本發(fā)明屬于植物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一套毛花獼猴桃和中華獼猴桃物種間雜交子代的鑒定引物，可加快獼猴桃育種進(jìn)程。

背景技術(shù)：

獼猴桃（屬名：actinidia）為雌雄異株的大型落葉木質(zhì)藤本植物，其果實(shí)口味俱佳，且具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，被譽(yù)為“水果之王”。目前，我國(guó)獼猴桃產(chǎn)量和面積均居世界第一，在世界獼猴桃產(chǎn)業(yè)中具有舉足輕重的地位。

原產(chǎn)于我國(guó)的獼猴桃共有52個(gè)種，具有廣泛的果實(shí)表型、品質(zhì)特性和遺傳變異的豐富多樣性。常用于馴化、栽培和選育的物種有中華獼猴桃和毛花獼猴桃等。中華獼猴桃雌花多為單花，雄花多為聚傘花序，花為白色。果實(shí)多為褐色，果面被短茸毛，成熟時(shí)脫落，平均果重約20-120g，風(fēng)味甜，余味酸，質(zhì)嫩，汁多。毛花獼猴桃，雌雄花均為多歧聚傘花序，花為紅色。果實(shí)果面被長(zhǎng)白色茸毛，果皮綠色，果肉青綠色，細(xì)致，果重約10-40g，風(fēng)味甜酸，有青草香氣味，果實(shí)維生素c含量極高，是培育高維生素c含量物種的特殊種質(zhì)資源。

在新物種培育過(guò)程中，以果形美觀、優(yōu)質(zhì)耐貯、豐產(chǎn)和抗逆等為育種目標(biāo)，常選擇多個(gè)獼猴桃物種或種類(lèi)進(jìn)行雜交，從雜交子代中選出具有優(yōu)良性狀的個(gè)體進(jìn)行培育。一個(gè)關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是準(zhǔn)確辨別所有子代個(gè)體的遺傳背景。然而，基于形態(tài)特征的子代判別存在一定的缺陷，如周期長(zhǎng)、子代早期的物種特征性狀不明顯等。分子鑒定方法具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，在遺傳背景鑒定中具有重要意義，從而加快新種質(zhì)的培育。常用的分子標(biāo)記有葉綠體和線粒體標(biāo)記，其中，葉綠體標(biāo)記屬于父系遺傳，線粒體標(biāo)記屬于母系遺傳，這兩類(lèi)標(biāo)記可組合一起進(jìn)行親本關(guān)系鑒定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是開(kāi)發(fā)一套獼猴桃物種間雜種子代的鑒定引物，適用于鑒定毛花獼猴桃和中華獼猴桃雜交子代是否為真實(shí)的雜種后代，在童期就可以開(kāi)展分子鑒定、節(jié)省育種成本。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一、一套鑒定毛花獼猴桃和中華獼猴桃獼猴桃物種間雜交子代的引物

本發(fā)明通過(guò)比較毛花獼猴桃和中華獼猴桃的葉綠體和線粒體基因組序列，開(kāi)發(fā)出一套用于鑒定毛花獼猴桃和中華獼猴桃雜交子代的引物，分別包含葉綠體和線粒體分子標(biāo)記的3對(duì)引物：

葉綠體標(biāo)記引物為：

1）trnt-nl：

f:5’-cgaaatcggtagacgctacg-3’,

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2）trnl-nf：

f：5’-aaaatcgtgagggttcaagtc-3’，

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3）pid1：

f：5’-gttatgcatgaacgtaatgctc-3’，

r：5’-cgcgcatggtggattcacaatc-3’；

線粒體標(biāo)記引物為：

1）kiwi-mt7：

f：5’-aaggcaagggtactgactgc-3’，

r：5’-ctttgaaacatgggccggtg-3’；

2）kiwi-mt18：

f：5’-gtaaagaaccaccccgagca-3’，

r：5’-ggattgctcttttcgacggc-3’；

3）kiwi-mt22：

f：5’-tctgcacgcatgagaccatt-3’，

r：5’-ccaccaagggcttactccag-3’。

二、一種準(zhǔn)確快速鑒定毛花獼猴桃和中華獼猴桃物種間雜交子代的方法

本方法在童期就可以開(kāi)展分子鑒定、節(jié)省育種成本、且不受環(huán)境影響。

本方法包括以下步驟：

①待檢測(cè)個(gè)體及親本基因組dna的提?。豪胏tab法從毛花獼猴桃和中華獼猴桃及待檢測(cè)樣品樹(shù)皮中提取基因組dna；

②pcr擴(kuò)增：以權(quán)利要求1所述6個(gè)引物對(duì)為擴(kuò)增引物，以上一步驟提取的基因組dna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)；pcr反應(yīng)體系為50μl，包含dna模板30～50ng，正/反向引物各0.25μm，2×pcrmastermix25.0μl，ddh2o補(bǔ)足至50μl；pcr反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性4min；35個(gè)循環(huán)：變性，94℃、35s，退火，54℃、35s和延伸，72℃、40s；72℃終延伸4min；

③dna測(cè)序：將上述pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增子大小參考seqidno：1-6，以每對(duì)引物的上游引物為測(cè)序引物，對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得毛花獼猴桃和中華獼猴桃及待檢測(cè)樣品的6個(gè)片段的dna序列；

④序列分析：利用clustaw軟件分別對(duì)每個(gè)擴(kuò)增片段的測(cè)序序列進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)親本和待檢測(cè)子代所有變異位點(diǎn)的基因型；

⑤雜交子代的鑒定：根據(jù)葉綠體父系遺傳和線粒體母系遺傳的規(guī)律，判別子代是毛花獼猴桃和中華獼猴桃的雜交后代，真實(shí)子代的葉綠體標(biāo)記基因型與父本完全相同，線粒體標(biāo)記基因型與母本完全相同。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，可節(jié)省育種成本及加快獼猴桃育種進(jìn)程。

附圖說(shuō)明

圖1為3個(gè)葉綠體分子標(biāo)記和3個(gè)線粒體分子標(biāo)記在毛花獼猴桃和中華獼猴桃及待檢測(cè)子代中的基因分型；

所展示的2個(gè)子代的葉綠體標(biāo)記基因型與毛花獼猴桃相同，線粒體標(biāo)記基因型與中華獼猴桃相同，因此，子代被鑒定為以毛花獼猴桃為父本、中華獼猴桃為母本的雜交子代。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例中所用材料為：用于雜交育種的親本毛花獼猴桃和中華獼猴桃，及2個(gè)候選雜交子代品種，即滿(mǎn)天紅和紅花金果。

1、分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及引物設(shè)計(jì)

對(duì)毛花獼猴桃和中華獼猴桃的葉綠體基因組序列進(jìn)行線性比對(duì)，鑒定出葉綠體和線粒體基因組變異位點(diǎn)；分別隨機(jī)挑選3個(gè)葉綠體和線粒體基因組變異位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)參數(shù)和要求如下：（1）上下游引物序列離變異位點(diǎn)至少有100bp；（2）引物序列長(zhǎng)度控制在18～25bp；（3）引物序列g(shù)c含量為30%～70%；（4）退火溫度范圍在52℃-63℃；（5）擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度為500～1000bp。最終我們篩選獲得3對(duì)線粒體和3對(duì)葉綠體引物，其序列見(jiàn)下表：

2、基因組dna提取

利用ctab法從毛花獼猴桃和中華獼猴桃及待檢測(cè)子代的樹(shù)皮樣本中提取基因組dna，步驟如下：（1）用液氮對(duì)新鮮樹(shù)皮進(jìn)行研磨，并轉(zhuǎn)移至2ml離心管中；（2）向離心管中加入1ml60℃預(yù)熱的洗液，震蕩搖勻后，10000rpm離心10min，去上清；（3）向離心管中加入1ml60℃預(yù)熱的3×ctab提取緩沖液，60℃水浴60min，然后10000rpm離心8min，取上清至另一新的2ml離心管中；（4）加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇（25：24：1），震蕩搖勻10min，12000rpm離心10min，取上清至另一新的2ml離心管中；（5）向離心管中加入等體積的氯仿-異戊醇（24：1），震蕩搖勻10min，12000rpm離心10min，取上清至另一新的2ml離心管中；（6）加入等體積的預(yù)冷的異丙醇和1/10體積的3mnaac，混勻后置于-20℃至少30min，10000rpm4℃離心10min，棄上清；（7）用預(yù)冷的75%乙醇清洗沉淀，然后干燥dna（自然風(fēng)干或37℃風(fēng)干）；（8）利用50μlte緩沖液溶解dna。

3、pcr擴(kuò)增

以上述毛花獼猴桃和中華獼猴桃及待檢測(cè)子代的基因組dna為模板，分別以trnt-nl、trnl-nf、pid1、kiwi-mt7、kiwi-mt18、kiwi-mt22為擴(kuò)增引物進(jìn)行pcr反應(yīng)。pcr反應(yīng)體系為50μl，包含dna模板30～50ng，正/反向引物各0.25μm，2×pcrmastermix25.0μl，ddh2o補(bǔ)足至50μl；pcr反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性4min；35個(gè)循環(huán)：變性，94℃、35s，退火，54℃、35s和延伸，72℃、40s；72℃終延伸4min。

4、dna測(cè)序

將上述pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增子大小參考seqidno：1-6。以每對(duì)引物的上游引物為測(cè)序引物，對(duì)相應(yīng)的pcr產(chǎn)物進(jìn)行sanger法測(cè)序，獲得毛花獼猴桃和中華獼猴桃及待檢測(cè)樣品的6個(gè)片段的dna序列。

5、序列分析和基因分型

分別對(duì)每個(gè)標(biāo)記的所有樣品的序列進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)親本和待檢測(cè)子代所有變異位點(diǎn)的基因型；如圖1所示，葉綠體分子標(biāo)記引物trnt-nl、trnl-nf、pid1擴(kuò)增的片段序列中，分別發(fā)現(xiàn)有4、5和1個(gè)snp位點(diǎn)，且還存在插入缺失位點(diǎn)；線粒體分子標(biāo)記引物kiwi-mt7、kiwi-mt18、kiwi-mt22擴(kuò)增的片段序列中，分別發(fā)現(xiàn)有1、1和3個(gè)snp位點(diǎn)。

6、雜交子代鑒定

子代鑒定的理論依據(jù)為：葉綠體基因組為父系遺傳；線粒體基因組為母系遺傳。如圖1所示，滿(mǎn)天紅和紅花金果葉綠體標(biāo)記的基因型全與毛花獼猴桃相同；線粒體標(biāo)記的基因型全與中華獼猴桃相同；因此，所鑒定的滿(mǎn)天紅和紅花金果兩個(gè)品種確實(shí)為以毛花獼猴桃為父本、以中華獼猴桃為母本的雜交子代品種。

序列表

<110>中國(guó)科學(xué)院武漢植物園

<120>一套毛花獼猴桃和中華獼猴桃物種間雜交子代的鑒定引物

<140>

<141>

<160>18

<210>1

<211>532

<212>dna

<400>

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