弱毒力cmv載體在表達(dá)抗蟲基因增強(qiáng)植物抗蟲性方面的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種黃瓜花葉病毒弱毒力載體在增強(qiáng)植物抗蟲性能方面的應(yīng)用。所述黃瓜花葉病毒弱毒力載體的構(gòu)建方法包括如下步驟：1)、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表達(dá)載體；具體為：將已構(gòu)建好的病毒CMV侵染性克隆質(zhì)粒之一pCB?CMVF209采用酶切連接的方法改造，使2b基因缺失，并加入酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成為弱毒力的病毒表達(dá)載體???弱病毒載體；2)、將抗蟲基因編碼區(qū)(ORF)序列插入步驟1)所得的弱病毒載體構(gòu)建重組弱病毒表達(dá)載體；構(gòu)建所得的含抗蟲基因編碼區(qū)序列的重組弱病毒表達(dá)載體用于增強(qiáng)植物對(duì)害蟲的抗性。
【專利說(shuō)明】
弱毒力CMV載體在表達(dá)抗蟲基因増強(qiáng)植物抗蟲性方面的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及病毒載體的用途，特別是黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus， CMV)弱毒力載體在增強(qiáng)植物抗蟲性能方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有研究開發(fā)的植物病毒載體可分為三種用途:一是主要用于表達(dá)藥用蛋白、抗 體等；二是用于分析或利用外源基因功能;三是用于病毒誘導(dǎo)的基因沉默分析被沉默基因 的功能。在病毒載體用于外源蛋白表達(dá)的研究方面，早期研究開發(fā)病毒載體的目的主要用 于外源蛋白表達(dá)。利用植物病毒載體表達(dá)外源基因的方法主要有兩種:一是在體外轉(zhuǎn)錄攜 帶目的基因的侵染性CDNA克隆，將病毒基因組CDNA進(jìn)行基因取代、插入融合等 [14]，外源基 因被加入后，便置于原核啟動(dòng)子下游，然后以其轉(zhuǎn)錄物RNA直接侵染植物或者用基因槍的方 法將病毒載體轉(zhuǎn)入植物中完成侵染，接種植物后病毒在寄主細(xì)胞內(nèi)自主增殖進(jìn)行外源基因 的表達(dá) [15];二是將侵染性病毒的基因組cDNA克隆插入到Act2、CaMV35S轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子等下游 構(gòu)建攜帶目的基因的侵染性重組病毒體，采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法浸潤(rùn)接種植物，從而在寄主細(xì) 胞內(nèi)完成一系列轉(zhuǎn)錄、合成及裝配過(guò)程，實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)過(guò)程。Marillonnet等在前人 的基礎(chǔ)上建立了農(nóng)桿菌浸潤(rùn)(Agro-infiltration)接種技術(shù)，便使得病毒載體用于外源蛋 白表達(dá)達(dá)到了一個(gè)令人滿意的水平，使外源蛋白的表達(dá)又踏上了一個(gè)新臺(tái)階 [16]。至今用于 表達(dá)藥用蛋白的主要病毒載體及表達(dá)的藥用蛋白或抗原如下[17~]:豇豆花葉病毒(cowpea mosaic virus，CPMV)表達(dá)的口蹄疫病毒(FMDV)VPl抗原、人免疫缺陷病毒(HIV-l)gp41抗 原、人鼻病毒(HRV-14)抗原、犬細(xì)小病毒(CPV)抗原、慢性肺炎病菌(Pseudom aeruginosa) 外層臘蛋白F抗原、stahylococcus aureus D2domain肽、皰疾抗原、水紹腸炎病毒(MEV)抗 原、對(duì)傳染性腸胃炎病毒(TGEV)具有特異性小分子免疫蛋白（SIP)、乙型肝炎病毒核心抗原 (HBcAghTMV載體表達(dá)的有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)、流感病毒血凝素、人免疫缺損 病毒(HIV-1)抗原、瘧疾抗原、鼠帶狀瘡疹ZP3糖蛋白、口蹄疫病毒(FMDV)VPl抗原、α-天花粉 蛋白、38C13鼠 Β細(xì)胞淋巴瘤單鏈抗體、腸癌病毒單抗、口蹄疫病毒(FMDV)VPl、牛孢疹病毒I 型(BHV-l)gDC、豬傳染性腹瀉病毒(PEDV)中和表位;TBSV表達(dá)的人免疫缺損病毒(HIV-1)V3 環(huán)抗原、犬細(xì)小病毒(CPV)抗原;PVX載體表達(dá)的有人免疫缺損病毒(HIV-l)gp41抗原、輪狀 病毒VP6抗原、人類乳突病毒16(HPV-16)E7蛋白抗原、人乳鐵蛋白N葉、人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞 集落刺激因子(GM-CSF)、肺結(jié)核抗原ESAT-6;ALMV載體表達(dá)的有呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋 白抗原；PPV病毒載體表達(dá)的兔出血熱病毒（RHDV)VP60抗原；三葉草黃脈病毒Clover yellow vein virus(ClYVV)載體表達(dá)可溶性甲燒單加氧酶C亞單位(sMM〇-C) ;CMV載體表達(dá) 的aFGF蛋白等。在病毒載體用于分析或利用外源基因功能方面，植物病毒載體除了用于表 達(dá)疫苗抗原、抗體和藥用蛋白生產(chǎn)外，還可用于表達(dá)外源基因，分析基因功能，分析外源蛋 白與植物中蛋白質(zhì)的相互作用。例如，含番茄葉霉病菌avr9無(wú)毒基因的PVX重組表達(dá)載體通 過(guò)農(nóng)桿菌浸潤(rùn)接種帶有抗病(R)基因 cf-9的番茄植株葉，番茄植株會(huì)發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，表明R 基因表達(dá)的產(chǎn)物可與avr9基因產(chǎn)物發(fā)生了直接的相互作用[18]。在病毒載體用于分析被沉 默基因的功能方面，病毒介導(dǎo)的基因沉默(VIGS)是根據(jù)植物對(duì)RNA病毒獨(dú)特的防御機(jī)制發(fā) 展而來(lái)的一種技術(shù)，因其操作簡(jiǎn)便、效率高、周期短、避免植物轉(zhuǎn)化、克服基因重復(fù)等特點(diǎn)， 可以在不同的遺傳背景下工作，對(duì)基因的分析更清楚，漸漸成為了研究植物基因功能的一 種有效方法。在正向遺傳學(xué)及反向遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)和鑒定基因功能的研究方面發(fā)揮著重要的作 用，越來(lái)越多的植物病毒被改造成有效的沉默載體，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功 能研究方面取得了顯著的進(jìn)展 [2()]。1997年，Van 1(&1111^11等[21]最早對(duì)VIGS進(jìn)行了定義，最初 的意義是用來(lái)描述植物收病毒侵染后產(chǎn)生的癥狀恢復(fù)現(xiàn)象。后來(lái)，VIGS專指利用重組病毒 載體攜帶外源基因侵染植物后，隨著病毒的復(fù)制和移動(dòng)特異性的誘導(dǎo)植物沉默自身內(nèi)源基 因的一種現(xiàn)象 [22,23]。1995年，Kumagai[24]等人，以煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus， TMV)為載體進(jìn)行改造，他在TMV中插入了一段從煙草cDNA反轉(zhuǎn)錄出來(lái)的（phy toene desaturase，H)S)序列，利用這個(gè)攜帶PDS序列的病毒載體侵染煙草后，植物出現(xiàn)系統(tǒng)性褪 綠的光漂白現(xiàn)象，同時(shí)H)S的mRNA水平也出現(xiàn)顯著性降低。結(jié)果說(shuō)明植物出現(xiàn)漂白現(xiàn)象是由 于ros表達(dá)水平下降導(dǎo)致的，而ros是類胡蘿卜素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，對(duì)植物有著光保護(hù)作 用。1998年，此匕等 [25]采用PVX馬鈴薯X病毒(Potato X virus)載體攜帶ros的序列的方法， 也引發(fā)植物出現(xiàn)了相同的光漂白現(xiàn)象。后來(lái)，人們利用改造的VIGS載體對(duì)植物進(jìn)行目的性 的基因沉默，抑制內(nèi)源基因的表達(dá)，從而達(dá)到研究植物基因功能的作用。1998年，Kj emtrup 等[26]利用雙生病毒科的番茄金色花葉病毒（STMV)為VIGS載體插入鎂離子螯合酶 (magnesium chelatase)的關(guān)鍵基Su(Sulfur)和轉(zhuǎn)焚光蛋白基因 luc(luciferase)，從而引 起了植物出現(xiàn)葉片黃化和轉(zhuǎn)luc植物不再發(fā)出熒光的表型。2001年，1^化11€€等 [27]，報(bào)道了 以煙草脆裂病毒TRV構(gòu)建的VIGS載體，相比于PVX、TMV、TGMV有許多優(yōu)點(diǎn)，其中TRV的VIGS載 體相比于PVX對(duì)植物的癥狀影響較輕，并且在沉默效率、侵染范圍、持久性方面都比PVX更加 完善。2002年，Liu等 [28]利用煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)在番前中進(jìn)行了 VIGS試驗(yàn)，可以對(duì)已經(jīng)公布的番茄EST文庫(kù)進(jìn)行功能研究分析。目前，TRV是應(yīng)用范圍最廣的 VIGS病毒載體，不僅其誘導(dǎo)植物的沉默效率高，而且更容易誘導(dǎo)分生組織的基因沉默，目前 在煙草、番茄等茄科植物中均有大量的報(bào)道。TRV載體目前有3個(gè)版本，最初由Ratcliff 等[27]構(gòu)建的版本，1^11等[29]的pYL156、pYL279修改版本、以及 [3Q]構(gòu)建的TRV-2b版本。其中，1^11等[29]的?￥1^156和pYL279版本，為了使病毒大量的在植株內(nèi)擴(kuò)增，該病毒 還加入了 2個(gè)35S啟動(dòng)子，并且在C端還加入了核酶。而TRV-2b的版本病毒載體中含有TRV RNA2中的2b序列。目前，TRV的病毒載體已在番前、煙草、棉花（Gossypium spp .)、牽牛 花[31]、擬南芥和罌粟(opium 口<^口7)[32]等多種植物上被應(yīng)用。2002年，Holzberg等[33]利用 大麥條紋花葉病毒bsmv攜帶pds片段，成功引起了大麥的白化現(xiàn)象，抑制了大麥ros基因的 表達(dá)，這是首次利用VIGS載體在單子葉植物上實(shí)現(xiàn)了基因沉默。2006年，011^等 [34]用雀麥 花葉病毒(Brome mosaic virus，BMV)進(jìn)行改造，同樣成功的在水稻、玉米等單子葉植物中 完成了對(duì)基因沉默的研究。目前，病毒載體也開始用于研究對(duì)昆蟲的RNA干擾 [35]。但現(xiàn)有病 毒載體由于對(duì)寄主植物本身具有致病作用，因而不能用于表達(dá)抗蟲基因增強(qiáng)植物的抗蟲性 能。
[0003]上文涉及的參考文獻(xiàn)具體如下：
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[0026] 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)，植物病毒載體在用于在增強(qiáng)植物抗蟲性能方面的應(yīng)用僅僅 在于對(duì)昆蟲的RNA干擾，黃瓜花葉病毒載體在增強(qiáng)植物抗蟲性能方面沒(méi)有報(bào)道，黃瓜花葉病 毒弱毒力載體在通過(guò)表達(dá)抗蟲基因增強(qiáng)植物抗蟲性能方面沒(méi)有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0027] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種黃瓜花葉病毒弱毒力載體在增強(qiáng)植物抗蟲 性能方面的應(yīng)用。
[0028] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種黃瓜花葉病毒(CMV)弱毒力載體在增強(qiáng) 植物抗蟲性能方面的應(yīng)用。
[0029]作為本發(fā)明的黃瓜花葉病毒弱毒力載體在增強(qiáng)植物抗蟲性能方面的應(yīng)用的改進(jìn)：
[0030] 所述黃瓜花葉病毒弱毒力載體的構(gòu)建方法包括如下步驟：
[0031] 1)、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表達(dá)載體;具體為：
[0032]將已構(gòu)建好的病毒CMV侵染性克隆質(zhì)粒之一 pCB-CMVF209采用酶切連接的方法改 造，使2b基因缺失，并加入酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成為弱毒力的病毒表達(dá)載體---弱病毒載體；
[0033] 2)、將抗蟲基因編碼區(qū)（0RF)序列插入步驟1)所得的弱病毒載體構(gòu)建重組弱病毒 表達(dá)載體；
[0034]構(gòu)建所得的含抗蟲基因編碼區(qū)序列的重組弱病毒表達(dá)載體用于增強(qiáng)植物對(duì)害蟲 的抗性。
[0035]作為本發(fā)明的黃瓜花葉病毒弱毒力載體在增強(qiáng)植物抗蟲性能方面的應(yīng)用的進(jìn)一 步改進(jìn)：
[0036] 所述步驟 1)中的酶切位點(diǎn)為:Stu I、Mlu I、Spe I、Apa I、BamH I、Sac II。
[0037] 作為本發(fā)明的黃瓜花葉病毒弱毒力載體在增強(qiáng)植物抗蟲性能方面的應(yīng)用的進(jìn)一 步改進(jìn)：
[0038]所述步驟1)具體包括如下步驟：
[0039] ①、以CMV序列為模板，酶切位點(diǎn)的的正、反向引物為：
[0040] 加酶切位點(diǎn)Nco I的NcoIF2:CATGCcatggctgagtttgcctg;
[0041 ]加酶切位點(diǎn)Stu I的2a0RFlR: gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttgg;
[0042] 以質(zhì)粒pCB-CMVF209為模板，PCR擴(kuò)增合成PCR產(chǎn)物，以Nco I、Stu頂每切PCR產(chǎn)物， 純化；
[0043] ②、選擇Stu I以及Mlu I、Spe I、Apa I、BamH I中至少1個(gè)酶切位點(diǎn)加入正向引物 的5'，設(shè)計(jì)在5'加入Avr Π 酶切位點(diǎn)的反向引物；
[0044] 以質(zhì)粒pCB-CMVF209為模板，PCR擴(kuò)增合成PCR產(chǎn)物，以Stu I、Avr II酶切PCR產(chǎn)物， 純化；
[0045] ③、以Nco I、Avr Π 酶切質(zhì)粒pCB-CMVF209;
[0046]④、采用T4-DNA連接酶試劑盒將酶切的PCR產(chǎn)物與酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌感受態(tài)DH5a;
[0047] ⑤、對(duì)上述轉(zhuǎn)化得到的菌落再液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用Nco I、Avr II酶切鑒定和 (或)PCR鑒定(最后送測(cè)序公司測(cè)序鑒定），得到構(gòu)建正確的質(zhì)粒pCB-CMVF209-n〇2b，保存?zhèn)?用。
[0048] 作為本發(fā)明的黃瓜花葉病毒弱毒力載體在增強(qiáng)植物抗蟲性能方面的應(yīng)用的進(jìn)一 步改進(jìn)：
[0049] 所述步驟②中的正向引物：GAAGGCCTGACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcggAA Cctccccttccgcatct (為 2b0RF333F);或由 GA A G G C C T 與序列 GACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcgg中的至少1個(gè)酶切位點(diǎn)的序列與序列AA Cctccccttccgcatct 組成；
[0050] 所述步驟②中的反向引物為AvrIIR:Cttccgaagaaacctaggag。
[00511具體而言，上述正向引物為以下任一：
[0052] 正向引物:GAAGGCCTGGGATCCAACctccccttccgcatct ；
[0053] 正向引物：GAAGGCCTGGACTAGTgggcccGGGATCCAACctccccttccgcatct
[0054] 正向引物：
[0055] GAAGGCCTGACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcggAACctccccttccgcatct〇
[0056] 作為本發(fā)明的黃瓜花葉病毒弱毒力載體在增強(qiáng)植物抗蟲性能方面的應(yīng)用的進(jìn)一 步改進(jìn)：
[0057]所述步驟2)具體包括如下步驟：
[0058] ①、以抗蟲基因編碼區(qū)（0RF)序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)加酶切位點(diǎn)Stu I或Mlu I或Spe I 或Apa I或BamH I的正向引物，加酶切位點(diǎn)Mlu I或Spe I或Apa I或BamH I或Sac II的反向 引物(但反向引物所加酶切位點(diǎn)必須是在正向引物所加的酶切位點(diǎn)的后一個(gè)酶切位點(diǎn)）；以 含目的基因的質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增目的基因，純化，以正、反向引物所加酶切位點(diǎn)的酶酶切 PCR產(chǎn)物，純化；
[0059] ②、以與上述步驟①（即，步驟2)的步驟①)相同的酶酶切質(zhì)粒pCB-CMVF209-no2b;
[0060] ③、采用T4-DNA連接酶試劑盒將酶切的PCR產(chǎn)物與酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌感受態(tài)DH5a;
[0061] ③對(duì)上述轉(zhuǎn)化得到的菌落液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用與上述①（即，2. (1))相同的 酶酶切鑒定，和（或)進(jìn)行PCR鑒定（最后送測(cè)序公司測(cè)序鑒定），得到構(gòu)建正確的質(zhì)粒pCB-CMVF209no2b-gene。保存?zhèn)溆谩?br>[0062] 質(zhì)粒？08-01^?20911〇21336116，具體為邛08-01￥?20911〇213-45]\?^邛〇8-CMVF209no2b-RccI、pCB-CMVF209no2b-MaARSEF。
[0063] 發(fā)明了利用黃瓜花葉病毒cucumber mosaic virus(CMV)改造成對(duì)植物沒(méi)有致病 性的弱病毒表達(dá)載體，應(yīng)用于表達(dá)抗蟲基因，增強(qiáng)植物抗蟲性能。
[0064]本發(fā)明總的具體方案如下：
[0065] 1、將已構(gòu)建好的病毒CMV侵染性克隆質(zhì)粒之一 pCB-CMVF209采用酶切連接的方法 (具體點(diǎn)）改造，使2b基因缺失，并加入酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成為弱毒力的病毒表達(dá)載體pCB-CMVF209no2b〇 [0066] 具體地：
[0067] (1)以CMV序列為模板，設(shè)計(jì)加正、反向引物。NcoIF2: CATGCcatggctgagtttgcctg; 2a0RFlR: gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttgg。以質(zhì)粒 pCB_CMVF209 為模板，PCR 擴(kuò)增合成 PCR產(chǎn)物，以Nco I、Stu頂每切PCR產(chǎn)物，純化，備用。
[0068] (2)選擇Stu I以及Mlu I、Spe I、Apa I、BamH I、Sac II中至少1個(gè)酶切位點(diǎn)加入正向引 物的5 ' 端，形如 2b0RF333F:GAAGGCCTGACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcggAACctccccttcc gcatct;設(shè)計(jì)在5'加入Avr II酶切位點(diǎn)的反向引物AvrIIR:Cttccgaagaaacctaggag。以質(zhì)粒 PCB-CMVF209為模板，PCR擴(kuò)增合成PCR產(chǎn)物，以Stu I、Avr Π 酶切PCR產(chǎn)物，純化，備用。
[0069] (3)以Nco I、Avr Π 酶切質(zhì)粒pCB-CMVF209,備用。
[0070] (4)采用T4-DNA連接酶試劑盒將酶切的PCR產(chǎn)物與酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌感受態(tài)DH5a。
[0071] (5)、在上述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)長(zhǎng)出菌落的平板內(nèi)挑選菌落再液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用Nco 1、 Avr II酶切鑒定和（或）PCR鑒定，最后送測(cè)序公司測(cè)序鑒定，將構(gòu)建正確的質(zhì)粒pCB-CMVF209-no2b 保存?zhèn)溆谩?br>[0072] 2、將抗蟲基因編碼區(qū)（0RF，小于700bp)序列插入弱病毒載體構(gòu)建重組病毒表達(dá)載 體。具體地：
[0073] (1)、以抗蟲基因編碼區(qū)（0RF)序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)加酶切位點(diǎn)Stu I或Mlu I或Spe I 或Apa I或BamH I的正向引物，形如GeneMluF: cgAcgcgt-基因0RF的5 '端20bp左右序列，例 如：cgAcgcgt atgagcccagaacgacgcc;加酶切位點(diǎn)Mlu I或Spe I或Apa I或BamH I或Sac Π 的反向引物(但反向引物所加酶切位點(diǎn)必須是在正向引物所加的酶切位點(diǎn)的后一個(gè)酶切 位點(diǎn)），形如GeneBamR: CGggatcc-基因0RF的3 '端20bp左右序列，例如： CGggatcctcagatctcggtgacgggca。以含目的基因的質(zhì)粒例如pMD18_gene(由NCBI庫(kù)中可查 得目的基因序列，由基因合成公司合成，構(gòu)建成質(zhì)粒pMD18-gene;或者目的基因由該基因的 來(lái)源植物或微生物采用Trizol法提取總RNA，按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書，以目的基因的正向引 物和反向引物做RT-PCR獲得，然后按pMD18載體使用說(shuō)明書操作構(gòu)建成質(zhì)粒pMD18-ASMLL) 為模板，PCR擴(kuò)增目的基因，以正、反向引物所加酶切位點(diǎn)的酶酶切PCR產(chǎn)物，純化，備用。 [0074] (2)以與2. (1)相同的酶酶切質(zhì)粒pCB-CMVF209-no2b，備用。
[0075] (3)采用T4-DNA連接酶試劑盒將酶切的PCR產(chǎn)物與酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌感受態(tài)DH5a。
[0076] (4)、在上述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)長(zhǎng)出菌落的平板內(nèi)挑選菌落再液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用與 2. (1)相同的酶酶切鑒定和（或）PCR鑒定，最后送測(cè)序公司測(cè)序鑒定，將構(gòu)建正確的質(zhì)粒 pCB-CMVF209no2b-gene 保存?zhèn)溆谩?br>[0077] 3、將含抗蟲基因的重組弱病毒表達(dá)載體pCB-CMVF209no2b-gene轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，具體 方法是公知方法。
[0078] 4、質(zhì)粒農(nóng)桿菌浸潤(rùn)法將 pCB-CMVF209no2b-gene、pCB-CMVF109、pCB-CMV309 質(zhì)粒農(nóng) 桿菌混合浸潤(rùn)接種4-6葉齡植物苗葉，具體方法是公知方法。
[0079] 5、接種苗室溫培養(yǎng)8天后，即可按常規(guī)苗管理。
[0080] 6、將接種葉以上的植株葉片喂食目標(biāo)害蟲，顯著降低害蟲的生長(zhǎng)發(fā)育速率。
[0081 ] 在本發(fā)明中，質(zhì)粒pMD18-ASMLL可由NCBI庫(kù)中查得ASMLL基因序列，由基因合成公 司合成，構(gòu)建成質(zhì)粒PMD18-ASMLL;或者ASMLL基因由大蒜提取總RNA，按RT-PCR試劑盒說(shuō)明 書，以引物ASMLLBamR和ASMLLMluF做RT-PCR獲得，然后按pMD18載體使用說(shuō)明書操作構(gòu)建成 質(zhì)粒 PMD18-ASMLL。
[0082]其余類同。
[0083] 附:通過(guò)從來(lái)源植物提取含目的基因的RNA，構(gòu)建pMD18-ASMLL的方案。ASMLL基因 由大蒜提取總RNA，按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書，以引物ASMLLBamR和ASMLLMluF做RT-PCR獲得， 然后按PMD18載體使用說(shuō)明書操作構(gòu)建成質(zhì)粒pMD18-ASMLL，方案具體如下：
[0084] -、植物總RNA提取
[0085] 取接種10天后的煙草植株非接種葉片(接種葉上面一片葉子)提取總RNA，具體方 法參照invi trogen公司Tr izol試劑說(shuō)明書，操作步驟參照張斯。
[0086] 1)稱取0.2g接種葉片置于潔凈的研缽中，加入適量液氮研磨充分至粉末。
[0087] 2)將研磨后的粉末轉(zhuǎn)移至潔凈的2ml離心管中，加入lml Trizol試劑上下顛倒混 勻，冰上放置l〇min。
[0088] 3)再提取液中加入300μ1氯仿，振蕩均勻置于冰上lOmin。
[0089] 4)4°C，14 OOOrpm離心 15min。
[0090] 5)小心吸取上清500μ1置于新的離心管中，加入等體積的氯仿，渦漩振蕩，冰上放 置10min〇
[0091] 6)4°C，14 OOOrpm離心 15min。
[0092] 7)小心吸取上清300μ1置于新的離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，-20°C 放置 30min。
[0093] 8)4°C，14 OOOrpm離心 15min，去上清。
[0094] 9)加入DEPC處理的水配置的75 %的酒精洗滌沉淀，冰上放置5min。
[0095] 10)4°C ,14 OOOrpm離心 15min。（可重復(fù)此步驟一次）
[0096] 11)室溫放置揮發(fā)去掉酒精(可以用真空干燥器進(jìn)行蒸干），加入30μ1 DEPC處理的 水溶解沉淀，-80 °C儲(chǔ)存待用。
[0097] Stepl :cDNA的合成體系如下：
[0098] RNA 模板 2μ1
[0099] R反向引物(ASMLLBamR) ΙμL
[0100] DEPC Treated water 2.5μ1
[0101] 混勻后65°C變性lOmin，冰上放置5min，離心數(shù)秒，依次加入： Recombinant RKfase lnhibitor(RRI) 0.25μ1 dNTP mixture 2μ1
[0102] 5^Reverse Transciplasc M-MLV Buffer 2μ1 Reverse Transcriptase M'MLV (RNase H-) 0,25μΙ
[0103] 混合均勻離心數(shù)秒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，設(shè)置參數(shù)如下：
[0104] 42 °C 60min
[0105] 70 °C 15min
[0106] 反應(yīng)結(jié)束后置于-20 °C待用。
[0107] Step2:對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR擴(kuò)增 [0108] PCR體系設(shè)置如下： IGxbulTcr 5μ1 ddH20 37,5μ1 dNTPS 4μ1 ASMLLMluF ΙμL
[0109] ASMLLBamR ΙμΙ 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 ΙμΙ PyrobcsL Tag 0.5μ! 總體積 50μ1
[0110] PCR條件的設(shè)置如下：
[0111]
[0112] 反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，采用試劑盒純化回收。
[0113] 經(jīng)回收純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，即在0.2mL的離心管中依次加入以下 試劑:在0.5mL離心管中，依次加入以下試劑： ddHaO 2 μL pMDlS~T vccior 1 μL
[0114] PCR回收產(chǎn)物 2μ[ Solution I 5 μL Total 10 μL
[0115] 輕輕混勻后離心3sec，4°C連接過(guò)夜。
[0116] 二、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
[0117] 1) 100yL感受態(tài)細(xì)胞HB101 (TaKaRa公司）中加入10yL的連接產(chǎn)物，輕輕混勻后，冰 上靜置30min;
[0118] 2)將上述離心管轉(zhuǎn)移入42 °C恒溫水浴中熱擊60s，立即置冰上5min;
[0119] 3)加入600yL的LB液體培養(yǎng)基(37°C預(yù)熱）；
[0120] 4)37°C，150rpm，搖床培養(yǎng) lhr;
[0121] 5)取200yL轉(zhuǎn)化后的菌液在超凈臺(tái)內(nèi)均勻涂布于含Amp (100yg/mL)的LB固體平板 上;平板于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)正置30min后倒置培養(yǎng)12-16hr。
[0122] 三、堿法制備重組質(zhì)粒DNA
[0123] 1)挑取陽(yáng)性單菌落接種于lmL含Amp(100yg/mL)的LB培養(yǎng)基中（1.5mL離心管），37 °C，200rpm振蕩培養(yǎng)8-16h;
[0124] 2)低速離心收集菌體(5000rpm，2min);
[0125] 3)菌體懸浮于150yL溶液I中，充分渦旋；
[0126] 4)加入150yL溶液Π ，來(lái)回輕輕顛倒3次；
[0127] 5)加入200yL溶液ΙΠ ，來(lái)回輕輕顛倒3次，充分?jǐn)U散；
[0128] 6)加入500yL三氯甲烷，充分渦旋混勻lmin;
[0129] 7)4°C，12000rpm離心10min，小心吸取上清，置于新的1.5mL離心管中；
[0130] 8)加入400yL異丙醇，顛倒混勻，-20°C沉淀30min;
[0131] 9)4°C，12000rpm 離心 10min，棄上清；
[0132] 10)200yL 75%乙醇洗沉淀，12000rpm離心3min，棄上清，沉淀真空干燥3min;
[0133] 11)沉淀溶于50yL RTE(RNase A 10yg/mL)中，置于37°C培養(yǎng)箱30min;
[0134] 取3yL 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0135] 在上述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)長(zhǎng)出菌落的平板內(nèi)挑選菌落再液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用PMD18載 體上酶切位點(diǎn)酶切，采用測(cè)序引物做PCR鑒定，最后送測(cè)序公司測(cè)序鑒定，得到構(gòu)建正確的 質(zhì)粒 PMD18-ASMLL。
[0136] 在本發(fā)明中，質(zhì)粒pMD18_Rcc I由NCBI庫(kù)中查得Reel基因序列，由基因合成公司合 成，構(gòu)建成質(zhì)粒pMD18-RccI;或者Reel基因可由蓖麻葉提取總RNA，按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書， 以引物Rcc IBamR和Rcc ISpeF做RT-PCR獲得，然后按pMD18載體使用說(shuō)明書操作構(gòu)建成質(zhì) 粒pMD18-RccI，具體方案可參照質(zhì)粒pMD18-ASMLL的構(gòu)建方案。
[0137] 在本發(fā)明中，質(zhì)粒pMD18-MaARSEF由NCBI庫(kù)中查得MaARSEF基因序列，由基因合成 公司合成，構(gòu)建成質(zhì)粒pMD18-MaARSEF;或者M(jìn)aARSEF基因由綠僵菌提取總RNA，按RT-PCR試 劑盒說(shuō)明書，以引物MaARSEFMluR和MaARSEFStuF做RT-PCR獲得，然后按pMD 18載體使用說(shuō)明 書操作構(gòu)建成質(zhì)粒pMD18-MaARSEF。具體方案可參照質(zhì)粒pMD18-ASMLL的構(gòu)建方案。
[0138] 本發(fā)明具有如下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
[0139] 1、構(gòu)建了一個(gè)含有抗蟲基因的載體pCB-CMVF209n〇2b-gene，其具有對(duì)植物弱致病 力的性能，能用于作物生產(chǎn)中。
[0140] 2、將該載體pCB-CMVF209n〇2b-gene導(dǎo)入植株后，能顯著增強(qiáng)植物對(duì)目標(biāo)害蟲的抗 性。
[0141] 3、本發(fā)明構(gòu)建了一個(gè)含有抗蟲基因的CMV重組弱病毒株，對(duì)植物無(wú)致病癥狀且可 在煙草屬植物中長(zhǎng)距離移動(dòng)。
【具體實(shí)施方式】
[0142] 實(shí)施例1、
[0143] 1、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表達(dá)載體;具體包括如下步驟：
[0144] (1)以CMV序列為模板設(shè)計(jì)正、反向引物。
[0145] 加 Nco I酶切位點(diǎn)的引物NcoIF2:CATGCcatggctgagtttgcctg;
[0146] 加 Stu I酶切位點(diǎn)的引物2a0RFlR: gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttgg。
[0147] 以質(zhì)粒pCB-CMVF209為模板，PCR擴(kuò)增合成PCR產(chǎn)物，以Nco I、Stu頂每切PCR產(chǎn)物，
[0148] 純化，備用。
[0149] 所述PCR擴(kuò)增體系為： lOxbulTcr 5μΙ ddH20 37.5μ1 dNTP 4μ1 pCB-CMVF209 lul
[0150] NcoIF2 ΙμΙ 2aORFlR ΙμΙ Pyrobcst Taq 0_5μ1總體積--------------------- -50μ1[0151 ] 所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋篬0152]
[0153]
[0154] 注：1、質(zhì)粒pCB-CMVF209，是CMVF209序列的侵染性克隆，具體構(gòu)建方法見中國(guó)農(nóng)業(yè) 科學(xué)2011，44( 14): 3060-3068)。
[0155] (2)設(shè)計(jì)加酶切位點(diǎn)Stu I、Mlu I、BamH I的正向引物2b0RF333F: GAAGGCCTGGGATCCAACctccccttccgcatct;加酶切位點(diǎn)2bAvrII反向引物2bAvrIIR: Cttccgaagaaacctaggag。以質(zhì)粒pCB_CMVF209為模板，PCR擴(kuò)增合成PCR產(chǎn)物，以Stu I、Avr Π 酶切PCR產(chǎn)物，純化，備用。
[0156] 備注說(shuō)明：
[0157] GAAGGCCTGACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcggAA Cctccccttccgcatct〇
[0158] StuI Mlul Spel Apal BamHI SacII；
[0159] 所述PCR擴(kuò)增體系為： lOxbuffer 5μ! ddH20 37.5μ! dNTP 4μ1 PCB-CMVF209 1μ1
[0160] 2bORF333F ΙμL 2bAvrllR ΙμΙ Pyrobcsl Taq 0.5μ! 總體積 -------------------------------------------50μ1
[0161 ] 所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?br>[0162]
[0163] (3)以Nco I、Avr Π 酶切質(zhì)粒pCB-CMVF209,備用。
[0164] (4)采用T4-DNA連接酶試劑盒將步驟（1)、步驟(2)酶切的PCR產(chǎn)物同時(shí)與步驟(3) 所得的酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a。
[0165] (5)、在上述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)長(zhǎng)出菌落的平板內(nèi)挑選菌落再液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用Nco I、Avr II酶切鑒定和PCR鑒定，最后送測(cè)序公司測(cè)序鑒定，得到構(gòu)建正確的質(zhì)粒pCB-CMVF209-no2b 保存?zhèn)溆谩?br>[0166] 2、將抗蟲基因大蒜凝集素基因 ASMLL(NCBI ID:EU 252577)編碼區(qū)（0RF)序列插入 弱病毒載體構(gòu)建重組病毒表達(dá)載體。具體地：
[0167] (1)、設(shè)計(jì)加酶切位點(diǎn)Mlu I的正向引物ASMLLMluF: cgAcgcgt tgctgtacgaatacagc acc;加酶切位點(diǎn)BamH I的反向引物ASMLL BamR: CGggatccttacagttccaggttgaatatc。以質(zhì) 粒pMD 18-ASMLL(由NCBI庫(kù)中查得ASMLL基因序列，由基因合成公司合成，構(gòu)建成質(zhì)粒pMD 18-ASMLL;或者ASMLL基因由大蒜提取總RNA，按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書，以引物ASMLLBamR和 ASMLLMluF做RT-PCR獲得，然后按pMD18載體使用說(shuō)明書操作構(gòu)建成質(zhì)粒pMD18-ASMLL)為模 板，PCR擴(kuò)增合成PCR產(chǎn)物，以Mlu I、BamH頂每切PCR產(chǎn)物，純化，備用。
[0168] 所述PCR擴(kuò)增體系為：
[0169]
[0170] 所述PCR擴(kuò)增程序與步驟1 (1)相同。
[0171] (2)以Mlu I、BamH 頂每切質(zhì)粒pCB-CMVF209-no2b，備用。
[0172] (3)采用T4-DNA連接酶試劑盒將酶切的PCR產(chǎn)物與酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌感受態(tài)DH5a。
[0173] (4)、在上述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)長(zhǎng)出菌落的平板內(nèi)挑選菌落再液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用Mlu I、BamH I酶切鑒定和PCR鑒定，最后送測(cè)序公司測(cè)序鑒定，將構(gòu)建正確的質(zhì)粒pCB-CMVF209no2b-ASMLL 保存?zhèn)溆谩?br>[0174] 3、采用常規(guī)方法，將含抗蟲基因的重組弱病毒表達(dá)載體pCB-CMVF209no2b-ASMLL 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。
[0175] 4、質(zhì)粒農(nóng)桿菌浸潤(rùn)法將 pCB-CMVF209no2b-gene、pCB-CMVF109、pCB-CMVF309(pCB-CMVF109、pCB-CMVF309具體構(gòu)建方法見中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)2011,44( 14) :3060-3068)質(zhì)粒農(nóng)桿菌 混合浸潤(rùn)接種(公知技術(shù))4-6葉齡植物苗葉。
[0176] 5、接種苗室溫培養(yǎng)5-8天后，即可按常規(guī)苗管理。
[0177] 6、用生長(zhǎng)在接種葉以上的葉片喂食甜菜夜蛾幼蟲、斜紋夜蛾幼蟲。具體結(jié)果如下 表1和表2所述。
[0178] 實(shí)施例2、
[0179] 1、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表達(dá)載體。
[0180] (1)以CMV序列為模板設(shè)計(jì)正、反向引物。
[0181 ]加酶切位點(diǎn)Nco I的正向引物NcoIF2:CATGCcatggctgagtttgcctg;
[0182] 加酶切位點(diǎn)Stu I的反向引物2a0RFlR: gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttg。
[0183] 以質(zhì)粒pCB-CMVF209為模板，PCR擴(kuò)增合成PCR產(chǎn)物，以Nco I、Stu頂每切PCR產(chǎn)物， 純化，備用。
[0184] (2)設(shè)計(jì)加酶切位點(diǎn) Stu I、Spe I、Apa I、BamH I 的正向引物 2b0RF333F: GAAGGCCTGGACTAGTgggcccGGGATCCAACctccccttccgcatct;反向引物2bAvrIIR: Cttccgaagaaacctaggag。以質(zhì)粒pCB_CMVF209為模板，PCR擴(kuò)增合成PCR產(chǎn)物，以Stu I、Avr Π 酶切PCR產(chǎn)物，純化，備用。
[0185] (3)以Nco I、Avr Π 酶切質(zhì)粒pCB-CMVF209,備用。
[0186] (4)采用T4-DNA連接酶試劑盒將步驟（1)、步驟(2)酶切的PCR產(chǎn)物與步驟(3)所得 的酶切的PCR產(chǎn)物與酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a。
[0187] (5)、在上述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)長(zhǎng)出菌落的平板內(nèi)挑選菌落再液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用Nco I、Avr II酶切鑒定和PCR鑒定，最后送測(cè)序公司測(cè)序鑒定，將構(gòu)建正確的質(zhì)粒pCB-CMVF209-n〇2b保存?zhèn)溆谩?br>[0188] 2、將蓖麻幾丁質(zhì)酶基因 Rcc I(NCBI ID:XM002525695)編碼區(qū)（0RF)序列插入弱病 毒載體構(gòu)建重組病毒表達(dá)載體。具體地：
[0189] (1)、設(shè)計(jì)加酶切位點(diǎn)Spe I的正向引物Rcc ISpeF:gactagtatgtctaggaaaaaaggga gag;加酶切位點(diǎn)BamH I的反向引物Rcc IBamR:CGggatcc CGggatccttacagttccaggttgaata tc。以質(zhì)粒pMD18-Rcc I(由NCBI庫(kù)中查得Reel基因序列，由基因合成公司合成，構(gòu)建成質(zhì) 粒pMD 18-Rec I;或者Rec I基因可由蓖麻葉提取總RNA，按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書，以引物Rec IBamR和Rcc ISpeF做RT-PCR獲得，然后按pMD18載體使用說(shuō)明書操作構(gòu)建成質(zhì)粒pMD18-RccI，具體方案與實(shí)例1相似。）為模板，PCR擴(kuò)增合成PCR產(chǎn)物，以Spe I、BamH I酶切PCR產(chǎn) 物，純化，備用。
[0190] 所述PCR擴(kuò)增體系為：
[0191]
[0192] 所述PCR擴(kuò)增程序等同于實(shí)施例1的2(1)。
[0193] (2)以Spe I、BamH 頂每切質(zhì)粒pCB-CMVF209-no2b，備用。
[0194] (3)采用T4-DNA連接酶試劑盒將酶切的PCR產(chǎn)物與酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌感受態(tài)DH5a。
[0195] (4)、在上述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)長(zhǎng)出菌落的平板內(nèi)挑選菌落再液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用Spe I、BamH I酶切鑒定和PCR鑒定，最后送測(cè)序公司測(cè)序鑒定，將構(gòu)建正確的質(zhì)粒pCB-CMVF209no2b-RccI 保存?zhèn)溆谩?br>[0196] 3、采用常規(guī)方法，將含抗蟲基因的重組弱病毒表達(dá)載體pCB-CMVF209n〇2b-R CcI轉(zhuǎn) 化農(nóng)桿菌。
[0197] 4、質(zhì)粒農(nóng)桿菌浸潤(rùn)法將 pCB-CMVF209no2b-RccI、pCB-CMVF109、pCB-CMVF309 質(zhì)粒 農(nóng)桿菌混合，浸潤(rùn)接種4-6葉齡植物苗葉。
[0198] 5、接種苗室溫培養(yǎng)5-8天后，即可按常規(guī)苗管理。
[0199] 6、用生長(zhǎng)在接種葉以上的葉片喂食甜菜夜蛾幼蟲、斜紋夜蛾幼蟲。具體結(jié)果如下 表1和表2所述。
[0200] 實(shí)施例3、
[0201] 1、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表達(dá)載體。
[0202] (1)以CMV序列為模板設(shè)計(jì)正、反向引物。
[0203]加酶切位點(diǎn)Nco I的正向引物NcoIF2:CATGCcatggctgagtttgcctg;
[0204] 加酶切位點(diǎn)Stu I的2a0RFlR: gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttg。
[0205] 以質(zhì)粒pCB-CMVF209為模板，PCR擴(kuò)增合成PCR產(chǎn)物，以Nco I、Stu頂每切PCR產(chǎn)物， 純化，備用。
[0206] (2)設(shè)計(jì)加酶切位點(diǎn)Stu I、Mlu I、Spe I、Apa I、BamH I、Sac II的正向引物 2b0RF333F:GAAGGCCTGACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcggAACctccccttccgcatct;反向引 物 2bAvrIIR: Cttccgaagaaacctaggag。以質(zhì)粒 pCB_CMVF209 為模板，PCR 擴(kuò)增合成 PCR 產(chǎn)物，以 Stu I、Avr Π 酶切PCR產(chǎn)物，純化，備用。
[0207] (3)以Nco I、Avr Π 酶切質(zhì)粒pCB-CMVF209,備用。
[0208] (4)采用T4-DNA連接酶試劑盒將步驟（1)、步驟(2)酶切的PCR產(chǎn)物與步驟(3)所得 的酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a。
[0209] (5 )、在上述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)長(zhǎng)出菌落的平板內(nèi)挑選菌落再液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用Nco I、Avr II酶切鑒定和PCR鑒定，最后送測(cè)序公司測(cè)序鑒定，將構(gòu)建正確的質(zhì)粒pCB-CMVF209-n〇2b保存?zhèn)溆谩?br>[0210] 2、將抗蟲基因綠僵菌甲殼質(zhì)酶基因 MaARSEF(NCBI ID:XM 007827732)編碼區(qū) (0RF)序列插入弱病毒載體構(gòu)建重組病毒表達(dá)載體。具體地：
[0211] ( 1 )、設(shè)計(jì)加酶切位點(diǎn)S t u I的正向引物M a A R S E F S t u F : aaggcctatgaagctctcccttctcttc ;加酶切位點(diǎn)Mlu I 的反向引物 MaARSEFMluR: cgAcgcgtctaccacgtcttgaaatgg〇
[0212] 以質(zhì)粒pMD18-MaARSEF為模板，PCR擴(kuò)增合成PCR產(chǎn)物，以Stu I、Mlu I酶切PCR產(chǎn) 物，純化，備用。
[0213] (2)以Stu I、Mlu 頂每切質(zhì)粒pCB-CMVF209-no2b，備用。
[0214] (3)采用T4-DNA連接酶試劑盒將酶切的PCR產(chǎn)物與酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌感受態(tài)DH5a。
[0215] (4)、在上述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)長(zhǎng)出菌落的平板內(nèi)挑選菌落再液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用Stu I、Mlu I酶切鑒定和PCR鑒定，最后送測(cè)序公司測(cè)序鑒定，將構(gòu)建正確的質(zhì)粒pCB-CMVF209no2b-MaARSEF 保存?zhèn)溆谩?br>[0216] 3、采用常規(guī)方法，將含抗蟲基因的重組弱病毒表達(dá)載體pCB-CMVF209n〇2b-MaARSEF轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。
[0217] 4、質(zhì)粒農(nóng)桿菌浸潤(rùn)法將 pCB-CMVF209no2b-MaARSEF、pCB-CMVF109、pCB-CMVF309 質(zhì)粒農(nóng)桿菌混合，浸潤(rùn)接種4-6葉齡植物苗葉。
[0218] 5、接種苗室溫培養(yǎng)5-8天后，即可按常規(guī)苗管理。
[0219] 6、用生長(zhǎng)在接種葉以上的葉片喂食甜菜夜蛾幼蟲、斜紋夜蛾幼蟲。具體結(jié)果如下 表1和表2所述。
[0220] 對(duì)照例、4-6葉齡煙草植株，不接種任何液體或接種清水，同樣培養(yǎng)5-8天，作為對(duì) 照。
[0221] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0222] 實(shí)施例1所得煙草葉片、實(shí)施例2所得煙草葉片、實(shí)施例3所得煙草葉片，對(duì)照煙草 葉片，斜紋夜蛾、甜菜夜蛾分別取食上述葉片，每處理設(shè)3皿(3次重復(fù)），每皿內(nèi)放4頭大小一 致的1-2齡幼蟲，試驗(yàn)前后稱重，25°C室內(nèi)分別用各處理葉飼養(yǎng)。
[0223] 表1、斜紋夜蛾幼蟲取食72小時(shí)后增重情況(g/頭）
[0224]
[0225] 衷2、甜菜夜峨幼蟲取食72小時(shí)后增重情況（ε/頭）
[0226]
[0227] 根據(jù)上述數(shù)據(jù)的對(duì)比：
[0228] 喂食斜紋夜蛾幼蟲時(shí)，實(shí)施例1、2、3的斜紋夜蛾幼蟲的生長(zhǎng)速率比對(duì)照例的斜紋 夜蛾幼蟲生長(zhǎng)速率分別降低了51.6%、34.1 %、28.7%。
[0229] 喂食甜菜夜蛾幼蟲時(shí)，實(shí)施例1、2、3的甜菜夜蛾幼蟲的生長(zhǎng)速率比對(duì)照例的甜菜 夜蛾幼蟲生長(zhǎng)速率分別降低了34.5%、22.5%、20%。
[0230] 需要說(shuō)明的是這幾個(gè)基因不是典型的抗鱗翅目害蟲的基因，但也能發(fā)現(xiàn)其具有抗 鱗翅目害蟲的作用。
[0231]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 黃瓜花葉病毒弱毒力載體在增強(qiáng)植物抗蟲性能方面的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃瓜花葉病毒弱毒力載體在增強(qiáng)植物抗蟲性能方面的應(yīng)用， 其特征是： 所述黃瓜花葉病毒弱毒力載體的構(gòu)建方法包括如下步驟： 1) 、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表達(dá)載體： 將已構(gòu)建好的病毒CMV侵染性克隆質(zhì)粒之一 pCB-CMVF209采用酶切連接的方法改造，使 2b基因缺失，并加入酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成為弱毒力的病毒表達(dá)載體---弱病毒載體； 2) 、將抗蟲基因編碼區(qū)（ORF)序列插入步驟1)所得的弱病毒載體構(gòu)建重組弱病毒表達(dá) 載體； 構(gòu)建所得的含抗蟲基因編碼區(qū)序列的重組弱病毒表達(dá)載體用于增強(qiáng)植物對(duì)害蟲的抗 性。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃瓜花葉病毒弱毒力載體在增強(qiáng)植物抗蟲性能方面的應(yīng)用， 其特征是： 所述步驟1)中的酶切位點(diǎn)為：Stu I、Mlu I、Spe I、Apa I、BamH I、Sac II。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的黃瓜花葉病毒弱毒力載體在增強(qiáng)植物抗蟲性能方面的應(yīng) 用，其特征是： 所述步驟1)具體包括如下步驟： ① 、以CMV序列為模板，設(shè)計(jì)加酶切位點(diǎn)的正、反向引物： 加酶切位點(diǎn)Nco I的正向引物NcoIF2:CATGCcatggctgagtttgcctg; 加酶切位點(diǎn)Stu I的反向引物為以下任一： gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttgg; gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttg； 以質(zhì)粒PCB-CMVF209為模板，PCR擴(kuò)增合成PCR產(chǎn)物，以Nco I、Stu I酶切PCR產(chǎn)物，純化； ② 、選擇Stu I以及Mlu I、Spe I、Apa I、BamH I中至少1個(gè)酶切位點(diǎn)加入正向引物的 5'，設(shè)計(jì)在5'加入Avr Π 酶切位點(diǎn)的反向引物； 以質(zhì)粒PCB-CMVF209為模板，PCR擴(kuò)增合成PCR產(chǎn)物，以Stu I、Avr Π 酶切PCR產(chǎn)物，純 化； ③ 、以Nco I、Avr II酶切質(zhì)粒pCB-CMVF209; ④ 、采用T4-DNA連接酶試劑盒將酶切的PCR產(chǎn)物與酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 感受態(tài)DH5a; ⑤ 、對(duì)上述轉(zhuǎn)化得到的菌落再液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用Nco I、Avr II酶切鑒定和/或 PCR鑒定，得到構(gòu)建正確的質(zhì)粒pCB-CMVF209-no2b。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的黃瓜花葉病毒弱毒力載體在增強(qiáng)植物抗蟲性能方面的應(yīng)用， 其特征是： 所述步驟②中的正向引物：GAAGGCCTGACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcggAA Cctccccttccgcatct (為2bORF333F);或由 GA AGGCCT與序列 GACGCGTGACTAGTgggcccGGGATCCccgcgg中的至少1個(gè)酶切位點(diǎn)的序列與序列AA Cctccccttccgcatct 組成； 所述步驟②中的反向引物為AvrIIR:Cttccgaagaaacctaggag。6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的黃瓜花葉病毒弱毒力載體在增強(qiáng)植物抗蟲性能方面的應(yīng) 用，其特征是： 所述步驟2)具體包括如下步驟： ① 、以抗蟲基因編碼區(qū)（ORF)序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)加酶切位點(diǎn)Stu I或Mlu I或Spe I或Apa I或BamH I的正向引物，加酶切位點(diǎn)Mlu I或Spe I或Apa I或BamH I或Sac II的反向引物； 以含目的基因的質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增目的基因，純化，以正、反向引物所加酶切位點(diǎn)的酶酶 切PCR產(chǎn)物，純化； ② 、以與上述步驟①相同的酶酶切質(zhì)粒pCB-CMVF209-no2b; ③ 、采用T4-DNA連接酶試劑盒將酶切的PCR產(chǎn)物與酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 感受態(tài)DH5a; ④ 、從上述轉(zhuǎn)化得到的菌落中挑選若干菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用與上述①相 同的酶酶切鑒定，并進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序鑒定，得到構(gòu)建正確的質(zhì)粒pCB-CMVF209n 〇2b-gene 〇
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK105907781SQ201610257242
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年4月22日
【發(fā)明人】竺錫武, 吳娟, 王強(qiáng), 劉津, 李曉超, 王青, 陳亞妮
【申請(qǐng)人】湖南人文科技學(xué)院