本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種特異地高靈敏度檢測低頻基因突變的高通量檢測方法和試劑盒，尤其在egfr基因突變檢測方面取得良好效果。
背景技術(shù)：
血漿作為重要的液體活檢樣本來源之一，含有較多來源于衰老死亡細(xì)胞釋放的循環(huán)dna，病人血漿中含有更多的游離dna，主要由凋亡和壞死的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，其遺傳學(xué)特性與腫瘤基因組dna相似，變異形式包括缺失、點(diǎn)突變、拷貝數(shù)增加等。因此，血漿dna已經(jīng)作為一種無創(chuàng)性檢測樣本，成為疾病早期診斷、病情監(jiān)測、療效及預(yù)后評(píng)估的一種重要標(biāo)志物。
自腫瘤癌癥患者的血漿dna中可以獲得精細(xì)的基因突變，在癌癥的初始診斷、治療監(jiān)控和復(fù)發(fā)監(jiān)控均有望發(fā)揮重要作用。隨著二代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，血漿dna越來越多地被應(yīng)用于腫瘤相關(guān)基因的變異檢測中，進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、無創(chuàng)、高靈敏檢測，為患者提供各種診斷依據(jù)。
但在通常的血液樣本中，ctdna含量很低(0.1-1％)，且每個(gè)突變點(diǎn)可能為低頻突變。研究表明，第二代高通量測序可快速準(zhǔn)確高通量獲得血漿游離dna信息，但以低含量、片段化形式存在的血漿dna使得傳統(tǒng)pcr方式很難有效的排除檢測到的低頻突變的假陽性。
表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,egfr)是與人體表皮生長因子結(jié)合后啟動(dòng)下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路而發(fā)揮一系列生理及病理作用。egfr主要分布于細(xì)胞膜表面，屬于i型酪氨酸激酶受體家族，具有酪氨酸激酶活性。研宄表明，約43％～89％的非小細(xì)胞肺癌患者，egfr高表達(dá)，其下游的信號(hào)通路會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、浸潤轉(zhuǎn)移及血管生成。egfr基因突變與非小細(xì)胞肺癌患者對酪氨酸激酶抑制劑的敏感性有關(guān)。egfr基因突變包括3種不同類型(點(diǎn)突變、缺失突變和插入突變)，主要集中于編碼酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的18-21外顯子。目前，血液egfr突變檢測因二代測序的上述局限并未得到廣泛開展，針對egfr基因的低頻突變檢測水平需要更高靈敏度，更高特異性的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明創(chuàng)造旨在提出一種癌癥相關(guān)基因突變高靈敏度檢測方法，能夠有效排除假陽性的低頻突變，檢測結(jié)果靈敏度和特異性都較高。
本發(fā)明創(chuàng)造提供的癌癥相關(guān)基因突變高靈敏度檢測方法，包括下述步驟：
(1)樣品dna提?。?/p>
(2)第一步擴(kuò)增：將樣品dna與多重pcr擴(kuò)增試劑混合，同時(shí)加入針對至少一個(gè)目的基因設(shè)計(jì)的帶標(biāo)簽引物組，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到目的基因dna片段；
其中，針對一個(gè)目的基因設(shè)計(jì)的帶標(biāo)簽引物組含有下述4條引物：
序列l(wèi)1:自5’端依次連接的正向接頭序列、uid序列、正向引物序列
序列l(wèi)2:自5’端依次連接的反向接頭序列、uid序列、反向引物序列
序列l(wèi)3:自5’端依次連接的正向接頭序列、uid序列、反向引物序列
序列l(wèi)4:自5’端依次連接的反向接頭序列、uid序列、正向引物序列
其中，所述正向接頭序列和反向接頭序列均為一段適用于pcr擴(kuò)增的通用序列；所述uid序列為一段含有若干n或x堿基的標(biāo)簽序列；所述正向引物序列和反向引物序列分別為針對目的基因5’端和3’端設(shè)計(jì)得到的引物序列；
(3)第二步擴(kuò)增：對第一步擴(kuò)增得到的目的基因dna片段進(jìn)行pcr擴(kuò)增，以使第一步擴(kuò)增得到的目的基因dna片段得到富集；
(4)二代測序：將第二步擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
進(jìn)一步，所述樣品dna優(yōu)選為血漿dna；所述第一步擴(kuò)增優(yōu)選進(jìn)行2-10輪擴(kuò)增循環(huán)；所述第二步擴(kuò)增第一步擴(kuò)增優(yōu)選進(jìn)行15-35輪擴(kuò)增循環(huán)。
進(jìn)一步，所述第二步擴(kuò)增中，利用分別帶正向接頭序列和反向接頭序列的第二步擴(kuò)增引物對目的基因dna片段進(jìn)行pcr擴(kuò)增，第二步擴(kuò)增引物中可以帶有或不帶有適用于測序的測序接頭。
進(jìn)一步，所述數(shù)據(jù)分析包括如下步驟：
s1：將所有讀取結(jié)果(reads)比對到人類基因組上，去除瑕疵reads；其中，瑕疵reads包括以下至少一種情況：
1)去除比對到基因組多個(gè)位置的reads序列，減少非唯一比對reads序列對最終結(jié)果的影響；
2)判斷測序所得的reads序列是否包含需要檢測的位點(diǎn)，如果不包含，去除該條reads，如果包含，去除測序質(zhì)量低于10的reads序列；
3)識(shí)別每條reads序列是否在兩端存在完整的uid序列，如果不完整，去除該條reads；
s2：按照uid標(biāo)簽序列，將reads分成不同的家族(family)，每個(gè)family中前后的uid標(biāo)簽序列相同，去除瑕疵family；其中，瑕疵family包括以下至少一種情況：
1)如果兩個(gè)family中的uid只差一個(gè)位點(diǎn)(base)，而其中一個(gè)family的reads的數(shù)量大于等于另一個(gè)family的reads數(shù)量的兩倍，第二個(gè)family可以當(dāng)作pcr或測序錯(cuò)誤所產(chǎn)生的，去除第二個(gè)family；
2)對同一個(gè)family中reads數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如果reads數(shù)目少于3條，去除該family；
s3：統(tǒng)計(jì)突變型reads并對突變型的存在進(jìn)行判斷，判斷標(biāo)準(zhǔn)一般包括以下至少一種情況：
1)對同一個(gè)family中突變型和野生型的reads進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，當(dāng)突變型的reads占這個(gè)family里面reads的80％以上，才認(rèn)為該family中這個(gè)突變型是真實(shí)存在的；
2)統(tǒng)計(jì)每個(gè)檢測位點(diǎn)突變型family的數(shù)目，只要該位點(diǎn)突變型family數(shù)目大于3且突變型頻率占總頻率的0.0005以上，才認(rèn)為該檢測位點(diǎn)存在堿基突變。
本發(fā)明還提供了一種癌癥相關(guān)基因突變高靈敏度檢測試劑盒，包括帶標(biāo)簽引物試劑，所述帶標(biāo)簽引物試劑包括至少一個(gè)目的基因的一組帶標(biāo)簽引物，針對一個(gè)目的基因的一組帶標(biāo)簽引物組含有下述4條引物：
序列l(wèi)1:自5’端依次連接的正向接頭序列、uid序列、正向引物序列
序列l(wèi)2:自5’端依次連接的反向接頭序列、uid序列、反向引物序列
序列l(wèi)3:自5’端依次連接的正向接頭序列、uid序列、反向引物序列
序列l(wèi)4:自5’端依次連接的反向接頭序列、uid序列、正向引物序列
其中，帶標(biāo)簽引物試劑分為兩種混合液進(jìn)行存放，其中一種混合液為所有目的基因的帶標(biāo)簽引物中序列l(wèi)1和序列l(wèi)2構(gòu)成的引物混合液，另一種混合液為所有目的基因的帶標(biāo)簽引物中序列l(wèi)3和序列l(wèi)4構(gòu)成的引物混合液。
進(jìn)一步，所述試劑盒還可以包括樣品dna提取試劑、多重pcr擴(kuò)增試劑、與目的基因的一組帶標(biāo)簽引物的接頭序列匹配的第二步擴(kuò)增引物試劑、以及引物特異性酶解試劑。
本發(fā)明還提供了針對egfr基因的至少一個(gè)突變位點(diǎn)的帶標(biāo)簽引物，包括下面的至少一組帶標(biāo)簽引物：
帶標(biāo)簽引物組a：
a-f-p1：
ctaacctgatgggcagtcggtgatnnxxntgaggatcttgaaggaaactgaa
a-r-a1：
gcgacctgatgtctccgactcagctaaggtaacgatnnxxntaccttatacaccgtgccgaa
a-r-p1：
ctaacctgatgggcagtcggtgatnnxxntaccttatacaccgtgccgaa
a-f-a1：
gcgacctgatgtctccgactcagctaaggtaacgatnnxxntgaggatcttgaaggaaactgaa
帶標(biāo)簽引物組b：
b-f-p1：
ctaacctgatgggcagtcggtgatnnxxnggtgagaaagttaaaattcccgtc
b-r-a1：
gcgacctgatgtctccgactcagctaaggtaacgatnnxxngatttccttgttggctttcgg
b-f-a1：
gcgacctgatgtctccgactcagctaaggtaacgatnnxxnggtgagaaagttaaaattcccgtc
b-r-p1：
ctaacctgatgggcagtcggtgatnnxxngatttccttgttggctttcgg
帶標(biāo)簽引物組c：
c-f-p1：
ctaacctgatgggcagtcggtgatnnxxncctccaggaagcctacgtga
c-r-a1：
gcgacctgatgtctccgactcagctaaggtaacgatnnxxncagcaggcggcacacg
c-f-a1：
ctaacctgatgggcagtcggtgatnnxxncagcaggcggcacacg
c-r-p1：
gcgacctgatgtctccgactcagctaaggtaacgatnnxxncctccaggaagcctacgtga
帶標(biāo)簽引物組d：
d-f-p1：
ctaacctgatgggcagtcggtgatnnxxnatctgcctcacctccacc
d-r-a1：
gcgacctgatgtctccgactcagctaaggtaacgatnnxxngttcccggacatagtcca
d-f-a1：
gcgacctgatgtctccgactcagctaaggtaacgatnnxxnatctgcctcacctccacc
d-r-p1：
ctaacctgatgggcagtcggtgatnnxxngttcccggacatagtcca
帶標(biāo)簽引物組e：
e-f-p1：
ctaacctgatgggcagtcggtgatnnxxncgcagcatgtcaagatcaca
e-r-a1：
gcgacctgatgtctccgactcagctaaggtaacgatnnxxnatggtattctttctcttccgc
e-f-a1：
ctaacctgatgggcagtcggtgatnnxxnatggtattctttctcttccgc
e-r-p1：
gcgacctgatgtctccgactcagctaaggtaacgatnnxxncgcagcatgtcaagatcaca
本發(fā)明還提供了針對肺癌egfr基因的檢測試劑盒，包括分為兩種混合液分別存放的帶標(biāo)簽引物試劑，其中一種混合液包括上述帶標(biāo)簽引物中的
a-f-p1/a-r-a1,b-f-p1/b-r-a1,c-f-p1/c-r-a1,d-f-p1/d-r-a1,e-f-p1/e-r-a1
另一種混合液包括上述帶標(biāo)簽引物中的
a-r-p1/a-f-a1,b-f-a1/b-r-p1,c-r-p1/c-f-a1,d-f-a1/d-r-p1,e-r-p1/e-f-a1。
相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明創(chuàng)具有以下優(yōu)勢：
1、始游離dna輸入量少：起始只需要加入游離dna的量為2-50ng。
2、采用標(biāo)簽技術(shù)進(jìn)行兩步擴(kuò)增的方法，能夠有效排除假陽性的低頻突變，能夠檢測到低至0.1％以下的微量低頻突變。
3、優(yōu)化了連接在引物兩端的接頭序列，pcr擴(kuò)增特異性大幅度增加。
4、pcr擴(kuò)增過程采用正反向同時(shí)進(jìn)行雙向擴(kuò)增，消除了鏈偏差，增加了分析突變的特異性。
5、優(yōu)化了數(shù)據(jù)分析步驟，消除了瑕疵序列的干擾，有效排除pcr或測序錯(cuò)誤。
具體實(shí)施方式
下面詳細(xì)說明本發(fā)明創(chuàng)造。但不用于限定本發(fā)明。
本發(fā)明檢測癌癥相關(guān)基因突變情況，是通過采用帶標(biāo)簽的特異性引物首先對目的基因進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增，然后在進(jìn)行高通量二代測序的方法獲得的。具體地，可以包括如下處理步驟。
一、帶標(biāo)簽引物設(shè)計(jì)
從在線數(shù)據(jù)庫檢索癌癥相關(guān)基因(如egfr基因)突變位點(diǎn)的dna序列，通過軟件進(jìn)行比對并針對這些突變區(qū)域設(shè)計(jì)引物，在引物端加接頭序列和唯一標(biāo)識(shí)符(uniqueidentifier(uid))序列。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)篩選和驗(yàn)證，得到擴(kuò)增效率高、特異性好，能夠正確獲得待檢測樣本中低頻基因突變的帶標(biāo)簽引物。
其中，針對癌癥相關(guān)基因一個(gè)外顯子的一個(gè)突變(目的基因)設(shè)有一組帶標(biāo)簽引物，一組帶標(biāo)簽引物含有下述4條引物：
序列l(wèi)1:自5’端依次連接的正向接頭序列、uid序列、正向引物序列
序列l(wèi)2:自5’端依次連接的反向接頭序列、uid序列、反向引物序列
序列l(wèi)3:自5’端依次連接的正向接頭序列、uid序列、反向引物序列
序列l(wèi)4:自5’端依次連接的反向接頭序列、uid序列、正向引物序列
其中，所述正向接頭序列和反向接頭序列均為一段適用于pcr擴(kuò)增的通用序列，便于第二步擴(kuò)增并為制備文庫做好準(zhǔn)備；所述uid序列為一段含有若干n或x堿基的標(biāo)簽序列，一條引物序列中(如序列l(wèi)1)標(biāo)簽序列的數(shù)量為n，則擴(kuò)增后可以產(chǎn)生4n個(gè)標(biāo)簽數(shù)量；所述正向引物序列和反向引物序列分別為針對目的基因5’端和3’端設(shè)計(jì)得到的引物序列。
一組帶標(biāo)簽引物的4條引物的設(shè)計(jì)有利于實(shí)現(xiàn)雙向擴(kuò)增后測序，消除鏈偏向性(strandbias)，減少了檢測結(jié)果的非特異性。
非限定性的示例性癌癥相關(guān)基因可以包括：
(1)tp53基因第175號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(2)tp53基因第245號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(3)tp53基因第248號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(4)tp53基因第273號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(5)tp53基因第306號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(6)ret基因第918號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(7)pten基因第267號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(8)pten基因第233號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(9)pten基因第159號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(10)pik3ca基因第1047號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(11)pik3ca基因第542號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(12)pik3ca基因第545號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(13)pik3ca基因第546號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(14)pik3ca基因第549號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(15)nras基因第12號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(16)nras基因第13號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(17)nras基因第61號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(18)nras基因第117號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(19)nras基因第146號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(20)kras基因第12號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(21)kras基因第13號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(22)kras基因第61號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(23)kras基因第117號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(24)kras基因第146號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(25)kit基因第816號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(26)kit基因第642號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(27)kit基因第576號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(28)kit基因第559號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(29)kit基因第557號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(30)fgfr3基因第249號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(31)fgfr3基因第380號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(32)fgfr3基因第391號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(33)fgfr3基因第641號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(34)fgfr3基因第650號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(35)egfr基因第719號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(36)egfr基因第747號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(37)egfr基因第790號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(38)egfr基因第854號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(39)egfr基因第858號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(40)egfr基因第858號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(41)egfr基因第861號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(42)ctnnb1基因第37號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(43)ctnnb1基因第45號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(44)braf基因第466號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(45)braf基因第469號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(46)braf基因第594號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(47)braf基因第596號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(48)braf基因第597號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
(49)braf基因第600號(hào)密碼子所攜帶的突變位點(diǎn)
二、采用帶標(biāo)簽引物對癌癥相關(guān)基因進(jìn)行檢測
(1)樣品dna提?。禾崛⊙獫{dna作為檢測樣本；
(2)目的基因多重pcr擴(kuò)增(第一步擴(kuò)增)：將樣品dna與多重pcr擴(kuò)增試劑混合，同時(shí)加入針對目的基因設(shè)計(jì)的一組帶標(biāo)簽引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到目的基因dna片段，一般為160-200bp的長度；本步擴(kuò)增優(yōu)選進(jìn)行2-10輪(cycle)的pcr擴(kuò)增；
(3)引物二聚體酶解：將得到目的基因dna片段，加入引物特異性酶解試劑，降解去除pcr擴(kuò)增片段中的引物序列；
(4)第二步擴(kuò)增：利用分別帶正向接頭序列和反向接頭序列的第二步擴(kuò)增引物對目的基因dna片段進(jìn)行pcr擴(kuò)增，第二步擴(kuò)增引物中可以帶有或不帶有適用于測序的測序接頭，本步擴(kuò)增優(yōu)選進(jìn)行15-35個(gè)cycle的pcr擴(kuò)增；
(5)二代測序：將第二步擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
本發(fā)明的數(shù)據(jù)分析包括下述步驟：
s1：將所有讀取結(jié)果(reads)比對到人類基因組上，去除瑕疵reads；其中，瑕疵reads包括以下至少一種情況：
1)去除比對到基因組多個(gè)位置的reads序列，減少非唯一比對reads序列對最終結(jié)果的影響；
2)判斷測序所得的reads序列是否包含需要檢測的位點(diǎn)，如果不包含，去除該條reads，如果包含，去除測序質(zhì)量低于10的reads序列；
3)識(shí)別每條reads序列是否在兩端存在完整的uid序列，如果不完整，去除該條reads；
s2：按照uid標(biāo)簽序列，將reads分成不同的家族(family)，每個(gè)family中前后的uid標(biāo)簽序列相同，去除瑕疵family；其中，瑕疵family包括以下至少一種情況：
1)如果兩個(gè)family中的uid只差一個(gè)位點(diǎn)(base)，而其中一個(gè)family的reads的數(shù)量大于等于另一個(gè)family的reads數(shù)量的兩倍，第二個(gè)family可以當(dāng)作pcr或測序錯(cuò)誤所產(chǎn)生的，去除第二個(gè)family；
2)對同一個(gè)family中reads數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如果reads數(shù)目少于3條，去除該family；
s3：統(tǒng)計(jì)突變型reads并對突變型的存在進(jìn)行判斷，判斷標(biāo)準(zhǔn)一般包括以下至少一種情況：
1)對同一個(gè)family中突變型和野生型的reads進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，當(dāng)突變型的reads占這個(gè)family里面reads的80％以上，才認(rèn)為該family中這個(gè)突變型是真實(shí)存在的；
2)統(tǒng)計(jì)每個(gè)檢測位點(diǎn)突變型family的數(shù)目，只要該位點(diǎn)突變型family數(shù)目大于3且突變型頻率占總頻率的0.0005以上，才認(rèn)為該檢測位點(diǎn)存在堿基突變。
本發(fā)明經(jīng)過上述監(jiān)測和數(shù)據(jù)分析，能夠有效去除pcr或測序錯(cuò)誤產(chǎn)生的假陽性結(jié)果，能夠檢測到低至0.1％以下的微量低頻突變。
本發(fā)明對癌癥相關(guān)基因的檢測可以采用試劑盒的形式，具體可以包括樣品dna(血漿dna)提取試劑、帶標(biāo)簽引物試劑、多重pcr擴(kuò)增試劑、帶有測序接頭的與目的基因的一組帶標(biāo)簽引物的接頭序列匹配的第二步擴(kuò)增引物試劑、以及引物特異性酶解試劑。其中，所述帶標(biāo)簽引物試劑包括至少一個(gè)目的基因的一組帶標(biāo)簽引物，且?guī)?biāo)簽引物試劑分為兩種混合液進(jìn)行存放，其中一種混合液為所有目的基因的帶標(biāo)簽引物中序列l(wèi)1和序列l(wèi)2構(gòu)成的引物混合液，另一種混合液為所有目的基因的帶標(biāo)簽引物中序列l(wèi)3和序列l(wèi)4構(gòu)成的引物混合液。進(jìn)一步，所述試劑盒中還可以包括用于高通量測序的試劑，例如文庫擴(kuò)增試劑等。
下面以egfr基因?yàn)槔M(jìn)一步詳細(xì)介紹本發(fā)明的檢測方法。
一、帶標(biāo)簽引物設(shè)計(jì)
針對常見的egfr基因的9個(gè)常見突變位點(diǎn)，從pubmed在線數(shù)據(jù)庫檢索egfr基因突變位點(diǎn)的dna序列，通過ncbiblast軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)進(jìn)行比對，然后應(yīng)用primeprimer5(primerbiosoft，usa)軟件針對這些突變區(qū)域設(shè)計(jì)引物序列(正向引物序列以f表示，反向引物序列以r表示)，在引物端加接頭序列(正向接頭序列以p1表示，反向接頭序列以a1表示)和唯一標(biāo)識(shí)符(uid)序列。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)篩選和驗(yàn)證，得到了擴(kuò)增效率高、特異性好，針對待測樣本中不同目的基因的五組帶標(biāo)簽引物，具體如下。
帶標(biāo)簽引物組a用于檢測egfr基因18號(hào)外顯子g719x突變，引物序列如下：
a-f-p1：
a-r-a1：
a-r-p1：
a-f-a1：
帶標(biāo)簽引物組b用于檢測egfr基因19號(hào)外顯子e746_a750del&v769_d770insasv的缺失/插入，引物序列如下：
b-f-p1：
b-r-a1：
b-f-a1：
b-r-p1：
帶標(biāo)簽引物組c用于檢測egfr基因20號(hào)外顯子s768i突變，引物序列如下：
c-f-p1：
c-r-a1：
c-f-a1：
c-r-p1：
帶標(biāo)簽引物組d用于檢測egfr基因20號(hào)外顯子t790m突變，引物物序列如下：
d-f-p1：
d-r-a1：
d-f-a1：
d-r-p1：
帶標(biāo)簽引物組e用于檢測egfr基因20號(hào)外顯子l858r&ll861q突變,引物序列如下：
e-f-p1：
e-r-a1：
e-f-a1：
e-r-p1：
在上述帶標(biāo)簽引物中，單下劃線部分為正向接頭序列，雙下劃線部分為反向結(jié)構(gòu)序列，單曲線部分為正向引物序列，雙曲線部分為反向引物序列，無下劃線部分為uid序列。
二、采用上述帶標(biāo)簽引物對癌癥相關(guān)基因進(jìn)行擴(kuò)增
1、引物稀釋與混合
將上述帶標(biāo)簽引物高速離心后，分組混合成預(yù)混引物，以1:15的比例向預(yù)混引物中加入lowtebuffer,配置成引物混合液(primermixer)用于第一步擴(kuò)增。其中，引物混合液為兩種，分別包括5對引物：
primermix1(5pairs)：
a-f-p1/a-r-a1,b-f-p1/b-r-a1,c-f-p1/c-r-a1,d-f-p1/d-r-a1,e-f-p1/e-r-a1
primermix2(5pairs)：
a-r-p1/a-f-a1,b-f-a1/b-r-p1,c-r-p1/c-f-a1,d-f-a1/d-r-p1,e-r-p1/e-f-a1
上述兩種引物混合液可以分別作為成品試劑盒中的帶標(biāo)簽引物試劑。
2、樣品dna提取
從單個(gè)血液樣本分離血漿部分，然后用magmaxtmcell-freednaisolationkit提取游離dna。
3、第一步擴(kuò)增
將樣品dna與帶標(biāo)簽引物試劑(primermix1&primermix2)混合，進(jìn)行覆蓋度均一的特異性擴(kuò)增，得到140～190bp長度的目的基因dna片段。本步擴(kuò)增在目的基因兩端加上uid標(biāo)簽，叫做taggingpcr，擴(kuò)增條件是98℃10秒，65℃秒，72℃30秒，2-10個(gè)cycle。
4、引物二聚體酶解
將第一步擴(kuò)增得到目的基因dna片段，加入引物特異性酶解試劑，降解去除pcr擴(kuò)增片段中的引物序列。
5、第二步擴(kuò)增
用pcr擴(kuò)增試劑盒qiagenmultiplexpcrkit做第二步pcr，將帶標(biāo)簽的目的基因dna片段進(jìn)行富集，本步擴(kuò)增的擴(kuò)增引物(第二步擴(kuò)增引物)包含第一步擴(kuò)增引物中的接頭序列，即正向引物包含ctaacctgatgggcagtcggtgat，反向引物包含
三、高通量測序
1、接頭連接
若第二步擴(kuò)增引物中不同時(shí)含有適用于測序的測序接頭，可以單獨(dú)進(jìn)行接頭連接操作，將上述第二步擴(kuò)增的產(chǎn)物與測序接頭、特異性區(qū)分序列的barcord標(biāo)簽、連接反應(yīng)試劑、end-repair反應(yīng)后純化，得到加了測序接頭的dna片段。
2、文庫構(gòu)建
將含有測序接頭的dna片段與文庫擴(kuò)增試劑混合，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到小片段dna文庫。
3、文庫均一化
將獲得的小片段dna文庫加入額定吸附能力的磁珠，進(jìn)行純化，獲得特定濃度的小片段dna文庫。
4、文庫檢測
將上一步所獲得的特定濃度的小片段dna文庫采用熒光定量pcr的方法檢測濃度。
5、上機(jī)測序
上一步檢測后的特定濃度的小片段dna文庫進(jìn)行高通量測序，采用ionprotontm測序平臺(tái)(其他高通量測序平臺(tái)的高通量檢測方法也同樣適用)。
四、數(shù)據(jù)分析
1、將所有reads比對到人類基因組上，去除瑕疵reads；其中，瑕疵reads的去除包括：
1)去除比對到基因組多個(gè)位置的reads序列，減少非唯一比對reads序列對最終結(jié)果的影響；
2)判斷測序所得的reads序列是否包含需要檢測的位點(diǎn)，如果不包含，去除該條reads，如果包含，去除測序質(zhì)量低于10的reads序列；
3)識(shí)別每條reads序列是否在兩端存在完整的uid序列，如果不完整，去除該條reads；
2、按照uid標(biāo)簽序列，將reads分成不同的family，每個(gè)family中前后的uid標(biāo)簽序列相同，去除瑕疵family；其中，瑕疵family的去除包括：
1)如果兩個(gè)family中的uid只差一個(gè)base，而其中一個(gè)family的reads的數(shù)量大于等于另一個(gè)family的reads數(shù)量的兩倍，第二個(gè)family可以當(dāng)作pcr或測序錯(cuò)誤所產(chǎn)生的，去除第二個(gè)family；
2)對同一個(gè)family中reads數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如果reads數(shù)目少于3條，去除該family；
3、統(tǒng)計(jì)突變型reads并對突變型的存在進(jìn)行判斷，判斷標(biāo)準(zhǔn)包括：
1)對同一個(gè)family中突變型和野生型的reads進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，當(dāng)突變型的reads占這個(gè)family里面reads的80％以上，才認(rèn)為該family中這個(gè)突變型是真實(shí)存在的；
2)統(tǒng)計(jì)每個(gè)檢測位點(diǎn)突變型family的數(shù)目，只要該位點(diǎn)突變型family數(shù)目大于3且突變型頻率占總頻率的0.0005以上，才認(rèn)為該檢測位點(diǎn)存在堿基突變。
以上所述僅為本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明創(chuàng)造，凡在本發(fā)明創(chuàng)造的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。