一種紅鈴蟲抗性基因aq47檢測引物組、試劑盒及使用方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于檢測技術領域，具體而言，本發(fā)明設及一種紅鈴蟲抗性基因 AQ47檢測 引物組、試劑盒及使用方法。
【背景技術】
[0002] 中國是世界上最大的棉花生產(chǎn)國，自1997年種植轉化基因棉花W來，現(xiàn)全國年種 植面積已達550萬hm2,在全世界居第二位，僅次于印度。根據(jù)中棉所、全國優(yōu)質棉科技服 務項目組2007年對全國16個產(chǎn)棉省(市區(qū)）的調查結果，全國棉花播種品種471個，其中轉基 因抗蟲棉157個，占全部品種的33.3%，其播種面積占總播種面積的66.1%。但值得注意的 是，在運些轉基因棉花品種中，除少數(shù)品種外為轉化ylA+CpTI雙價抗蟲棉外，絕大多數(shù)品種 都為轉單價Bt基因棉。而且在157個轉基因抗蟲棉品種中，除了其中4個為美國引進品種，其 他幾乎所有品種的基因來源高度集中，基本都是CrylA基因。按照科學規(guī)律，單價抗蟲棉在 大田生產(chǎn)上一般只能安全應用8~10年，而轉基因抗蟲棉在中國種植時間已達10多年，紅鈴 蟲對化基因產(chǎn)生抗性的風險已越來越大。因此鑒定田間祀標昆蟲對化棉花產(chǎn)生的抗性基因 類型、監(jiān)測其抗性基因頻率的變化，有助于及時掌握田間種群對化棉化的抗性發(fā)展情況，研 究與制定合理的抗性治理措施，W延緩害蟲對化棉花抗性的產(chǎn)生。

【發(fā)明內容】

[0003] 紅鈴蟲對化蛋白產(chǎn)生抗性目前已知的主要表現(xiàn)為巧粘蛋白基因突變。從基因 BANK 中可W查知，紅鈴蟲的突變類型已達到了23種(見表1)。近年來，我們從長江流域田間種群 中篩選并純化出一個紅鈴蟲Cry 1 Ac抗性品系，即AQ47品系（cDNA : KU2 54194 ; gDNA : KU254196)，該抗性品系由巧粘蛋白基因突變導致紅鈴蟲對化ylAc蛋白不敏感。具體突變情 況如下：與敏感品系紅鈴蟲(AS)(登陸號:AY198374.1)相比，AQ47品系紅鈴蟲巧粘蛋白的基 因組序列缺失314個堿基，缺失部分包含外顯子區(qū)域，導致其cDNA序列對應區(qū)域，即第4620 ~第4826的207個堿基缺失，蛋白序列缺失69個氨基酸殘基，蛋白跨膜結構缺失，無跨膜區(qū) 域(參見附圖1)。經(jīng)基因序列比對表明，該突變基因與基因 BANK中已注冊的紅鈴蟲所有巧粘 蛋白基因均不相同，故其為一種新的抗性基因。
[0004] 表1基因 BANK中已注冊的紅鈴蟲巧粘蛋白抗性基因種類
[0005]

[0006] ~為檢測紅鈴蟲田間種群中存在的該突變體，我們開展了該基因的分子檢測技術研胃 究。根據(jù)AQ47品系與敏感品系(AS)巧粘蛋白基因組序列的差異，我們設計出一對特異性引 物用于檢測抗性基因
[0007] (AQ47F：TACTCTCTTCCTCACCTCCTGA,AQ47R：CGAGCCGTATTTCGTCATC)〇
[000引用該引物對AQ47抗性純合個體（1化g/ml化ylAc存活個體)進行PCR擴增，結果表 明，所有AQ47抗性個體(包括雜合子與純合子)均能擴出1015bp的目標片段，而AS敏感品系 均不能擴出片段(擴增條件見附圖2)。
[0009] 同時，我們還設計了另外一對特異性引物(AQ47F2:5'GTCCAAGGTGTGTTGAACCA 3'， AQ47R:5'CGAGCCGTATTTCGTCATC 3'），用于區(qū)別在含有AQ47抗性基因個體的條件下，該個體 是雜合子還是純合子。即用第一對引物(AQ47F，AQ47R)檢測出紅鈴蟲田間種群中含有抗性 基因的個體后，再用特異性引物二(AQ47F2，AQ47R)對該田間個體的基因組DNA進行擴增，雜 合子個體均能擴出l〇〇3bp的目標片段，而抗性純合個體則不能擴出條帶。
[0010] 該結果表明，所設計的兩對引物能很好地檢測出AQ47品系中抗性基因的存在，并 確認它們的存在狀態(tài)(純合還是雜合），故可用于生產(chǎn)實踐(具體方法附后）。參見附圖3
[0011] 所述AQ47抗性基因的分子檢測方法可用于檢測紅鈴蟲田間種群中具有上述突變 類型的抗性基因個體。
【附圖說明】
[0012] 圖1是AQ47品系抗性基因結構及其與敏感品系序列對比圖；
[OOK]圖2是AQ47基因分子檢測電泳圖；
[0014] 圖3是AQ47雜合子分子檢測電泳圖。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，W使本領域的技術人員可W 更好的理解本發(fā)明并能予W實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。
[0016] 1、實驗試劑與儀器
[0017]實驗試劑:dm提取試劑盒購于北京天根生物科技公司。LATaq DNA聚合酶與dNTP 均購于寶生物工程(TaKaRa)大連有限公司。
[0018] 實驗儀器:普通PCR儀購于東勝創(chuàng)新科技有限公司，凝膠成像儀購于美國伯樂Bio- Rad公司， 電泳儀購于北京六一儀器廠
[0019] 2、特異引物
[0020] 引物一：用于檢測紅鈴蟲田間種群中是否存在已知類型的抗性基因突變(包含抗 性純合子和抗性雜合子）
[0021] 上游引物 AQ47F:TACTCTCTTCCTCACCTCCTGA，
[0022] 下游引物AQ47R: CGAGCCGTATTTCGTCATC
[0023] 引物二:用于確認檢測到的抗性突變個體是雜合狀態(tài)還是純合狀態(tài)
[0024] 上游引物AQ47F2:5'GTCCAAGGTGTGTTGAACCA 3'，
[0025] 下游引物AQ47R:5'CGAGCCGTATTTCGTCATC 3'
[0026] 3、實驗條件
[0027] 1)基因組DNA樣品制備
[0028] 樣品來源：田間采集到的紅鈴蟲個體。為了檢測出單頭紅鈴蟲的巧粘蛋白基因是 否含有AQ47抗性基因及其基因型，我們采用單頭提取的方法，即單頭紅鈴蟲提取的基因組 DNA為一個檢測樣本。紅鈴蟲基因組DNA的提取使用天根公司（Tiangen Biotech Co.，Ltd) 生產(chǎn)的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離屯、柱型）。實驗操作具體步驟按照試劑盒 說明書進行。
[00巧]2)PCR檢測
[0030] 引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。W提取的基因組DNA為模板，用設計 的引物進行PCR擴增。用引物(AQ47F，AQ47R)和(AQ47F2，AQ47R)進行PCR反應，其擴增的參數(shù) 如下:94°C預變性2min;然后為35個循環(huán)，循環(huán)條件為:94°C變性30s，接著55°C退火30s，再 72 °C延伸Imin;最后72 °C保溫lOmin. PCR反應體系為25化，如下所示：
[0031] 取出PCR反應所需試劑及保存的DNA樣品于冰上解凍，Taq酶應現(xiàn)用現(xiàn)取，且用完后 需馬上放回-20°C保存，從而延緩酶活性的損失。反應液中各組分的比例如下：
[0032]
[0033] PCR反應結束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像儀拍攝電泳圖， 根據(jù)特異引物擴增的目標條帶判斷是否含有AQ47品系的抗性等位基因。
[0034] 4、結果與判斷
[0035] 上述兩對引物可用W檢測紅鈴蟲田間種群個體是否含有AQ47突變基因及其基因 型。首先用引物一 (AQ47F/AQ47R)對紅鈴蟲田間種群個體的基因組DNA進行擴增，如擴增產(chǎn) 物中能檢測出l〇15bp的目標片段，表明該個體為含AQ47突變基因的抗性個體，而未檢測出 該目標片段，則表明該個體中不含AQ47抗性基因。然后，將上述檢測含有AQ47抗性基因的田 間個體基因組DNA用引物二(AQ47F2/AQ47R)再次擴增，如擴增產(chǎn)物中能檢測出1003bp的目 標片段，表明該個體為含AQ47突變基因的雜合個體;如未檢測出該目標片段，則為含AQ47突 變基因的純合個體。
[0036] AQ47抗性基因檢測的兩對引物，上游引物不同，下游引物是相同的，可W少合成一 條引物。
[0037] W上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，本發(fā)明的保護范 圍不限于此。本技術領域的技術人員在本發(fā)明基礎上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明 的保護范圍之內。本發(fā)明的保護范圍W權利要求書為準。
【主權項】
1. 一種紅鈴蟲抗性基因 AQ47檢測引物組，其特征在于，包括下述引物：2. -種紅鈴蟲抗性基因 AQ47檢測試劑盒，其特征在于，包括：由DNA提取液，PCR反應液， 標準陽性模板，陰性質控標準品，權利要求1所述引物組。3. 根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述反應液包括LATaq酶、10 X LA Taq緩 沖液(Mg2+Plus)、dNTPs和無菌雙蒸水。4. 權利要求2所述檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，包括下述步驟： 1) 基因組DNA樣品制備； 2. PCR檢測； 其中所述試劑盒包括DNA提取液，PCR反應液，標準陽性模板，陰性質控標準品，引物組。5. 根據(jù)權利要求4所述的使用方法，其特征在于，包括下述步驟： 1) 基因組DNA樣品制備 樣品來源：田間采集到的紅鈴蟲個體，采用單頭提取的方法，即單頭紅鈴蟲提取的基因 組DNA為一個檢測樣本，紅鈴蟲基因組DNA的提取使用天根公司（Tiangen Biotech Co.， Ltd)生產(chǎn)的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型），實驗操作具體步驟按照試 劑盒說明書進行； 2. PCR檢測 引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，以提取的基因組DNA為模板，用設計的引 物進行PCR擴增，用引物(AQ47F，AQ47R)和(AQ47F2，AQ47R)進行PCR反應，其擴增的參數(shù)如 下:94°C預變性2min;然后為35個循環(huán)，循環(huán)條件為:94°C變性30s，接著55 °C退火30s，再72 °C延伸lmin;最后72 °C保溫lOmin. PCR反應體系為25yL，如下所示： 取出PCR反應所需試劑及保存的DNA樣品于冰上解凍，Taq酶應現(xiàn)用現(xiàn)取，且用完后需馬 上放回-20°C保存，從而延緩酶活性的損失，反應液中各組分的比例如下：PCR反應結束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像儀拍攝電泳圖，根據(jù) 特異引物擴增的目標條帶判斷是否含有AQ47品系的抗性等位基因。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種紅鈴蟲抗性基因AQ47檢測引物組、試劑盒及使用方法，由DNA提取液，PCR反應液，標準陽性模板，紅鈴蟲基因特異性引物、陰性質控標準品組成?？捎糜跈z測紅鈴蟲田間種群中具有上述突變類型的抗性基因個體。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105671194
【申請?zhí)枴緾N201610227795
【發(fā)明人】王玲, 萬鵬, 吳孔明, 王金濤, 叢勝波, 許冬, 黃民松
【申請人】湖北省農(nóng)業(yè)科學院植保土肥研究所
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年4月13日