本發(fā)明屬于基因檢測領域，更具體地，是一種用于基因甲基化檢測的引物和探針、采樣方法、試劑盒。

背景技術：

dna甲基化水平和模式的改變是腫瘤發(fā)生的一個重要因素?；騿幼痈呒谆院蠡虮磉_就會減弱甚至關閉，相當于基因的開關。惡性腫瘤中基因的開關多由dna甲基化調控，幾乎所有腫瘤中都會伴隨dna甲基化的異常改變，且常常高甲基化與低甲基化并存。如腫瘤細胞中抑癌基因啟動子通常為高甲基化，導致抑癌基因表達受抑制喪失抑癌功能，從而促進癌癥的發(fā)生。低甲基化通常是整個基因組低甲基化或原癌基因啟動子低甲基化，前者導致染色體結構穩(wěn)定性降低，促進癌變發(fā)生，后者則會激活原癌基因，誘導細胞癌變。

sept9基因的v2轉錄本啟動子甲基化已被證實與crc(結直腸癌)的發(fā)生密切相關，甲基化導致基因轉錄受到抑制，從而影響基因的正常表達，并使其抑癌功能喪失，影響囊泡運輸、絲狀結構形成、細胞分裂和凋亡等功能。大量臨床研究證實，不同于正常結直腸組織，crc組織中可檢出明顯異常的sept9基因甲基化，sept9基因甲基化是crc早期發(fā)生、發(fā)展過程中的特異性分子標記物。sept9甲基化檢測可檢出70％以上的早期結直腸患者，可大大降低結直腸癌患者的死亡率。2016年4月美國fda(美國食品藥物管理局)已經(jīng)批準該項檢查應用于臨床。

dna甲基化的檢測大體分為兩個步驟：1.待檢測樣品的前期處理；2.目標序列的定位和甲基化狀態(tài)的量化。dna甲基化預處理方式主要分為三種：1.限制性內切酶法；2.蛋白或抗體富集；3重亞硫酸鹽轉化法。以重亞硫酸鹽預處理法應用最為廣泛。dna經(jīng)亞硫酸氫鈉預處理后，非甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶，對其進行pcr擴增的話進一步將模板上的尿嘧啶轉化為胸腺嘧啶。而甲基化的胞嘧啶不受亞硫酸氫鈉影響，保持不變。這樣dna片段甲基化狀態(tài)的差異轉化為堿基序列的差異。通過區(qū)分后者就可間接判斷樣品中的胞嘧啶是否甲基化。

目前檢測特異性位點的甲基化的方法主要有以下幾種：

(1)結合重亞硫酸鹽的直接測序法(bisulfitesequencing,bsp)

該方法首先用重亞硫酸鹽使dna中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變；用pcr擴增所需片段,則尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶，最后，對pcr產(chǎn)物進行克隆測序并且與未經(jīng)處理的序列比較,判斷是否cpg位點發(fā)生甲基化。此方法是精確度很高，能明確目的片段中每一個cpg位點的甲基化狀態(tài)，但需要大量的克隆測序，不易大批量操作，過程較為繁瑣、昂貴。

(2)甲基化特異性的pcr(methylation-specificpcr,ms-pcr)

該方法先將dna重亞硫酸鹽處理，隨后進行引物特異性的pcr。其設計兩對引物，分別與重亞硫酸鹽處理后的序列互補配對，即一對結合處理后的甲基化dna鏈，另一對結合處理后的非甲基化dna鏈。電泳檢測ms-pcr擴增產(chǎn)物，如果用針對處理后甲基化dna鏈的引物能擴增出片段，則說明該被檢測的位點存在甲基化；反之亦然。這種方法引物設計至關重要，設計不好容易有假陽性；只能做定性研究，即只能明確是否存在甲基化。且需電泳分離檢測，容易污染。

(3)甲基化熒光法(methylight)

結合重亞硫酸鹽處理待測dna片段，設計一個能與待測位點區(qū)互補的探針，探針的5′端連接報告熒光，3′端連接淬滅熒光，隨后行實時定量pcr。如果探針能夠與dna雜交，則在pcr用引物延伸時，taqdna聚合酶5′到3′端的外切酶活性會將探針序列上5′端的報告熒光切下，淬滅熒光不再能對報告熒光進行抑制，這樣報告熒光發(fā)光，測定每個循環(huán)報告熒光的強度即可得到該位點的甲基化情況及水平。本方法高效，迅速，具備可重復、所需樣本量少、不需要電泳分離的特點。缺點是測定每個位點需要一對引物和標有熒光素的探針，探針無法檢出雜合甲基化，只適用于少數(shù)位點大量樣本篩查。

(4)甲基化敏感的高分辨率熔解曲線分析(methylation-sensitivehigh-resolutionmelting,ms-hrm)

亞硫酸氫鹽處理后，甲基化與未甲基化dna會存在序列差異，這種差異可通過熔解曲線分析來發(fā)現(xiàn)，因為甲基化dna含有更多的gc，相對更難熔解。根據(jù)熔解溫度及峰型的變化，可輕易區(qū)分完全甲基化、完全非甲基化或雜合甲基化。高分辨率熔解(hrm)技術可檢出極微小的差別。

使用這種方法進行甲基化分析僅需一對引物，相比以往的方法更加快捷、簡便和精確。不過對儀器的要求頗高，需要帶hrm模塊的熒光定量pcr儀。利用ms-hrm技術進行甲基化檢測只能對檢測片段整體甲基化情況進行分析，并不能明確每個cpg位點的甲基化狀態(tài)。并且該方法使用的是染料，只能檢測一個熒光信號通道。

(5)基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜。

epityper^tmdna甲基化分析技術結合了堿基特異性酶切反應和maldi-tof檢測原理，可實現(xiàn)多重cpg的分析檢測。massarray甲基化檢測無需任何熒光標記，每個反應覆蓋長達500bp的多個cpg位點，且靈敏度高，可檢測低至5％的甲基化水平，但儀器較為昂貴，不適合臨床應用。

臨床應用較多的檢測基因甲基化的方法主要為甲基化熒光法，但這種方法的引物探針的設計都是針對單鏈，而基因組的序列經(jīng)過重亞硫酸鹽轉化后，正鏈和反鏈已經(jīng)不再相互配對，基本上相當于不同的兩條鏈。加入同樣的濃度的樣本，正反鏈同時檢測可以比只進行單鏈檢測的樣本量增加一倍。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個極為復雜的過程，腫瘤細胞具有明顯的異質性特征。不同的腫瘤細胞處于不同的發(fā)育階段，所以正反鏈的甲基化程度不一定一致。只檢測正鏈或者只檢測反鏈會導致檢測的靈敏度不足。特別是dna含量少的樣本如血漿樣本。

因此分別針對重亞硫酸鹽轉化后的正鏈和反鏈設計引物，同時進行檢測，更全面有效地檢測基因的甲基化狀態(tài)，提高檢測的靈敏度。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要解決的技術問題是提供用于甲基化基因檢測的引物、探針及方法，本發(fā)明具有特異性強、靈敏度高、受污染小、操作簡單快速、安全性等優(yōu)點，檢測結果具有較好的準確性和重復性、能有效提高基因甲基化檢測情況，適用于臨床。

一種用于基因甲基化檢測的引物和探針，其中，引物包括特異性甲基化正鏈引物和特異性甲基化反鏈引物；特異性甲基化正鏈引物包括正鏈正向引物和正鏈反向引物，特異性甲基化反鏈引物包括反鏈正向引物和反鏈反向引物；

探針包括特異性甲基化正鏈探針和特異性甲基化反鏈探針；

具體為：

正鏈正向引物：gattcgttgtttattagttattatgt

正鏈反向引物：aaataatcccatccaacta

特異性甲基化正鏈探針：ttaaccgcgaaatccgac

反鏈正向引物：tagtaatttattttgttagtttagt

反鏈反向引物：catcatatcccaccaac

特異性甲基化反鏈探針：aattcgcgtataccgtcat。

進一步說，本發(fā)明所述的一種用于基因甲基化檢測的引物和探針，還設有正鏈非甲基化封閉引物和反鏈非甲基化封閉引物；具體為：

正鏈非甲基化封閉引物：gttattatgttggattttgtggttaatgtgtag

反鏈非甲基化封閉引物：catcatatcaaaccccacaatcaacacacaac。

進一步說，在本發(fā)明中，正鏈非甲基化封閉引物和反鏈非甲基化封閉引物用磷酸化、間臂、mgb或pna中的一種修飾或多種修飾。

進一步說，在本發(fā)明中，探針為taqman探針；熒光標記可以為fam、vic/joe、ned/tamra/cy3、rox/texasred或cy5中的一種或多種；淬滅基團可以為tamra、bhq1或eclipse中的一種或多種。

采用本發(fā)明所述用于基因甲基化檢測的引物和探針的用途，用于檢測結直腸癌的sept9基因甲基化的正鏈和反鏈相關序列。

采用本發(fā)明所述用于基因甲基化的檢測方法，按如下步驟進行：獲取待測樣本；對待測樣本進行重亞硫酸鹽處理；將經(jīng)過重亞硫酸鹽處理后的樣本，使用熒光定量pcr法同時檢測基因甲基化的正反鏈，其中包括特異性甲基化正鏈引物和特異性甲基化反鏈引物。

采用本發(fā)明所述用于基因甲基化檢測的引物和探針的試劑盒，包含一種或者多種內參基因序列；內參基因序列為：

actb正向引物：taatttgtgtgtgtgttttggggtttg

actb反向引物：cctccacccaattcaaacaacaccaa

actb探針：aaatacacacaaacaccca

alu正向引物：ggttaggtatagtggtttatatttgtaattttagta

alu反向引物：attaactaaactaatcttaaactcctaacctca

alu探針：cctaccttaacctccc

gapdh正向引物：ttggaaaaggatatttttattgtaaaa

gapdh反向引物：aattccccaaaacacccaaacaccca

gapdh探針：ctaacctttaaaatcaaat。

本發(fā)明技術方案帶來的有益效果

甲基化熒光法和其他的甲基化基因檢測方法相比具有操作簡單，實驗時間短。閉管反應，減少污染的機率，結果判斷明確客觀，適用于臨床。而本發(fā)明在甲基化熒光法的基礎上同時檢測甲基化的正反鏈，更全面有效地檢測基因的甲基化狀態(tài)，提高了檢測的靈敏度，特異適用于dna含量少的樣本如血漿、血清類樣本的檢測

附圖說明

圖1是sept9基因甲基化雙鏈檢測和單鏈檢測分析性能比較。

圖2是sept9基因甲基化雙鏈檢測和單鏈檢測熒光曲線圖。

具體實施方式

現(xiàn)結合附圖詳細說明本發(fā)明的技術細節(jié)。

用于基因甲基化檢測的引物和探針，引物包括特異性甲基化正鏈引物和特異性甲基化反鏈引物；特異性甲基化正鏈引物包括正鏈正向引物，一條選自a組和正鏈反向引物，一條選自b組，特異性甲基化反鏈引物包括反鏈正向引物，一條選自c組和反鏈反向引物，一條選自d組；

探針包括特異性甲基化正鏈探針，一條選自e組和特異性甲基化反鏈探針，一條選自f組；

具體為：

a組:正鏈正向引物：

gattcgttgtttattagttattatgt

ttcattcagctgagccaggg

gaaggtgggtgttgggtt

b組:正鏈反向引物：

aaataatcccatccaacta

gggcagcggcgaggaa

cccgtcccgcgccaaa

e組:特異性甲基化正鏈探針：

ttaaccgcgaaatccgac

tccggcggctagctctgcac

tcgcggacgtgttggaga

c組:反鏈正向引物：

tagtaatttattttgttagtttagt

tatttagttgcgcgttgatc

agagttagtcgtcggaggag

d組:反鏈反向引物：

catcatatcccaccaac

ctcctccgacgactaactct

atacgaatacgaaaacctaatc

f組:特異性甲基化反鏈探針：

aattcgcgtataccgtcat

gtagcgggtcgcgcggagggt

ttttttcgcgcgttgcgttttc。

進一步說，設有正鏈非甲基化封閉引物，一條選自g組和反鏈非甲基化封閉引物，一條選自h組；具體為：

g組:正鏈非甲基化封閉引物：

gttattatgttggattttgtggttaatgtgtag

gagttagggggtttaggggtttttttggtggtt

ggttgttgcggtcgcggacgtgttggagaggattt

h組:反鏈非甲基化封閉引物：

catcatatcaaaccccacaatcaacacacaac

gttgattgtggggtttgatatgatggttggtgggta

gaggagtttttaggttttttggtttagttgaatga。

進一步說，正鏈非甲基化封閉引物和反鏈非甲基化封閉引物用磷酸化、間臂、mgb或pna中的一種修飾或多種修飾。

進一步說，探針為taqman探針；所述的熒光標記可以為fam、vic/joe、ned/tamra/cy3、rox/texasred或cy5中的一種或多種；淬滅基團可以為tamra、bhq1或eclipse中的一種或多種。

進一步說，用于檢測結直腸癌的sept9基因甲基化的正鏈和反鏈相關序列。

進一步說，按如下步驟進行：獲取待測樣本；對待測樣本進行重亞硫酸鹽處理；將經(jīng)過重亞硫酸鹽處理后的樣本，使用熒光定量pcr法同時檢測基因甲基化的正反鏈，其中包括特異性甲基化正鏈引物和特異性甲基化反鏈引物。

進一步說，包含一種或者多種內參基因；所述內參基因為actb,alu,gapdh等管家基因中的一種或者多種；內參基因序列為：

actb正向引物：taatttgtgtgtgtgttttggggtttg

actb反向引物：cctccacccaattcaaacaacaccaa

actb探針：aaatacacacaaacaccca

alu正向引物：ggttaggtatagtggtttatatttgtaattttagta

alu反向引物：attaactaaactaatcttaaactcctaacctca

alu探針：cctaccttaacctccc

gapdh正向引物：ttggaaaaggatatttttattgtaaaa

gapdh反向引物：aattccccaaaacacccaaacaccca

gapdh探針：ctaacctttaaaatcaaat。

實施例1

重亞硫酸鹽處理后胞嘧啶轉化為尿嘧啶，5-甲基胞嘧啶(5-mc)保持不變；再經(jīng)pcr擴增，u轉化為胸腺嘧啶(t),而5-mc重新恢復為c。研究發(fā)現(xiàn)sept9基因的v2啟動子區(qū)：在結直腸癌的組織樣本中，該區(qū)域內的堿基序列甲基化水平最高；而在正常人群或患有其它疾病的人群中，該區(qū)域內的堿基序列甲基化水平最低。因此，檢測該區(qū)域內dna的甲基化水平能夠有效地進行結直腸癌的診斷。

sept9dna的v2啟動子區(qū)的正鏈核苷酸序列如下所示：

gacccgctgcccaccagccatcatgtcggaccccgcggtcaacgcgcagctggatgggatcattt。

其互補鏈(反鏈)的核苷酸序列如下所示：

aaatgatcccatccagctgcgcgttgaccgcggggtccgacatgatggctggtgggcagcgggtc。

全甲基化的樣本正鏈重亞硫酸鹽轉化后的核苷酸序列如下所示：

gattcgttgtttattagttattatgtcggatttcgcggttaacgcgtagttggatgggattattt。全甲基化的樣本互補鏈(反鏈)重亞硫酸鹽轉化后的核苷酸序列如下所示：

aaatgattttatttagttgcgcgttgatcgcggggttcgatatgatggttggtgggtagcgggtc

全甲基化樣本重亞硫酸鹽轉化后的正鏈核苷酸序列和其互補鏈(反鏈)的核苷酸序列并不是完全互補配對的，有44.6％的堿基序列不是互補配對的。具體如下所示，“|”標示的是可以互補配對，“.”標示的是不可以互補配對的。

gattcgttgtttattagttattatgtcggatttcgcggttaacgcgtagttggatgggattattt

||..||.|....|..|...||.||.|||.|...||||.|.||||||.|..|..||...||.||||

ctgggcgatgggtggttggtagtatagcttggggcgctagttgcgcgttgatttattttagtaaa

因此針對重亞硫酸鹽轉化后的正反鏈同時設計引物，探針，封閉引物；同時對兩條鏈進行檢測，可以更全面有效地檢測基因的甲基化狀態(tài)，提高檢測的靈敏度。在對經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的sept9dna進行pcr擴增的退火過程中，封閉引物優(yōu)先于引物對和探針特異性結合到未甲基化的sept9dna上，并阻止引物對，探針與未甲基化的sept9dna結合的核苷酸序列。

1、采用的探針和引物(引物探針跟權力要求一樣進行更改)

sept9的引物探針序列：

正鏈正向引物：gattcgttgtttattagttattatgt

正鏈反向引物：aaataatcccatccaacta

正鏈探針：ttaaccgcgaaatccgac

正鏈封閉引物：gttattatgttggattttgtggttaatgtgtag

反鏈正向引物：gtagtagttagtttagtatttatttt

反鏈反向引物：cccaccaaccatcatat

反鏈探針：aattcgcgtataccgtcat

反鏈封閉引物：catcatatcaaaccccacaatcaacacacaac

封閉引物可以用磷酸化，間臂，mgb,pna等一種修飾或多種修飾。

探針為taqman探針，熒光標記可以為fam，vic/joe，ned/tamra/cy3，rox/texasred和cy5中的一種或多種。淬滅基團可以為tamra，bhq1，eclipse中的一種或多種。

2、模板dna的制備：甲基化人類基因組dna，非甲基化人類基因組dna。

3、pcr檢測體系：共配制兩個熒光pcr體系，其中第一個反應體系只使用正鏈引物、探針及封閉引物；第二個反應體系同時使用正反鏈引物、探針及封閉引物。

30ulpcr反應體系中包含：1*probepremix、septin9基因引物各0.5μmol、septin9基因熒光探針各0.2μmol、septin9基因封閉引物1μmol和5ul模板dna，其他用水補充。

配置好pcr反應體系，將二倍稀釋的20pg/ul～1.25pg/ul的甲基化人類基因組dna、非甲基化人類基因組dna和無模板對照加入pcr管中進行檢測。

pcr擴增反應的具體過程為：92～97℃預變性5～35分鐘，再進行聚合酶鏈式反應擴增階段，92～97℃變性10～30s，50～65℃退火10～30s，并進行35～55個循環(huán)。

4、結果分析：對無模板對照(ntc)的擴增曲線進行分析，septin9應無擴增信號，說明實驗無污染，可以繼續(xù)分析。

5、結果

圖1是sept9基因單鏈檢測和雙鏈檢測的pcr體系檢測不同濃度的完全甲基化的基因組dna樣本，同一濃度重復檢測12次。參見圖1顯示的結果，雙鏈同時檢測的靈敏度提高，對于濃度為1.25pg/ul的樣本提高了100％的檢測重復率。

圖2是sept9基因單鏈檢測和雙鏈檢測的pcr體系檢測同樣樣本熒光曲線圖。由圖2可知同樣的樣本，雙鏈同時檢測比單鏈檢測的pcr熒光強度高，ct值提前。

上述的實驗結果表明，同時對正反鏈進行擴增，能夠有效提高sept9甲基化基因檢測情況。

實施例2

甲基化sept9基因檢測試劑盒在結直腸癌樣本檢測中的應用

sept9基因甲基化是crc早期發(fā)生、發(fā)展過程中的特異性分子標記物。sept9甲基化檢測可檢出70％以上的早期結直腸患者。采用本發(fā)明中對重亞硫酸鹽轉化后的sept9基因正反鏈同時進行擴增，可以開發(fā)出針對sept9基因甲基化檢測的試劑盒，可以快速，靈敏地檢測樣本中sept9基因的甲基化狀態(tài)。在試劑盒中還可以加入actb基因等內對照，用于監(jiān)控檢測結果。

1、sept9的引物探針序列：(引物探針跟權力要求一樣進行更改)

正鏈正向引物：gattcgttgtttattagttattatgt

正鏈反向引物：aaataatcccatccaacta

正鏈探針：ttaaccgcgaaatccgac

正鏈block：gttattatgttggattttgtggttaatgtgtag

反鏈正向引物：gtagtagttagtttagtatttatttt

反鏈反向引物：cccaccaaccatcatat

反鏈探針：aattcgcgtataccgtcat

反鏈block：catcatatcaaaccccacaatcaacacacaac

block可以用磷酸化，間臂，mgb,pna等一種修飾或多種修飾。

探針為taqman探針，熒光標記可以為fam，vic/joe，ned/tamra/cy3，rox/texasred和cy5中的一種或多種。淬滅基團可以為tamra，bhq1，eclipse中的一種或多種。

2、內參引物和探針序列

actb正向引物：taatttgtgtgtgtgttttggggtttg

actb反向引物：cctccacccaattcaaacaacaccaa

actb探針：aaatacacacaaacaccca

alu正向引物：ggttaggtatagtggtttatatttgtaattttagta

alu反向引物：attaactaaactaatcttaaactcctaacctca

alu探針：cctaccttaacctccc

gapdh正向引物：ttggaaaaggatatttttattgtaaaa

gapdh反向引物：aattccccaaaacacccaaacaccca

gapdh探針：ctaacctttaaaatcaaat

內參基因為actb,alu,gapdh等管家基因中的一種或者多種。

3、樣本：待檢血漿樣本、陽性質控品、陰性質控品。所述陽性質控品全甲基化人類基因組dna，所述陰性質控品為非甲基化人類基因組dna。

4、儀器：abi7500、nanodrop2000、高速離心機、低速離心機、恒溫干浴器、漩渦震蕩儀、冰箱。

5、試劑:游離dna提取試劑盒(蘇州海貍)、重亞硫酸鹽轉化試劑盒(zymo)、probepremix(takara)、純化水。

6、游離dna提?。菏褂锰K州海貍提取試劑盒。詳細步驟見該產(chǎn)品說明書。

7、重亞硫酸鹽轉化：使用zymo重亞硫酸鹽轉化試劑盒。詳細步驟見該產(chǎn)品說明書。

8、pcr反應體系：

30ulpcr反應體系中包含：1*probepremix、septin9基因正反鏈上下游引物各0.5μmol、septin9基因正反鏈熒光探針各0.2μmol、septin9基因正反鏈封閉引物1μmol、內參上下游引物、熒光探針各0.3μmol和5ul模板dna。配置好pcr反應體系，將待測dna樣品、陰性質控品、陽性質控品和無模板對照加入pcr管中進行檢測。

9、pcr擴增反應的具體過程為：92～97℃預變性5～35分鐘，再進行聚合酶鏈式反應擴增階段，92～97℃變性10～30s，50～65℃退火10～30s，并進行35～55個循環(huán)。

10、結果分析：

對無模板對照(ntc)的擴增曲線進行分析，septin9和內參基因應無擴增信號，說明實驗無污染，可以繼續(xù)分析。

陰陽性質控品的內參基因應均有擴增信號，且呈s型擴增曲線，陰陽性質控品內參基因的ct值應該≤32；陰性質控品的septin9應無明顯擴增信號，陽性質控品septin9的ct值應≤32。質控品檢測滿足以上條件時，證明實驗有效，可繼續(xù)分析。

樣本的內參基因應均有擴增信號，且呈s型擴增曲線，且ct值應該≤32，實驗結果才有效。此時樣本的septin9的ct值<45，則判斷為陽性；樣本的septin9沒有擴增信號，則判斷為陰性。

若不滿足無模板對照及陰陽性質控品的要求，則建議重新檢測。

11、結果，在50例結直腸癌血漿樣本中，對sept9正反鏈同時進行檢測的試劑盒共檢測到sept9基因甲基化陽性48例，陽性率為96％；而只對sept9正鏈進行檢測的試劑盒共檢測到sept9基因甲基化陽性45例，陽性率為90％。在50例健康人血漿樣本中，不管是對sept9正反鏈檢測還是只對sept9正鏈進行檢測的檢測結果都為sept9基因甲基化陰性。