用于檢測犬巴貝西蟲的引物組合、試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測犬巴貝西蟲的引物組合、試劑盒及檢測方法，屬于生物檢測【技術領域】。本發(fā)明針對犬巴貝西蟲18s RNA基因序列設計套式PCR引物組合，引物特異性強，不受其他非目的基因的干擾，能快速、高效、準確定性犬巴貝西蟲的轉錄水平。本發(fā)明定性檢測犬巴貝西蟲的方法簡單、精確，可在4小時內(nèi)準確檢測出最低為10拷貝的DNA樣本，檢測靈敏度高，同等實驗條件下對標準品的梯度檢測中套式PCR的靈敏度比普通PCR高出1000倍，實際臨床檢測中套式PCR的靈敏度比普通PCR高3～10個百分點。
【專利說明】用于檢測犬巴貝西蟲的引物組合、試劑盒及檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明具體涉及一種用于檢測犬巴貝西蟲的引物組合，以及含有該引物組合的試 劑盒，同時還涉及采用該引物組合檢測犬巴貝西蟲的方法，屬于生物檢測【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 巴貝西蟲病是一種經(jīng)蜱傳播的血源性原蟲病，廣泛發(fā)生于各種家畜。其在家畜體 內(nèi)單個或成對寄生于紅細胞內(nèi)，有可能引起嚴重的貧血和血紅蛋白尿癥。引起犬的巴貝西 蟲病的病原體有3種，即犬巴貝西蟲（Babeisa canis)、韋氏巴貝西蟲（B. vitlli)和吉氏巴 貝西蟲（B.gibsoni)。犬巴貝西蟲分布于歐洲、美洲和印度，韋氏巴貝西蟲分布于南美洲，吉 氏巴貝西蟲分布于亞洲。我國主要流行的蟲種為吉氏巴貝西蟲，目前在國內(nèi)分布廣泛，有蜱 滋生的地方，春、夏、秋季均可發(fā)病。
[0003] 目前，血液原蟲檢測方法主要有涂片染色鏡檢、酶聯(lián)免疫反應、間接熒光、LAMP、多 聚酶鏈式反應（PCR)等。涂片染色鏡檢法對檢測設備的要求較低，操作簡便，但是檢測率較 低。LAMP技術檢測簡單快速，肉眼即可直接觀察結果，但易于出現(xiàn)假陽性，且不易鑒定蟲體 的種類。而PCR技術以其較高的特異性和靈敏性被認為是檢測巴貝西蟲的最有效方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測犬巴貝西蟲的引物組合。
[0005] 同時，本發(fā)明還提供一種用于檢測犬巴貝西蟲的試劑盒。
[0006] 最后，本發(fā)明提供一種檢測犬巴貝西蟲的方法。
[0007] 為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：
[0008] 一種用于檢測犬巴貝西蟲的引物組合，由外引物和內(nèi)引物組成，外引物為：
[0009] 正向引物：5' -GGCTTTCGGTGATTCATA-3'（如 SEQ ID N0:1 所示），
[0010] 反向引物：5' -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3'（如 SEQ ID N0:2 所示）；
[0011] 內(nèi)引物為：
[0012] 正向引物：5' -TGGACCATTCAAGTTTCTG-3'（如 SEQ ID N0:3 所示），
[0013] 反向引物：5' -TCGTCTTCGATCCCCTA-3'（如 SEQ ID N0:4 所示）。
[0014] 一種用于檢測犬巴貝西蟲的試劑盒，主要包括由外引物和內(nèi)引物組成的引物組 合，外引物為：
[0015] 正向引物：5，-GGCTTTCGGTGATTCATA-3，，
[0016] 反向引物：5 ' -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3 ' ；
[0017] 內(nèi)引物為：
[0018] 正向引物：5 ' -TGGACCATTCAAGTTTCTG-3 '，
[0019] 反向引物：5 ' -TCGTCTTCGATCCCCTA-3 '。
[0020] 具體的，用于檢測犬巴貝西蟲的試劑盒，還可以包括Taq酶、Mg2+、mix dNTP、緩沖 液(如10XPCR Buffer)、DNA Marker (標準品）及試劑盒反應條件說明書等。
[0021] 更具體的，用于檢測犬巴貝西蟲的試劑盒，包括：Taq酶100UU0XPCR Buffer500 μ L、25mmol. IZ1Mg2+鹽 500 μ LUOmmol. T1Iiiix dNTPlOO μ UlOpmol · μ Γ1 引物組 合(包括內(nèi)外引物正反向）各100 μ L。
[0022] -種檢測犬巴貝西蟲的方法，包括以下步驟：
[0023] (1)以待檢測DNA樣品為模板，采用引物組合進行套式PCR擴增；
[0024] (2)取擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，根據(jù)電泳結果判定樣品中是否含有犬巴貝西蟲；
[0025] 所述步驟（1)中引物組合由外引物和內(nèi)引物組成，外引物為：
[0026] 正向引物：5 ' -GGCTTTCGGTGATTCATA-3 '，
[0027] 反向引物：5' -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3' ；
[0028] 內(nèi)引物為：
[0029] 正向引物：5 ' -TGGACCATTCAAGTTTCTG-3 '，
[0030] 反向引物：5，-TCGTCTTCGATCCCCTA-3，。
[0031] 所述步驟（1)中采用引物組合進行套式PCR擴增的反應體系為：
[0032] 第一次 PCR :50μ L 體系，Taq 酶 1U、10XPCR Buffer5y L、25mmol/L Mg2 + 4y L、 10111111〇1/111^(1階1314 1^、10?111〇1/^1^外引物正反向引物各14 1^、待檢測0嫩樣品14 1^，加 ddH20 至 50 μ L ;
[0033] 第二次 PCR :50μ L 體系，Taq 酶 1U、10XPCR Buffer5y L、25mmol/L Mg2 + 4y L、 lOmmol/L mix dNTPlyL、10pmol/yL內(nèi)引物正反向引物各lyL、第一次PCR擴增產(chǎn)物 1 μ L，加 ddH20 至 50 μ L。
[0034] 所述的第一次PCR的反應程序為：94°C預變性5min，94°C變性30s、56°C退火30s、 72°C延伸lmin，進行25個循環(huán)，72°C延伸10min，冷卻結束反應。
[0035] 所述的第二次PCR的反應程序為：95°C預變性5min，94°C變性30s、55°C退火30s、 72°C延伸lmin，進行30個循環(huán)，72°C延伸7min，冷卻結束反應。
[0036] 所述步驟（2)中凝膠電泳采用I. 0%ΕΒ染色的瓊脂糖凝膠，以便于電泳后在紫外燈 下觀察電泳結果。與DNA Marker進行對照，當電泳池中出現(xiàn)大小為658bp的片段，即可判 定樣品中含有犬巴貝西蟲遺傳物質(zhì)。
[0037] 本發(fā)明的有益效果：
[0038] 本發(fā)明針對犬巴貝西蟲18s RNA基因序列設計套式PCR引物組合，該引物的特異 性強，不受其他非目的基因的干擾，能快速、高效、準確定性犬巴貝西蟲的轉錄水平。
[0039] 本發(fā)明用于檢測犬巴貝西蟲的試劑盒使用方便，便于攜帶，適用于多次檢測。
[0040] 本發(fā)明定性檢測犬巴貝西蟲的方法簡單、精確，可在4小時內(nèi)準確檢測出最低為 10拷貝的DNA樣本，檢測靈敏度高，同等實驗條件下對標準品的梯度檢測中套式PCR的靈敏 度比普通PCR高出1000倍，實際臨床檢測中套式PCR的靈敏度比普通PCR高3?10個百 分點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041] 圖1為本發(fā)明實施例3中擴增產(chǎn)物的電泳圖像；
[0042] 圖2為試驗例1中特異性擴增犬巴貝西蟲的電泳圖像；
[0043] 圖3為試驗例2中檢測犬巴貝西蟲套式PCR方法靈敏度的電泳圖像；
[0044] 圖4為試驗例2中檢測犬巴貝西蟲普通PCR方法靈敏度的電泳圖像；
[0045] 圖5為試驗例3中套式PCR與普通PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖像。

【具體實施方式】
[0046] 下述實施例僅對本發(fā)明作進一步詳細說明，但不構成對本發(fā)明的任何限制。
[0047] 實施例1
[0048] 本實施例中用于檢測犬巴貝西蟲的引物組合，由外引物和內(nèi)引物組成，外引物 為：
[0049] 正向引物：5 ' -GGCTTTCGGTGATTCATA-3 '，
[0050] 反向引物：5, -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3,；
[0051] 內(nèi)引物為：
[0052] 正向引物：5 ' -TGGACCATTCAAGTTTCTG-3 '，
[0053] 反向引物：5 ' -TCGTCTTCGATCCCCTA-3 '。
[0054] 實施例2
[0055] 本實施例中用于檢測犬巴貝西蟲的試劑盒，包括由外引物和內(nèi)引物組成的引物 組合，以及 Taq 酶 100UU0XPCR Buffer500 μ l、25mmol. T1Mg2+鹽 500 μ LUOmmol. PmiX dNTPlOO μ L、IOpmol · μ Γ1弓丨物組合(包括內(nèi)外引物正反向）各100 μ L、標準品25 μ L及試 劑盒反應條件說明書。
[0056] 所述的外引物為：
[0057] 正向引物：5 ' -GGCTTTCGGTGATTCATA-3 '，
[0058] 反向引物：5, -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3,；
[0059] 所述的內(nèi)引物為：
[0060] 正向引物：5 ' -TGGACCATTCAAGTTTCTG-3 '，
[0061] 反向引物：5 ' -TCGTCTTCGATCCCCTA-3 '。
[0062] 實施例3
[0063] 本實施例中檢測犬巴貝西蟲的方法，包括以下步驟：
[0064] (1)以待檢測DNA樣品為模板，采用引物組合進行套式PCR擴增，引物組合由外引 物和內(nèi)引物組成，外引物為：
[0065] 正向引物：5，-GGCTTTCGGTGATTCATA-3，，
[0066] 反向引物：5，-CCTTCCGTCAATTCCTTT-3，，
[0067] 內(nèi)引物為：
[0068] 正向引物：5，-TGGACCATTCAAGTTTCTG-3，，
[0069] 反向引物：5, -TCGTCTTCGATCCCCTA-3,；
[0070] 第一次PCR擴增的反應體系為：50 μ L體系，Taq酶1U、10XPCR Buffer5 μ L、 25mmol/LMg2 + 4 μ L、10mmol/L mix dNTPI μ L、IOpmoI/ μ L 外引物正反向引物各 I μ L、待檢 測DNA樣品1 μ L，加 CldH2O至50 μ L，反應程序為：94°C預變性5min，94°C變性30s、56°C退 火30s、72°C延伸lmin，進行25個循環(huán)，72°C延伸lOmin，冷卻結束反應；
[0071] 第二次PCR擴增的反應體系為：50 μ M本系，Taq酶1U、10XPCR Buffer5 μ L、 25mmol/LMg2 + 4 μ L、10mmol/L mix dNTPl μ L、10pmol/y L 內(nèi)引物正反向引物各 I μ L、第一 次PCR擴增產(chǎn)物1 μ L，加 CldH2O至50 μ L，反應程序為：95°C預變性5min，94°C變性30s、55°C 退火30s、72°C延伸lmin，進行30個循環(huán)，72°C延伸7min，冷卻結束反應；
[0072] (2)取5 μ L套式PCR擴增產(chǎn)物在I. 0%ΕΒ染色的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳電壓為 80V，時間為20分鐘，電泳后在紫外燈下觀察結果，與DNA Marker進行對照，發(fā)現(xiàn)在500? 750bp之間出現(xiàn)大小為658bp的特性條帶(見圖1，圖中M為DNA Marker，1、陽性品外引物擴 增產(chǎn)物，2、陽性品內(nèi)引物擴增產(chǎn)物，3、雙蒸水外引物擴增產(chǎn)物，4、雙蒸水內(nèi)引物擴增產(chǎn)物)， 判定該樣品中含有犬巴貝西蟲遺傳物質(zhì)。
[0073] 試驗例1
[0074] 將犬巴貝西蟲陽性品、滅菌三蒸水、巴氏桿菌、附紅細胞體、弓形蟲、鏈球菌及反應 液中不加模板的陰性對照反應體系置于同一條件下進行套式PCR擴增，具體參見實施例3 中步驟（1)，將第二次PCR擴增產(chǎn)物5 μ L用于進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳結果見圖2， 圖中自右至左依次為DNA Marker、犬巴貝西蟲陽性品套式PCR結果、陰性對照、滅菌三蒸 水、巴氏桿菌、附紅細胞體、弓形蟲、鏈球菌及DNA Marker。從圖2可知，犬巴貝西蟲陽性品 套式PCR結果的特性條帶介于Marker750bp與Marker500bp條帶之間。其他陰性對照、滅 菌三蒸水、巴氏桿菌、附紅細胞體、弓形蟲、鏈球菌未出現(xiàn)近似位置特性條帶。
[0075] 試驗例2
[0076] 將犬巴貝西蟲陽性標準品IO6?10°拷貝作為模板分別加入套式PCR反應體系中， 體系置于同一條件下進行套式PCR擴增，將第二次PCR擴增產(chǎn)物5 μ L用于進行瓊脂糖凝膠 電泳檢測，同試驗例1。電泳結果見圖3,圖中自右至左依次為DNA Marker、陽性犬DNA制成 的標準品（1?6依次為IO6?10°拷貝樣品套式PCR結果）及DNA Marker。從圖3可知， IO6?IO1拷貝樣品套式PCR結果均出現(xiàn)特異性條帶，介于Marker750bp與Marker500bp條 帶之間，10°拷貝樣品套式PCR結果未出現(xiàn)近似位置特性條帶。
[0077] 將犬巴貝西蟲陽性標準品IO8?IO1拷貝作為模板分別加入普通PCR反應體系中， 體系置于同一條件下進行普通PCR擴增（具體操作參見專利申請?zhí)枺?01110157247. 0)，將 PCR擴增產(chǎn)物5 μ 1用于進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳結果見圖4,圖中自右至左依次為 DNAMarker、陽性犬DNA制成的標準品（1?8依次為IO8?IO1拷貝樣品套式PCR結果)。從圖 4可知，IO 8?IO4拷貝樣品PCR結果均出現(xiàn)特異性條帶，介于Marker250bp與Marker500bp 條帶之間，而IO3?IO1拷貝樣品PCR結果未出現(xiàn)近似位置特性條帶。
[0078] 試驗例3
[0079] 1、發(fā)病情況
[0080] 河南某地一小型獵犬，雄性，4歲，已按正常程序免疫。至病情嚴重入院，臨床觀察 該犬只精神沉郁，少食或者不食，體溫高達40. 5°C，可視粘膜為貧血高度黃疸，尿液呈濃茶 水色。發(fā)病前一周曾在山區(qū)活動，入院時在犬只耳根處發(fā)現(xiàn)蜱蟲，疑似血源性原蟲感染。但 經(jīng)鏡檢未發(fā)現(xiàn)蟲體，采用普通PCR檢測方法也未出現(xiàn)陽性結果(具體操作參見專利申請?zhí)枺?201110157247. 0)，遂采用套式PCR檢測方法，具體步驟為：
[0081] (1)待檢測DNA樣品的制備：于犬前肢隱靜脈取300 μ L抗凝血，采用全血DNA提 取試劑盒（ΤΑΚΑΤΑ公司），按說明書操作方法提取DNA樣品；
[0082] (2)以待檢測DNA樣品為模板，采用引物組合進行套式PCR擴增，引物組合由外引 物和內(nèi)引物組成，外引物為：
[0083] 正向引物：5，-GGCTTTCGGTGATTCATA-3，，
[0084] 反向引物：5 ' -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3 '，
[0085] 內(nèi)引物為：
[0086] 正向引物：5，-TGGACCATTCAAGTTTCTG-3，，
[0087] 反向引物：5' -TCGTCTTCGATCCCCTA-3' ；
[0088] 第一次PCR擴增的反應體系為：50 μ L體系，Taq酶1U、10XPCR Buffer5 μ L、 25mmol/LMg2 + 4 μ L、10mmol/L mix dNTPI μ L、IOpmoI/ μ L 外引物正反向引物各 I μ L、待檢 測DNA樣品1 μ L，加 CldH2O至50 μ L，反應程序為：94°C預變性5min，94°C變性30s、56°C退 火30s、72°C延伸lmin，進行25個循環(huán)，72°C延伸lOmin，冷卻結束反應；
[0089] 第二次PCR擴增的反應體系為：50 μ L體系，Taq酶1U、10XPCR Buffer5 μ L、 25mmol/LMg2 + 4 μ L、10mmol/L mix dNTPl μ L、10pmol/y L 內(nèi)引物正反向引物各 I μ L、第一 次PCR擴增產(chǎn)物1 μ L，加 CldH2O至50 μ L，反應程序為：95°C預變性5min，94°C變性30s、55°C 退火30s、72°C延伸lmin，進行30個循環(huán)，72°C延伸7min，冷卻結束反應；
[0090] (3)取5 μ L套式PCR擴增產(chǎn)物在I. 0%ΕΒ染色的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳電壓為 80V，時間為20分鐘，電泳后在紫外燈下觀察結果，與DNA Marker進行對照，發(fā)現(xiàn)在500? 750bp之間出現(xiàn)大小為658bp的特性條帶(見圖5,圖中M為DNA Marker，1、DNA樣品套式 PCR檢測結果，2、DNA樣品普通PCR檢測結果，3、雙蒸水對照，4、陰性對照)，擴增產(chǎn)物的核苷 酸序列如SEQ ID N0:2所示，判定該樣品中含有犬巴貝西蟲遺傳物質(zhì)。
[0091] 2、診斷與治療
[0092] 根據(jù)流行病學及臨床癥狀觀察，由于鏡檢未發(fā)現(xiàn)蟲體，結合套式PCR檢測結果，初 步判定該犬只感染犬巴貝西蟲。
[0093] 試驗例4
[0094] 取豫西地區(qū)(洛陽、三門峽、平頂山）犬血液樣品進行犬巴貝西蟲檢測，分別采用套 式PCR檢測方法及普通PCR檢測方法(檢測步驟同試驗例3)，檢測結果詳見下表1。
[0095] 表1豫西地區(qū)犬血液樣品中犬巴貝西蟲檢測結果

【權利要求】
1. 一種用于檢測犬巴貝西蟲的引物組合，其特征在于：由外引物和內(nèi)引物組成，外弓丨 物為： 正向引物：5 ' -GGCTTTCGGTGATTCATA-3 '， 反向引物：5' -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3' ； 內(nèi)引物為： 正向引物：5 ' -TGGACCATTCAAGTTTCTG-3 '， 反向引物：5' -TCGTCTTCGATCCCCTA-3'。
2. -種用于檢測犬巴貝西蟲的試劑盒，其特征在于：主要包括由外引物和內(nèi)引物組成 的引物組合，外引物為： 正向引物：5' -GGCTTTCGGTGATTCATA-3'， 反向引物：5' -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3' ； 內(nèi)引物為： 正向引物：5' -TGGACCATTCAAGTTTCTG-3'， 反向引物：5' -TCGTCTTCGATCCCCTA-3'。
3. 根據(jù)權利要求2所述的用于檢測犬巴貝西蟲的試劑盒，其特征在于：還包括Taq酶、 Mg2+、mix dNTP 及緩沖液。
4. 根據(jù)權利要求3所述的用于檢測犬巴貝西蟲的試劑盒，其特征在于：包括：Taq酶 100比10\卩0?811打6沾0(^1、25臟〇1.171]\%2+鹽50(^1^10臟〇1.17 111^叉（1^13各10(^1^ lOpmol · μ I71 引物組合各 100 μ L。
5. -種檢測犬巴貝西蟲的方法，其特征在于：包括以下步驟： (1) 以待檢測DNA樣品為模板，采用引物組合進行套式PCR擴增； (2) 取擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，根據(jù)電泳結果判定樣品中是否含有犬巴貝西蟲； 所述步驟（1)中引物組合由外引物和內(nèi)引物組成，外引物為： 正向引物：5 ' -GGCTTTCGGTGATTCATA-3 '， 反向引物：5 ' -CCTTCCGTCAATTCCTTT-3 ' ； 內(nèi)引物為： 正向引物：5 ' -TGGACCATTCAAGTTTCTG-3 '， 反向引物：5 ' -TCGTCTTCGATCCCCTA-3 '。
6. 根據(jù)權利要求5所述的檢測犬巴貝西蟲的方法，其特征在于：所述步驟（1)中采用引 物組合進行套式PCR擴增的反應體系為： 第一次PCR:50yL體系，Taq酶 1U、10XPCR Buffer5yL、25mmol/L Mg2 + 4yL、10mmol/ 1^11^(1階1314 1^、10?111〇1/^1^外引物正反向引物各14 1^、待檢測0嫩樣品14 1^，加(1(1!120至 50 μ L ； 第二次PCR:50yL體系，Taq酶 1U、10XPCR Buffer5yL、25mmol/L Mg2 + 4yL、10mmol/ L mix (^?14 1^、10?!11〇1/^1^內(nèi)引物正反向引物各14 1^第一次？0?擴增產(chǎn)物14 1^力口 ddH20 至 50μ L。
7. 根據(jù)權利要求6所述的檢測犬巴貝西蟲的方法，其特征在于：所述的第一次PCR的 反應程序為：941：預變性51^11，941：變性3〇8、561：退火3〇8、721：延伸11^11，進行25個循 環(huán)，72°C延伸lOmin，冷卻結束反應。
8. 根據(jù)權利要求6所述的檢測犬巴貝西蟲的方法，其特征在于：所述的第二次PCR的 反應程序為：95°C預變性5min，94°C變性30s、55°C退火30s、72°C延伸lmin，進行30個循 環(huán)，72°C延伸7min，冷卻結束反應。
9. 根據(jù)權利要求5所述的檢測犬巴貝西蟲的方法，其特征在于：所述步驟（2)中凝膠電 泳采用1. 〇%EB染色的瓊脂糖凝膠。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293903SQ201410105100
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年3月20日 優(yōu)先權日:2014年3月20日
【發(fā)明者】楊自軍, 尚澤松, 張才, 賀鵬飛, 田麗萍, 汪紀倉, 王宏偉, 劉鳳軍, 爨淑楠 申請人:河南科技大學