本發(fā)明涉及一種可檢測多種羊巴貝斯蟲的方法及其檢測試劑盒，特別是一種用于檢測羊巴貝斯蟲未定種、莫氏巴貝斯蟲lz亞種和莫氏巴貝斯蟲nb亞種的方法及檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

羊巴貝斯蟲病（ovinebabesiosis）是由媒介蜱傳播的巴貝斯屬（babesia）的多種巴貝斯蟲寄生于羊紅細(xì)胞內(nèi)而引起的一種血液原蟲病。感染動物表現(xiàn)高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿等臨床癥狀，嚴(yán)重感染時甚至可以引起死亡。目前，報道且命名的羊巴貝斯蟲種主要有綿羊巴貝斯蟲（b.ovis）、莫氏巴貝斯蟲（b.motasi）和粗糙巴貝斯蟲(b.crassa)。綿羊巴貝斯蟲致病性最強，莫氏巴貝斯蟲次之，粗糙巴貝斯蟲幾乎沒有致病性。綿羊巴貝斯蟲和莫氏巴貝斯蟲的傳播媒介分別為扇頭蜱（rhipicephalus）和血蜱（haemaphysalis）屬的蜱種，粗糙巴貝斯蟲的傳播媒介尚不清楚。莫氏巴貝斯蟲的不同地理分離株生物學(xué)特性存在較大差異，根據(jù)致病性的不同，目前的觀點是其至少包含兩個種或亞種（uilenberg,2006）。

我國對羊巴貝斯蟲病的研究起步較晚，最早在四川（1982年）和黑龍江（1986年）有過相關(guān)報道。之后，在云南、山西、河南和甘肅等省份也有零星的報道，但一直沒有分離到病原。自1996年已來，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所先后從甘肅、新疆、河北、遼寧、湖北、河南等地分離到9株羊的巴貝斯蟲，通過對其生物學(xué)特性和分子分類學(xué)的研究表明這些巴貝斯蟲可以分為兩個種，即莫氏巴貝斯蟲和巴貝斯蟲未定種(babesiasp.)(guanetal.,2002,2009;liuetal.,2007;niuetal.,2009)。而莫氏巴貝斯蟲不同分離株又可分為兩個亞種，代表株分別為臨潭/天祝株和寧縣/河北株(baietal.,2002;guanetal.,2002;liuetal.,2007b；niuetal.,2009a)。然而目前對于這些羊的巴貝斯蟲尚未進行統(tǒng)一命名，主要原因是對其部分基因組學(xué)的研究工作尚未完成。因此目前暫將其分別稱為羊巴貝斯蟲未定種、莫氏巴貝斯蟲lz亞種和莫氏巴貝斯蟲nb亞種。此外，通過多年的研究，建立了可鑒別檢測羊巴貝斯蟲未定種和莫氏巴貝斯蟲的多種分子生物學(xué)和血清學(xué)檢測技術(shù)，如lamp、rlb和elisa等方法，同時應(yīng)用這些方法對我國不同地區(qū)羊的巴貝斯蟲感染狀況的調(diào)查研究。2008年guan等建立了能特異性檢測羊巴貝斯蟲未定種和莫氏巴貝斯蟲的lamp方法，并應(yīng)用此方法分別對采自甘肅甘南州和新疆伊犁共510份血液樣品進行了檢測，結(jié)果顯示莫氏巴貝斯蟲的陽性率為14.3%，羊巴貝斯蟲未定種陽性率為3.5%（guanetal.,2008）；2009年niu等應(yīng)用建立的rlb方法對采自我國5省份的1234份羊的血樣進行了巴貝斯蟲的檢測，結(jié)果表明莫氏巴貝斯蟲平均陽性率為0.73%（niuetal.,2009a）；2012年-2013年間，guan等和wang等利用莫氏巴貝斯蟲和羊巴貝斯蟲未定種的可溶性蟲體抗原建立的elisa方法，對我國22個省份羊巴貝斯蟲病的流行狀況進行調(diào)查，結(jié)果顯示在這22個省份中莫氏巴貝斯蟲的平均陽性率為43.5%（guanetal.,2012a），羊巴貝斯蟲未定種的為31.66%（wangetal.,2013）。這些結(jié)果表明羊巴貝斯蟲病在我國普遍流行，嚴(yán)重危害我國養(yǎng)羊業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。

中國發(fā)明專利2015100354937公開一種可準(zhǔn)確檢測與區(qū)分羊莫氏巴貝斯蟲和羊巴貝斯蟲未定種新疆株的引物對及檢測試劑盒，該專利試劑盒內(nèi)有可用于檢測羊莫氏巴貝斯蟲的引物對和用于檢測羊巴貝斯蟲未定種新疆株的引物對基因序列對以及探針。該專利的靶基因是18srrna，其檢測需要用很昂貴的real-timepcr儀，其可檢測僅是針對羊巴貝斯蟲未定種和莫氏巴貝斯蟲兩個種，而且在檢測時需要分別在兩個pcr管中進行擴增反應(yīng)，檢測所用的試劑價格也較高。

建立快速、靈敏、準(zhǔn)確、操作方便的檢測方法，以配合該病的防控計劃的實施，是控制該病在我國的流行的先決條件。然而常規(guī)的血涂片顯微鏡檢測方法雖然視為巴貝斯蟲病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但在感染早期或持續(xù)感染期（這些時期染蟲率較低）很難在顯微鏡下檢查出病原。同時在形態(tài)學(xué)上很難區(qū)分不同巴貝斯蟲蟲種，而且操作熟練程度將直接影響診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性；目前建立的pcr、lamp、rlb和real-timepcr等分子檢測方法，無法區(qū)分莫氏巴貝斯蟲lz亞種和莫氏巴貝斯蟲nb亞種，而且操作繁瑣，確定同一份樣本感染的巴貝斯蟲種類需要進行多次檢測，導(dǎo)致容易污染出現(xiàn)假陽性；抗體檢測技術(shù)（如elisa），容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，較難于區(qū)分不同病原的感染。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術(shù)不足的，可用于檢測多種羊巴貝斯蟲的試劑盒。

本發(fā)明的檢測羊巴貝斯蟲的方法是以羊巴貝斯蟲血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)匿名蛋白trap基因作為檢測標(biāo)識。

本發(fā)明的可檢測多種羊巴貝斯蟲的試劑盒中包括有seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、和seqidno.6三對引物。其中：第一對特異性引物為羊巴貝斯蟲未定種的特異性正向和反向引物：

bsp-f：5’-aaataaaggagcacaaacac-3’（seqidno.1）

bsp-r:5’-ggcaagcctcctctcttcttcct-3’(seqidno.2)；

第二對特異引物為莫氏巴貝斯蟲lz亞種的特異性正向和反向引物：

bmlz-f：5’-tatctcaagtaaaggactg-3’(seqidno.3)

bmlz-r：5’-cgcctactctttccgtgggcacct-3’(seqidno.4)；

第三對特異引物為莫氏巴貝斯蟲nb亞種的特異性正向和反向引物：

bmnb-f：5’-tatctcaaacaaaggacag-3’(seqidno.5)；

bmnb-r：5’-tcactaggggttgttacgtt-3’(seqidno.6)。

為方便應(yīng)用，本發(fā)明的可檢測多種羊巴貝斯蟲的試劑盒內(nèi)還有標(biāo)準(zhǔn)羊巴貝斯蟲未定種陽性基因組dna、標(biāo)準(zhǔn)莫氏巴貝斯蟲lz亞種基因組dna、標(biāo)準(zhǔn)莫氏巴貝斯蟲nb亞種基因組dna、標(biāo)準(zhǔn)巴貝斯蟲陰性羊基因組dna和預(yù)混pcr反應(yīng)緩沖液premixtaq。

本發(fā)明的試劑盒及檢測方法是一種多重pcr方法，是以巴貝斯蟲血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)匿名蛋白（thrombospondin-relatedanonymousprotein，trap）基因為檢測標(biāo)識。該基因為是編碼蛋白的基因，本發(fā)明人相關(guān)的實驗表明trap在種和亞種間差異性較18srrna基因大，因此更加適合作為鑒別檢測不同種和亞種的靶標(biāo)基因。因此，通過序列比對，在trap蛋白基因序列的差異區(qū)段，設(shè)計羊巴貝斯蟲未定種、莫氏巴貝斯蟲lz亞種和莫氏巴貝斯蟲nb亞種特異的三對特異引物，用于田間檢測和區(qū)分上述三種巴貝斯蟲種類，同時也可用于實驗室蟲種的鑒定。前期研究中發(fā)明人獲得了羊巴貝斯蟲未定種、莫氏巴貝斯蟲lz亞種和莫氏巴貝斯蟲nb亞種6個蟲株的血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)匿名蛋白（trap）基因的全長序列，序列比對分析結(jié)果顯示，種內(nèi)該基因高度保守（相似性為99.8%-100%），而種/亞種間差異較大，羊巴貝斯蟲未定種與莫氏巴貝斯蟲trap蛋白基因的相似性只有55.4-56.1%；莫氏巴貝斯蟲lz亞種和莫氏巴貝斯蟲nb亞種的相似性為74-74.6%。因此該基因可作為鑒別檢測這些寄生蟲感染的靶標(biāo)基因，用于建立鑒別檢測這三個巴貝斯蟲的分子檢測方法。

本發(fā)明在檢測時是自待檢樣品中提取基因組dna，將dna樣品與pcr反應(yīng)預(yù)混緩沖液premixtaq、pcr用水、羊巴貝斯蟲未定種、莫氏巴貝斯蟲lz亞種和莫氏巴貝斯蟲nb亞種的特異性引物混勻，在pcr儀中進行擴增，擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/ml溴化乙錠或其他核酸染色試劑）中電泳，然后在紫外凝膠成像儀中觀察，根據(jù)擴增產(chǎn)物片段大小即可確認(rèn)被檢樣本中是否感染羊巴貝斯蟲未定種、莫氏巴貝斯蟲lz亞種或莫氏巴貝斯蟲nb亞種。本發(fā)明在一個pcr反應(yīng)管中就可以快速、特異的鑒別檢測同一份樣本中感染多種巴貝斯蟲的種類。

本發(fā)明實際上是一種采用多重pcr擴增技術(shù)建立的區(qū)分巴貝斯蟲種類的分子檢測方法。多重pcr是在同一pcr管中加入多對特異性引物和多個dna模板，引物可以特異性的分別與其對應(yīng)的靶標(biāo)分子模板反應(yīng)，在一個pcr反應(yīng)中同時擴增多個目標(biāo)dna分子，從而實現(xiàn)在同一樣本中同時鑒別檢測多種微生物的目的。相比其他分子檢測技術(shù)，該方法操作簡單、快速，不僅具有高效性，而且節(jié)約成本，適用于病原的快速檢測，使其很快成為科研、臨床診斷的熱點技術(shù)。目前，國內(nèi)尚無鑒別檢測羊巴貝斯蟲未定種、莫氏巴貝斯蟲lz亞種和莫氏巴貝斯蟲nb亞種的多重pcr方法的報道。

本發(fā)明利用頂復(fù)門寄生蟲入侵宿主細(xì)胞過程中的參與蟲體運動和黏附宿主細(xì)胞功能的trap蛋白基因為鑒別檢測三種巴貝斯蟲的靶標(biāo)基因，該基因在種內(nèi)高度保守（相似性為99.8%-100%），而種/亞種間差異較大（種間相似性為55.4-56.1%，亞種間的相似性為74-74.6%）。本發(fā)明準(zhǔn)確利用該基因的這一特點，設(shè)計特異性鑒別檢測這三種寄生蟲感染的多重pcr引物，該引物只能特異性的檢測到對應(yīng)的巴貝斯蟲種，未能檢測到感染羊的其他梨形蟲和無漿體，且靈敏度較高。從而提供了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確、操作方便的可在一個pcr管中同時鑒別檢測羊巴貝斯蟲種類的方法，填補了技術(shù)空白。從現(xiàn)有技術(shù)層面分析，目前，國內(nèi)尚無這樣優(yōu)化的進行鑒別檢測羊巴貝斯蟲的多重pcr方法。本發(fā)明中，所用的特異性引物是基于羊的這三種巴貝斯蟲trap蛋白基因的變異區(qū)設(shè)計的，這一點恰好體現(xiàn)了所選的靶標(biāo)基因在種間差異性較大的特點。通過對該方法條件的優(yōu)化，使本發(fā)明具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，可用于羊和傳播媒介蜱體內(nèi)不同種羊巴貝斯蟲的快速鑒別檢測。

附圖說明

圖1多重pcr引物反應(yīng)性評價結(jié)果。其中m為dna標(biāo)準(zhǔn)分子量dl5000,1為羊巴貝斯蟲未定種、莫氏巴貝斯蟲lz亞種和莫氏巴貝斯蟲nb亞種基因組dna混合物，2為陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品pcr用水。

圖2多重pcr特異性評價結(jié)果。其中m為dna標(biāo)準(zhǔn)分子量dl5000,1-2分別為羊巴貝斯蟲未定種新疆株和敦煌株的基因組dna，3-4分別為莫氏巴貝斯蟲lz亞種臨潭株和天祝株的基因組dna，5-6分別為莫氏巴貝斯蟲nb亞種河北株和寧縣株的基因組dna，7為羊巴貝斯蟲未定種、莫氏巴貝斯蟲lz亞種和莫氏巴貝斯蟲nb亞種基因組dna混合物，8-12分別為尤氏泰勒蟲、呂氏泰勒蟲、羊無漿體、巴貝斯蟲陰性羊基因組dna及陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品pcr水。

圖3多重pcr的敏感性評價結(jié)果。其中m為dna標(biāo)準(zhǔn)分子量dl5000,1-10分別為含三種巴貝斯蟲基因組dna各0.1pg、1pg、10pg、100pg、250pg、500pg、750pg、1ng、5ng、10ng的樣品。

具體實施方式

以下提供本發(fā)明的具體實施方式，本發(fā)明的檢測方法在200μl的pcr管中進行，所用引物和試劑如下：

（1）特異性引物

羊巴貝斯蟲未定種的特異性正向和反向引物：

bsp-f：5’-aaataaaggagcacaaacac-3’

bsp-r:5’-ggcaagcctcctctcttcttcct-3’，擴增的目的片段大小為566bp。

莫氏巴貝斯蟲lz亞種的特異性正向和反向引物：

bmlz-f：5’-tatctcaagtaaaggactg-3’

bmlz-r：5’-cgcctactctttccgtgggcacct-3’，擴增的目的片段大小為1486bp。

莫氏巴貝斯蟲nb亞種的特異性正向和反向引物：

bmnb-f：5’-tatctcaaacaaaggacag-3’

bmnb-r：5’-tcactaggggttgttacgtt-3’，擴增的目的片段大小為2094bp。

（2）標(biāo)準(zhǔn)羊巴貝斯蟲未定種陽性基因組dna（30ng/μl）

（3）標(biāo)準(zhǔn)莫氏巴貝斯蟲lz亞種基因組dna（30ng/μl）

（4）標(biāo)準(zhǔn)莫氏巴貝斯蟲nb亞種基因組dna（30ng/μl）

（5）標(biāo)準(zhǔn)巴貝斯蟲陰性羊基因組dna（30ng/μl）

（6）pcr用水（同時作為陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品）

（7）預(yù)混pcr反應(yīng)緩沖液premixtaq（2×）

（8）6×上樣緩沖液（0.25%溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯青、40%的蔗糖水溶液）

（9）1×tae緩沖液（0.04m的tris-乙酸，0.001m的edta）

（10）1%瓊脂糖凝膠（50ml1×tae緩沖液中加入0.5g瓊脂糖，加熱融化并冷卻到大約60℃后加入溴化乙錠或其他核酸染色試劑）

本發(fā)明的具體操作方法如下：

1、多重pcr引物反應(yīng)性評價

多重pcr反應(yīng)體系為25μl：premixtaq（2×）12.5μl，六條特異性引物混合物1μl（其中bsp-f/bsp-r和bmlz-f/bmlz-r的終濃度為1μmol，bmnb-f/bmnb-r的終濃度為2.5μmol），基因組dna模板2μl（陽性對照反應(yīng)管中加入三種巴貝斯蟲基因組dna混合物，每種巴貝斯蟲基因組dna的終濃度為3ng/μl，陰性質(zhì)控反應(yīng)管中加入pcr用水）,pcr用水9.5μl。將上述反應(yīng)液混勻后在pcr儀中進行擴增，擴增條件為：94℃預(yù)變性3min，然后94℃30s、57℃40s、72℃2min，擴增30個循環(huán)，再72℃延伸10min，最后12℃保存。將pcr產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/ml溴化乙錠或其他核酸染色試劑）電泳，紫外凝膠成像儀中觀察擴增結(jié)果。結(jié)果如圖1顯示，陽性反應(yīng)管中擴增出3條條帶（泳道1），大小大約分別為600、1500和2000bp，與預(yù)期結(jié)果相符；而陰性質(zhì)控反應(yīng)管中沒有條帶擴增出（泳道2），表明本次擴增結(jié)果可靠。另外通過序列測定分析結(jié)果顯示，陽性反應(yīng)管中擴增出的3條帶的序列分別對應(yīng)于羊巴貝斯蟲未定種、莫氏巴貝斯蟲lz亞種和莫氏巴貝斯蟲nb亞種trap蛋白基因的序列，與原序列相似性為100%，表明該多重pcr的引物反應(yīng)性良好。

2、多重pcr特異性評價

在上述1的多重pcr方法反應(yīng)體系中，分別對羊巴貝斯蟲未定種新疆株和敦煌株、莫氏巴貝斯蟲lz亞種臨潭株和天祝株、莫氏巴貝斯蟲nb亞種河北株和寧縣株以及此3個巴貝斯蟲種/亞種基因組dna混合物進行擴增，同時設(shè)立尤氏泰勒蟲、呂氏泰勒蟲、羊無漿體、巴貝斯蟲陰性羊基因組dna及陰性質(zhì)控pcr水的擴增對照（加入的基因組dna終濃度都為3ng/μl）。擴增產(chǎn)物同上進行凝膠電泳，分析該多重pcr方法的特異性。結(jié)果如圖2顯示，羊巴貝斯蟲未定種新疆株和敦煌株反應(yīng)管中擴增出大約600bp的條帶（泳道1-2），莫氏巴貝斯蟲lz亞種臨潭株和天祝株的反應(yīng)管中擴增到大約1500bp的條帶（泳道3-4），莫氏巴貝斯蟲nb亞種河北株和寧縣株反應(yīng)管中擴增出大約2000bp的條帶（泳道5-6），3個巴貝斯蟲種/亞種基因組dna混合物反應(yīng)管中擴增出3條條帶，大小分別約為600、1500和2000bp（泳道7）。而尤氏泰勒蟲、呂氏泰勒蟲、羊無漿體、巴貝斯蟲陰性羊基因組dna及陰性質(zhì)控的pcr水對照反應(yīng)管中沒有擴增出條帶（泳道8-12）。表明該多重pcr方法具有較好的特異性，可用于鑒別檢測這3種巴貝斯蟲感染。

（3）多重pcr敏感性評價

將羊巴貝斯蟲未定種、莫氏巴貝斯蟲lz亞種和莫氏巴貝斯蟲nb亞種的基因組dna分別稀釋成0.1pg/μl、1pg/μl、10pg/μl、100pg/μl、250pg/μl、500pg/μl、750pg/μl、1ng/μl、5ng/μl、10ng/μl10個濃度梯度，每次反應(yīng)分別取3種巴貝斯蟲相同濃度基因組dna各1μl，加入對應(yīng)的pcr管中，同時將pcr用水調(diào)整為8.5μl，其他反應(yīng)條件同前進行多重pcr擴增，評價其敏感性。結(jié)果如圖3顯示，當(dāng)加入的3種巴貝斯蟲基因組dna濃度大于100pg/μl時，可擴增出對應(yīng)的3條帶，即該多重pcr可檢測到3種巴貝斯蟲的最低基因組dna量為100pg，對應(yīng)的染蟲率為0.001%（guanetal.,2008）。結(jié)果表明該多重pcr方法具有較高的敏感性，可用于在田間鑒別檢測這3種巴貝斯蟲的調(diào)查。

（4）多重pcr重復(fù)性分析

用建立的多重pcr方法，分別對巴貝斯蟲未定種新疆株和敦煌株、莫氏巴貝斯蟲lz亞種臨潭株和天祝株及莫氏巴貝斯蟲nb亞種河北株和寧縣株的單一蟲株基因組dna樣本、3種巴貝斯蟲混合基因組dna及巴貝斯蟲陰性羊基因組，在不同時間重復(fù)檢測3次，3次結(jié)果均一致——只擴增到對應(yīng)蟲種預(yù)期大小的目的條帶，巴貝斯蟲陰性羊基因組未擴增出條帶，表明建立的多重pcr檢測方法結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好。

（5）田間樣本的檢測

應(yīng)用本發(fā)明建立的多重pcr方法對采自新疆和甘肅省的750份綿羊樣本進行檢測。結(jié)果顯示，在新疆采集的379份綿羊基因組中，檢測到7份（1.85%）羊巴貝斯蟲未定種的感染，沒有檢測到莫氏巴貝斯蟲感染的樣本；在甘肅采集的271份綿羊基因組中，檢測到1份（0.37%）羊巴貝斯蟲未定種感染的樣本，10份（3.69%）莫氏巴貝斯蟲lz亞種感染的樣本。本次田間樣本的檢測沒有檢測到莫氏巴貝斯蟲nb亞種感染的樣本，這些結(jié)果與每種巴貝斯蟲媒介蜱的分布、采樣地點及前期使用lamp、rlb和real-time方法調(diào)查的結(jié)果基本相一致。

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所

<120>一種可檢測多種羊巴貝斯蟲的試劑盒

<160>6

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列bsp-f

<400>

aaataaaggagcacaaacac20

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列bsp-r

<400>

ggcaagcctcctctcttcttcct23

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列bmlz-f

<400>

tatctcaagtaaaggactg19

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列bmlz-r

<400>

cgcctactctttccgtgggcacct24

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列bmnb-f

<400>

tatctcaaacaaaggacag19

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列bmnb-r

<400>

tcactaggggttgttacgtt20