaaatattgagcaaaattttatt57GlyAsnTrpGlnTyrLysSerLeuAspValAsnValAsnIleGluGlnAsnPheIle151015ccagatattgattccgctgttcgtataatacctgttaattacgattcggatccgaaa114ProAspIleAspSerAlaValArgIleIleProValAsnTyrAspSerAspProLys20253035ctgaattcacagttatatacggttgagatgacgatccctgcaggtgtaagcgcagtt171LeuAsnSerGluLeuTyrThrValGluMetThrIleProAlaGlyValSerAlaVal40455055aaaatcgtaccaacagatagtctgacatcttctggacagcagatcggaaagctggtt228LysIleValProThrAspSerLeuThrSerSerGlyGlnGlnIleGlyLysLeuVal60657075aatgtaaacaatccagatcaaaatatgaattattatatcagaaaggattctggcgct285AsnValAsnAsnProAspGlnAsnMetAsnTyrTyrIleArgLysAspSerGlyAla80859095ggtaagtttatggcagggcaaaaaggatccttttctgtcaaagagaatacgtcatac342GlyLysPheMetAlaGlyGlnLysGlySerPheSerValLysGluAsnThrSerTyr100105110acattctcagcaatttatactggtggcgaataccctaatagcggatattcgtctggt399ThrPheSerAlaIleTyrThrGlyGlyGluTyrProAsnSerGlyTyrSerSerGly115120125130acttatgcaggacatttgactgtatcattttacagcaattaa441ThrTyrAlaGlyHisLeuThrValSerPheTyrSerAsn*135140145<210>2<211>146<212>PRT<213>人源毒素源性大腸桿菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)<400>2GlyAsnTrpGlnTyrLysSerLeuAspValAsnValAsnIleGluGln151015AsnPheIleProAspIleAspSerAlaValArgIleIleProValAsn202530TyrAspSerAspProlysLeuAsnSerGluLeuTyrThrValGluMet354045ThrIleProAlaGlyValSerAlaValLysIleValProThrAspSer505560LeuThrSerSerGlyGlnGlnIleGlyLysLeuValAsnValAsnAsn65707580ProAspGlnAsnMetAsnTyrTyrIleArgLysAspSerGlyAlaGly859095LysPheMetAlaGlyGlnLysGlySerPheSerValLysGluAsnThr100105110SerTyrThrPheSerAlaIleTyrThrGlyGlyGluTyrProAsnSer115120125GlyTyrSerSerGlyThrTyrAlaGlyHisLeuThrValSerPheTyr130135140SerAsn14權(quán)利要求1.一種通過轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白或其衍生物的方法。2.如權(quán)利要求1中的方法，其中所說的植物至少有一部分是可以食用的。3.一種引起人或哺乳動物對毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白或其衍生物產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括使用有效和確定免疫劑量的、來源于能產(chǎn)生該抗原蛋白或其衍生物的轉(zhuǎn)基因植物的植物材料或其加工提取物對人或哺乳動物進(jìn)行口服或腸道給藥。4.如權(quán)利要求3中的方法，其中所說的植物至少有一部分是可以食用的。5.一種食物至少是由轉(zhuǎn)基因植物的某一部分所組成，它被食用是因為它具有一定的營養(yǎng)價值，其中所說的植物是一種能夠表達(dá)毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白或其衍生物的植物，該蛋白在天然狀態(tài)下具有免疫原性。6.如權(quán)利要求5中的任何食物，其中所說的植物食用部分包括果實、葉子、莖、根或所說的植物種子。7.一個用于轉(zhuǎn)化植物的質(zhì)粒載體包括一段編碼毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白或其衍生物的DNA序列，該序列編碼的蛋白在天然狀態(tài)下具有免疫原性，一個與所說的DNA序列連接的植物啟動子，該啟動子操縱所說的基因在所說的植物中表達(dá)。8.如權(quán)利要求7中的質(zhì)粒載體，它含有一個選擇或標(biāo)記基因。9.如權(quán)利要求7中的質(zhì)粒載體，其中所說的植物至少有一部分是可食用性的。10.一段用于基因槍法轉(zhuǎn)化植物的DNA序列包括一段編碼毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白或其衍生物的DNA序列，該序列編碼的蛋白在天然狀態(tài)下具有免疫原性；一個與所說的DNA序列連接的植物啟動子，該啟動子操縱所說的基因在所說的植物中表達(dá)。11.如權(quán)利要求10中的DNA序列，它含有一個選擇或標(biāo)記基因。12.如權(quán)利要求10中的DNA序列，其中所說的植物至少有一部分是可食性的。13.一種構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法包括構(gòu)建一個質(zhì)粒載體或一段DNA序列，其中都含有一段編碼毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白或其衍生物的基因，該基因編碼的蛋白在天然狀態(tài)下具有免疫原性；一個與所說的DNA序列連接的植物啟動子，該啟動子操縱所說的基因在所說的植物中表達(dá)；用該質(zhì)粒載體或該DNA序列轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。14.如權(quán)利要求13中的方法，它包括從所說的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株。15.生產(chǎn)一種膠囊、沖劑或其它制劑的方法包括構(gòu)建一個質(zhì)粒載體或一段DNA序列，其中都含有一段編碼毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白或其衍生物的基因和可操縱該基因在所說的植物中表達(dá)的植物啟動子，該基因編碼的蛋白在天然狀態(tài)下具有免疫原性。用該質(zhì)粒載體或該DNA序列轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；將轉(zhuǎn)基因植物食用部分冷凍、干燥和磨碎后制作成膠囊、沖劑或其它制劑。16.如權(quán)利要求15的方法，其中還包括在利用轉(zhuǎn)基因植物作為食物以及加工成膠囊、沖劑或其它制劑之前，應(yīng)從所說的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株。17.如權(quán)利要求15中的方法，其中還包括從所說的植物細(xì)胞中部分純化或完全純化出所說的抗原蛋白作為膠囊、沖劑或其它制劑的活性組成部分。18.如權(quán)利要求15中的方法，其中所說的植物細(xì)胞是通過農(nóng)桿菌系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的。19.如權(quán)利要求18中的方法，其中所說的農(nóng)桿菌系統(tǒng)是農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒系統(tǒng)。20.如權(quán)利要求15中的方法，其中所說的植物是番茄、馬鈴薯、萵苣、胡蘿卜、苜蓿、黃瓜、小麥和水稻或其它可食用的植物。21.如權(quán)利要求15中的方法，其中所說的植物細(xì)胞是通過除農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以外的其它轉(zhuǎn)化方法如基因槍法、微管注射法、PEG吸收法以及電融合法等方法轉(zhuǎn)化的。22.如權(quán)利要求15中的方法，其中所說的植物細(xì)胞是一個雙子葉植物的細(xì)胞，或是一個單子葉植物的細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涉及表達(dá)毒素源性大腸桿菌定居因子抗原蛋白及其衍生物轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法，并進(jìn)而通過直接食用或腸道給藥的方式利用這些含有大腸桿菌定居因子抗原蛋白的轉(zhuǎn)基因植物及其衍生物從而引起人或哺乳動物對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)。文檔編號A61K9/48GK1928095SQ200510098259公開日2007年3月14日申請日期2005年9月5日優(yōu)先權(quán)日2005年9月5日發(fā)明者劉德虎,李剛強,徐妙云,魏昭榮,王躍駒申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所