專利名稱：細胞分裂素氧化酶的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及來自玉米(Zea mays)、其完整氨基酸序列已闡明的純化植物細胞分裂素氧化酶(ckx1)，還涉及對編碼該酶的核苷酸序列的分離。本發(fā)明進一步涉及調(diào)節(jié)該酶和其它相似酶類在植物中的濃度從而影響植物細胞的生長和死亡的最新方法。本發(fā)明的應(yīng)用包括通過調(diào)節(jié)ckx1在植物根部的產(chǎn)生而影響發(fā)病機制、通過調(diào)節(jié)而改變植物習(xí)性以及可用于植物生化分析的ckx1酶大規(guī)模生產(chǎn)。
植物細胞分裂素是一類植物激素，可與植物生長素共同控制細胞分裂、促進由愈傷組織發(fā)育出苗、解除休眠釋放側(cè)芽、并以各種不同方式調(diào)節(jié)植物的結(jié)構(gòu)和生長。大多數(shù)高等植物的天然活性細胞分裂素均為玉米素(6-(4-羥基-3-甲基丁-反式-2-烯基氨基)嘌呤)游離堿(下文稱之為Z)及其9-核糖核苷(下文稱之為ZR)。因此植物組織通常包含Z、ZR和衍生自生物合成前體的N6-(Δ2-異戊烯)腺嘌呤(下文稱之為iP)。細胞分裂素水平升高均與高等植物中種子發(fā)育有關(guān)，并已證實與玉米粒和其它谷物種子發(fā)育中胚乳內(nèi)的最大有絲分裂活性一致。外源細胞分裂素的應(yīng)用(通過莖注射)已顯示與玉米粒的產(chǎn)量增加直接相關(guān)。此外，用根癌土壤桿菌ipt基因(編碼能增加Z和ZR的胞內(nèi)產(chǎn)量的二甲基丙烯焦磷酸酯5’-ATP轉(zhuǎn)移酶)轉(zhuǎn)化的植物細胞顯示有相應(yīng)于內(nèi)源細胞分裂素水平因酶誘導(dǎo)而增加的生長增加。因此，細胞分裂素對植物生長的生物重要性使得能夠有商業(yè)價值和科研價值地控制高等植物細胞中細胞分裂素的水平。
細胞分裂素氧化酶的作用是植物細胞中細胞分裂素有效分解代謝的主要方式。使細胞分裂素失活是通過在分子氧存在的情況下自細胞分裂素游離堿(或它們的核糖核苷)氧化除去側(cè)鏈而完成的。有iP參與的這一反應(yīng)的一個實例已顯示于

圖1a。盡管該反應(yīng)的確切化學(xué)機制尚不明確，但有人推測該酶在iP去質(zhì)子化為N6-(Δ2-異戊烯亞胺)嘌呤的過程中被還原。嘌呤然后經(jīng)水解變成腺嘌呤和中間產(chǎn)物3-甲基-2-丁烯醛(圖1b)。
植物細胞中負責(zé)還原酶重新氧化的電子受體尚不清楚，但分子氧可在體外擔(dān)任此角色?；蛘?，還原酶可在體外由中間產(chǎn)物如Cu+2/咪唑復(fù)合物或人工電子受體二氯靛酚(DCPIP)重新氧化。
已知細胞分裂素氧化酶可在細胞分裂后從植物細胞中除去細胞分裂素，并有人推測它參與衰老過程。細胞分裂素氧化酶活性已顯示與玉米粒中胚乳細胞的有絲分裂正相關(guān)，也與天然細胞分裂素濃度的增加相關(guān)。氧化酶活性在內(nèi)源性細胞分裂素水平上升后很快增強。已證實與人為增加轉(zhuǎn)基因煙草中細胞分裂素水平有類似的相關(guān)性。因此認為細胞分裂素氧化酶的表達參與維持正在發(fā)育的植物細胞中激素體內(nèi)平衡。因為細胞分裂素氧化酶看起來象是底物誘導(dǎo)型，它們以負調(diào)節(jié)方式將上升的細胞分裂素水平降至基礎(chǔ)水平。這種細胞分裂素氧化酶活性的底物誘導(dǎo)作用是嘗試通過在轉(zhuǎn)基因植物中增加細胞分裂素的生產(chǎn)而控制細胞分裂素水平的有效商業(yè)應(yīng)用的明顯障礙。
已對以下多種植物物種中的細胞分裂素氧化酶進行了討論，這些植物包括長春花、豆類(菜豆和棉豆)、小麥、煙草、麝香石竹、大豆、和玉米。所有這些植物的細胞分裂素氧化酶對iP和Z均有相似的底物偏好性，而對大分子的、還原的、或芳香族側(cè)鏈細胞分裂素只有有限的活性或根本無活性。所有這些酶在有銅和咪唑存在時均表現(xiàn)出增強的活性。然而，這些酶顯示在特異性活性和分子量上有實質(zhì)性差異。這一點讓人聯(lián)想到與物種之間和物種內(nèi)該蛋白的糖基化和未糖基化變體的存在有關(guān)。
在糖基化細胞分裂素氧化酶中，高度糖基化的蛋白質(zhì)可呈現(xiàn)一種富含糖基的表面，它可阻止針對肽表位的抗體的形成。在這些情況下被針對而產(chǎn)生抗體的糖基表位是非特異性的，可妨礙經(jīng)免疫層析或其它基于免疫學(xué)的方法對蛋白質(zhì)或含其編碼基因的克隆進行分離。此前報道的一項通過對玉米cDNA文庫表達產(chǎn)物進行免疫篩選分離玉米細胞分裂素基因(ckx1)的嘗試(Burch，1992)已告失敗。
正如已證實的，細胞分裂素氧化酶的完整氨基酸序列和編碼DNA是現(xiàn)代植物生理學(xué)的一項長期任務(wù)。
發(fā)明簡述因此本發(fā)明的目標(biāo)之一是提供一種大量產(chǎn)生重組細胞分裂素氧化酶的方法以研究細胞分裂素氧化酶對植物生長和代謝的影響。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供體內(nèi)調(diào)節(jié)植物細胞中細胞分裂素氧化酶生產(chǎn)的方法，以便調(diào)節(jié)植物細胞中內(nèi)源性細胞分裂素水平以達到改變病原體抗性和植物生長特點的效果。
因此本發(fā)明涉及一種分離的和基本純化的新型植物細胞分裂素氧化酶(ckx1)，其分子量更優(yōu)選約60KD，序列長度約505-565個氨基酸殘基，優(yōu)選525-545個氨基酸殘基，更優(yōu)選534個氨基酸殘基，并具有細胞分裂素失活活性。本發(fā)明也涉及具有包含ckx1氨基酸序列(SEQID NO1)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及具有細胞分裂素失活活性并包含ckx1氨基酸序列中至少長約20個氨基酸殘基的一部分的蛋白質(zhì)，所包含的ckx1序列部分賦予該蛋白質(zhì)具有細胞分裂素失活活性。本發(fā)明涉及具有細胞分裂素失活活性并與ckx1有至少65％序列相同，更優(yōu)選與ckx1有至少95％序列相同，而剩下的氨基酸被保守置換的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明更涉及編碼ckx1或其細胞分裂素氧化同系物的基本分離的核酸聚合物。該核酸聚合物更優(yōu)選具有SEQ ID NO3的核酸序列或述于SEQ ID NO10的其可預(yù)測變體。本發(fā)明也涉及含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或由SEQ ID NO10描述的核酸聚合物長度至少為60bp的一部分的基本分離的核酸聚合物。此外，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、或由SEQ ID NO10描述的核酸聚合物，在0.5X-2XSSC緩沖液、0.1％SDS和55-65℃的條件下能雜交上的核酸聚合物。編碼細胞分裂素氧化酶并符合上述要求的核酸聚合物可編碼與ckx1有足夠相似性、通常在生化領(lǐng)域的技術(shù)人員看來為ckx1等價體的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也涉及摻入了含上述DNA的載體的宿主細胞和用此宿主細胞生產(chǎn)ckx1或其同系物的方法。此方法優(yōu)選包括先將編碼上述ckx1或其片段或其同系物的DNA與適當(dāng)啟動子(如RB7根特異性啟動子，Conkling，M.A.等，美國專利第5,459,252號；或CaMV35S啟動子，Odell，1985)或與啟動子聯(lián)合體(Hoffman，專利第5,106,739)連接至適當(dāng)DNA載體(如根癌土壤桿菌中使用pBIN19)中。再將此載體構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化進宿主細胞，如巴斯德畢赤酵母(述于實施例2)。也可將它摻入一個次級載體以轉(zhuǎn)化進宿主細胞，如根癌土壤桿菌，以及將它轉(zhuǎn)化進植物細胞宿主(述于實施例4，以煙草為例)。
或者，為了生產(chǎn)大量酶，可按實施例2或Su等(1996)和Skory等(1996)的方法將編碼ckx1的DNA或其部分轉(zhuǎn)化進畢赤酵母。當(dāng)轉(zhuǎn)化進畢赤酵母時，由于在ckx1編碼區(qū)的N-末端存在分泌信號肽而使ckx1分泌至培養(yǎng)基中。因此，無需裂解便可從大量畢赤酵母培養(yǎng)物中輕易純化活性酶。以此方式生產(chǎn)的ckx1可按實施例3的方法用于生化分析中，以確定生物樣品中細胞分裂素的未知濃度。
經(jīng)上述方法產(chǎn)生的植物宿主細胞可再生成完整植物。根據(jù)載體構(gòu)建體中所用啟動子的不同，ckx1可組成型生產(chǎn)或經(jīng)天然或人為環(huán)境因子而誘導(dǎo)型生產(chǎn)。含組織特異性或創(chuàng)傷特異性啟動子及ckx1編碼序列的載體所轉(zhuǎn)化的植物可對某些細胞分裂素關(guān)聯(lián)的植物病理學(xué)如某些線蟲或真菌的感染表現(xiàn)出有所改變的抗性。
此處所述發(fā)現(xiàn)為以下方法的發(fā)展提供了重要的分析工具和關(guān)鍵的內(nèi)在聯(lián)系，借助于該方法，可以控制細胞分裂素氧化酶活性而以預(yù)期方式抑制或增強植物中各種細胞生長功能?？赡艿膽?yīng)用包括培育谷物產(chǎn)量增加、抗病性增強，或具有更理想的次級生長特點的商用植物。該酶及其編碼核酸在植物細胞生長周期和衰老的研究中具有重要利用價值。此外，還可發(fā)現(xiàn)有關(guān)ckx1及其基因在其它制藥學(xué)和農(nóng)業(yè)上的很多應(yīng)用。該酶、其表達方法、及其應(yīng)用方法均在下文詳述。
本發(fā)明的其它特點和目標(biāo)有一部分對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是明顯的，一部分將在后文指出。
附圖簡述、序列特征及定義本發(fā)明由附圖作進一步公開和舉例說明。
圖1a & b顯示由細胞分裂素氧化酶催化的反應(yīng)的一個實例(Browhlee，1975)，及其推測機制(如上述，基于Hare，1994之文獻)。
圖2顯示RT-PCR DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳，證實ckx1基因的內(nèi)含子已得到正確識別。
圖3顯示用ckx1分析溶液中細胞分裂素濃度時得到的標(biāo)準分光光度吸收曲線(590nm)。
圖4為DNA質(zhì)粒pJL7的圖解。
圖5為DNA質(zhì)粒pBI121的圖解。
圖6為DNA質(zhì)粒pROM8的圖解。
圖7為DNA質(zhì)粒pROM9的圖解。
圖8為DNA質(zhì)粒pROM22的圖解。
圖9為DNA質(zhì)粒pROM24的圖解。
圖10為DNA質(zhì)粒pROM26的圖解。
圖11為DNA質(zhì)粒pROM28的圖解。
圖12為DNA質(zhì)粒pROM29的圖解。
圖13為DNA質(zhì)粒pROM30的圖解。
圖14為DNA質(zhì)粒pROM32的圖解。
圖15為DNA質(zhì)粒pROM43的圖解。
氨基酸和核苷酸的所有序列標(biāo)志縮寫均與USPTO和WIPO標(biāo)準一致。
SEQ ID NO1列出了衍生自玉米的天然ckx1的氨基酸序列。該序列是從基因組DNA衍生的編碼ckx1的核苷酸序列預(yù)測而得。
SEQ ID NO2列出了編碼ckx1的基因組DNA序列，包括內(nèi)含子。
SEQ ID NO3列出了編碼ckx1的DNA序列，排除了內(nèi)含子。該序列已在實施例2中重建于pROM22中。
SEQ ID NO4列出了ckx1的一個內(nèi)部胰酶消化片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO5列出了ckx1的一個內(nèi)部胰酶消化片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO6列出了用于分離編碼ckx1的基因組DNA(如實施例1所述)的簡并DNA探針的核酸序列。注意序列中命名為“n”的殘基均為人工堿基次黃嘌呤核苷(I)。按常規(guī)約定指示序列簡并性。
SEQ ID NO7列出了用于分離編碼ckx1的基因組DNA(如實施例1所述)的簡并DNA探針的核酸序列。注意序列中命名為“n”的殘基均為人工堿基次黃嘌呤核苷(I)。按常規(guī)方法指示序列簡并性。
SEQ ID NO8列出了用于分離編碼ckx1的基因組DNA(如實施例1所述)的簡并DNA探針的核酸序列。注意序列中命名為“n”的殘基均為人工堿基次黃嘌呤核苷(I)。按常規(guī)方法指示序列簡并性。
SEQ ID NO9列出了用于分離編碼ckx1的基因組DNA(如實施例1所述)的簡并DNA探針的核酸序列。注意序列中命名為“n”的殘基均為人工堿基次黃嘌呤核苷(I)。按常規(guī)方法指示序列簡并性。
SEQ ID NO10列出了編碼ckx1的簡并DNA序列。如本領(lǐng)域所熟知，多個這樣的DNA分子編碼具有SEQ ID NO1氨基酸序列的蛋白質(zhì)，也稱ckx1。這一組遵循遺傳密碼簡并性的常規(guī)法則。在特定生物中表達所必需、但不遵循這些常規(guī)的特異性修飾可由領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員輕易完成。
SEQ ID NO11列出了用于實施例2中經(jīng)PCR除去內(nèi)含子的合成引物的序列。
SEQ ID NO12列出了用于實施例2中經(jīng)PCR除去內(nèi)含子的合成引物的序列。
SEQ ID NO13列出了用于實施例2中經(jīng)PCR除去內(nèi)含子的合成引物的序列。
SEQ ID NO14列出了用于實施例2中經(jīng)PCR除去內(nèi)含子的合成引物的序列。
SEQ ID NO15列出了用于實施例2中經(jīng)PCR除去內(nèi)含子的合成引物的序列。
SEQ ID NO16列出了用于實施例2中經(jīng)PCR除去內(nèi)含子的合成引物的序列。
SEQ ID NO17列出了實施例2中所用合成性連接子構(gòu)建體的序列。
SEQ ID NO18列出了實施例2中所用合成性連接子構(gòu)建體的序列。
SEQ ID NO19列出了實施例4中為獲得煙草RB7啟動子所進行的PCR中所用合成性引物的序列。
SEQ ID NO20列出了實施例4中為獲得煙草RB7啟動子所進行的PCR中所用合成性引物的序列。
這里的“基本純化的蛋白質(zhì)”指該蛋白質(zhì)與通常與之相關(guān)的大部分宿主細胞蛋白質(zhì)得到分離，或該蛋白質(zhì)合成為基本純化形式，這樣的合成包括在宿主細胞中由經(jīng)任意適當(dāng)?shù)幕蛑委熯\送方式導(dǎo)入該細胞的外源核酸聚合物表達該蛋白質(zhì)。
“基本分離的核酸聚合物”指包含目的核酸聚合物的混合物基本上不含通常與之相關(guān)的其它大部分核酸聚合物。“核酸聚合物”包括核苷酸或核苷酸衍生物或類似物(包括如脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸等)的聚合物?；蚪MDNA、cDNA和mRNA均為核酸聚合物的實例。
術(shù)語“調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄”、“修飾轉(zhuǎn)錄”、“調(diào)節(jié)產(chǎn)生”和“修飾產(chǎn)生”意圖包括促進和/抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生/翻譯。
術(shù)語“表達調(diào)節(jié)序列”指連接至蛋白質(zhì)編碼序列的核酸聚合物序列，當(dāng)將其導(dǎo)入宿主細胞中時，可誘導(dǎo)或阻止該蛋白質(zhì)的表達。這些序列也可編碼或不編碼在它們的調(diào)節(jié)機制中應(yīng)用的蛋白質(zhì)。表達調(diào)節(jié)序列的實例包括CaMV啟動子、ocs終止子及tet操縱子序列。
術(shù)語“基因”意圖包括內(nèi)源和外源基因，具體地包括例如在天然細胞中編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因組DNA及編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的cDNA，其中該cDNA是諸如已導(dǎo)入細胞的質(zhì)粒載體或病毒等核酸構(gòu)建體的一部分或是經(jīng)RT-PCR產(chǎn)生的cDNA。
術(shù)語“載體”意圖包括任意含目的核酸聚合物的物理或生化載體，借助于它可將這些核酸聚合物轉(zhuǎn)移進宿主細胞，使該細胞被導(dǎo)入的核酸聚合物轉(zhuǎn)化。載體實例包括DNA質(zhì)粒、病毒、槍用小彈丸(particlegun pellets)及細菌如根癌土壤桿菌。術(shù)語“初級載體”意指系列轉(zhuǎn)化中所用第一個載體，可以是一步轉(zhuǎn)化中的載體(如用于轉(zhuǎn)化酵母細胞的質(zhì)粒)，或是伴有“次級載體”(如用于轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌的質(zhì)粒，此菌后用于轉(zhuǎn)化植物細胞)。
術(shù)語“宿主細胞”意指載體所轉(zhuǎn)化的靶細胞，轉(zhuǎn)移進去的核酸聚合物將在其中復(fù)制和/或表達。
氨基酸序列范圍中的術(shù)語“保守置換”指序列中一個氨基酸由另一個帶相似大小和帶電量之側(cè)鏈的氨基酸置換。保守置換的一個實例是用天冬酰胺置換谷氨酰胺。蛋白質(zhì)序列中預(yù)計對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能只有極小影響或根本無影響的保守置換可由生化領(lǐng)域中的一般技術(shù)人員輕易地進行設(shè)計。
術(shù)語“植物產(chǎn)物”指植物產(chǎn)生的任何細胞性物質(zhì)，特別是那些可用于植物繁殖的物質(zhì)。植物產(chǎn)物包括種子、根狀莖、葉子、分生組織、根和芽。
術(shù)語“SSC緩沖液”指在1升水中含有8.765g NaCl和4.41g檸檬酸鈉，pH經(jīng)10 N NaOH溶液滴定調(diào)節(jié)至7.0的溶液。
本文引用的每篇參考文獻的內(nèi)容均全文引入作為參考。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及分離自玉米植株、命名為ckx1的最近已測序的細胞分裂素氧化酶，它表現(xiàn)出底物特異性的細胞分裂素氧化活性。此酶關(guān)系到玉米種子的發(fā)育和成熟，以及植物組織的衰老。對這些植物功能的控制看起來可通過降低內(nèi)源和外源細胞分裂素濃度實現(xiàn)。因為ckx1能有效氧化無未飽和側(cè)鏈的細胞分裂素以及它們的核糖核苷，如iP、Z和ZR(當(dāng)將它們作外源或內(nèi)源應(yīng)用時也可誘導(dǎo)此酶的產(chǎn)生)，所以有人認為ckx1能作為植物生長調(diào)控的一個方面精確控制這些活性細胞分裂素的效力。
在發(fā)展這一要求保護之發(fā)明的過程中，申請人遇到了好幾個難題，它們或許可以解釋為什么有關(guān)細胞分裂素氧化酶基因的研究在此之前均未成功。該蛋白質(zhì)表達水平很低，并且只在植物生長周期的特定階段表達。因此，對大腸桿菌中的λ-cDNA玉米文庫的篩選無法得到ckx1可能僅僅因為制備文庫時該基因沒有表達，或表達量太少，無法檢測。此外，該蛋白質(zhì)的分離對一些研究人員而言可能是個問題，因為其活性形式經(jīng)過凝膠過濾后失活。申請人只有通過發(fā)展自己的篩選方法(述于實施例1)才能分離出具有足以進行胰酶消化及隨后測序所需純度的蛋白質(zhì)。
甚至在蛋白質(zhì)純化后，要得到ckx1的基因序列也十分困難。很明顯，ckx1的N-末端為封閉式，故不可能直接對其N-末端序列進行Edman降解法測定。該蛋白質(zhì)經(jīng)胰酶消化后，能測定的只有小分子的內(nèi)部序列SEQ ID NO4 & 5。由于這些片段在該蛋白氨基酸序列中的位置不清楚，不得不克服好幾個難題以便成功地探查玉米基因組獲得ckx1基因(詳述于實施例1)。被測序的肽片段較小，不得不采用“明確分隔(bookended)”標(biāo)準(在所復(fù)制DNA的任一末端有一個探針)以便從ckx1基因的每一側(cè)排除非ckx1 DNA。能合理斷定的是兩個探針之間的DNA將是ckx1基因的一部分。雜交/擴增產(chǎn)物的大小也必須以300bp為標(biāo)準以便區(qū)分二聚體化簡并引物和PCR產(chǎn)物。簡單的簡并策略未必有效，因為胰酶消化肽提供的特定氨基酸序列本身具有高度簡并性。最初，當(dāng)采用標(biāo)準的簡并核苷酸策略時，應(yīng)用編碼內(nèi)部氨基酸序列的所有可能的寡核苷酸，所得到的特異性結(jié)合引物濃度之低不足以起始PCR擴增。申請人只有通過應(yīng)用具較大范圍特異性的含次黃嘌呤核苷的簡并探針才能克服該問題。此外，一些簡并探針太接近以致于不能產(chǎn)生目標(biāo)大小的產(chǎn)物，或在基因中的順序不對因而不能產(chǎn)生“明確分隔”產(chǎn)物。經(jīng)證實只有探針SEQ ID NO6，7，8 & 9能用于分離ckx1基因。
所分離基因的特性用兩種互不相干的方法檢驗。第一，經(jīng)測試針對大腸桿菌中產(chǎn)生的SEQ ID NO3翻譯物的山羊抗血清對玉米粒提取物中的ckx1的親和力而檢驗(如實施例1那樣)。第二，經(jīng)在巴斯德畢赤酵母中表達SEQ ID NO3導(dǎo)致分泌活性細胞分裂素氧化酶而確證(如實施例2那樣)。
SEQ ID NO2列出了ckx1的完整基因組DNA序列，它在玉米中表達時產(chǎn)生糖基化形式的蛋白質(zhì)。內(nèi)含子在基因組序列中的預(yù)計位置用逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈式反應(yīng)確認，以確定RNA的真實轉(zhuǎn)錄長度(如實施例1那樣)。SEQ ID NO3列出了ckx1的編碼DNA序列，它產(chǎn)生SEQID NO1所示的氨基酸序列。
目前分子生物學(xué)水平已非常進步，完全能在DNA序列中相對簡便和精確地造成微小替換。技術(shù)較熟練的實驗員可在某種市售定點誘變試劑盒(如Promega公司，Madison，Wisconsin提供的GeneEditorTM)的指導(dǎo)下在一段DNA核苷酸序列中產(chǎn)生任意數(shù)目的變化?？刂七z傳密碼的一般規(guī)律也已為人熟知，核苷酸三聯(lián)密碼根據(jù)這一規(guī)律經(jīng)標(biāo)準的生化方法翻譯為氨基酸序列。故申請人認為SEQ ID NO10共有序列(編碼ckx1氨基酸序列SEQ ID NO1)所指示的這組DNA序列將包括在本發(fā)明中。盡管一些生物門中存在遺傳密碼和GC％含量的不同，控制這些變異的規(guī)律也已有充分的文獻可作依據(jù)，并且是分子遺傳學(xué)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員技術(shù)范圍之內(nèi)。故申請人還認為編碼氨基酸序列SEQID NO1的任何其它核酸序列也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
此外，盡管對蛋白質(zhì)生物化學(xué)領(lǐng)域的理解不如對分子遺傳學(xué)領(lǐng)域的理解那么全面，生化領(lǐng)域的一般技術(shù)人員還是能夠預(yù)測蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)氨基酸序列的特定置換何時不會導(dǎo)致對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能的任何明顯修飾。這類保守置換是通過用含有相似電荷、大小和其它特點之側(cè)鏈的另一種氨基酸置換序列中氨基酸造成的。例如，具有小的非極性甲基側(cè)鏈的丙氨酸通常可由具有小的非極性氫側(cè)鏈的甘氨酸置換，并不產(chǎn)生任何可引人注意的影響。同樣，有稍大些的極性乙酰胺側(cè)鏈的天冬酰胺通?？捎捎猩源笮┑臉O性丙酰胺側(cè)鏈的谷氨酰胺置換，并不產(chǎn)生任何可引人注意的影響。當(dāng)這類保守置換使得與SEQ ID NO1的同一性以及細胞分裂素氧化活性保持65％、優(yōu)選80％或更高時，如此改變的蛋白質(zhì)均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
已知細胞分裂素氧化酶在多種高等植物(包括玉米)中有非糖基化和糖基化的多種形式。有人認為這一修飾作用參與對在胞內(nèi)和胞外有不同應(yīng)用的細胞分裂素氧化酶的劃分。此酶的糖基化程度還可說明為什么各物種之間細胞分裂素氧化酶的分子量有那么大的差異。但是，由于底物特異性，酶活性對分子氧的需求及銅濃度反應(yīng)速率的體外影響在所有高等植物細胞分裂素氧化酶之間高度保守，人們確信存在共有結(jié)構(gòu)域和活性結(jié)構(gòu)位點負責(zé)所有酶的細胞分裂素氧化酶活性。因此，本發(fā)明還涉及具有細胞分裂素氧化活性并包含以下氨基酸序列的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO1的大小相似部分90％相同(或與保守性氨基酸置換相同)的至少長約20個氨基酸的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是ckx1在各種宿主細胞中的調(diào)控生產(chǎn)，以用于隨后大量分離或受調(diào)控的胞內(nèi)生產(chǎn)。例如，可在原核生物如大腸桿菌中生產(chǎn)非糖基化形式的ckx1，如實施例1所舉例說明。更優(yōu)選，該蛋白質(zhì)可在真核生物中生產(chǎn)，如實施例2中畢赤酵母生產(chǎn)的舉例說明。在畢赤酵母中生產(chǎn)該蛋白質(zhì)的又一項好處是，該蛋白質(zhì)將分泌在培養(yǎng)基中，從而很易純化?；蛘撸摰鞍踪|(zhì)可在高等真核生物中生產(chǎn)，更優(yōu)選植物中生產(chǎn)，如實施例4中在煙草內(nèi)以糖基化或非糖基化形式生產(chǎn)。其它適于做宿主植物細胞的實例包括玉米、擬南芥、蕓苔屬各個種及稻。正如已舉例，可在植物中以未調(diào)控形式產(chǎn)生ckx1(如此處所示受控于CaMV啟動子)；也可經(jīng)人為刺激調(diào)控生產(chǎn)(如此處所示受控于CaMV與tet操縱了組合體)；還可由環(huán)境刺激調(diào)控生產(chǎn)(如此處所示受控于RB7啟動子，其對線蟲感染產(chǎn)生反應(yīng)而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的根特異性生產(chǎn))。
本發(fā)明的好幾個方面，包括ckx1蛋白及編碼它的核酸聚合物、酶類如ckx1酶等的細胞分裂素氧化活性和ckx1對植物細胞中細胞分裂素水平的調(diào)節(jié)等，綜合起來可實施好幾種應(yīng)用，包括農(nóng)業(yè)和科研應(yīng)用。
申請人設(shè)計了有關(guān)大量細胞分裂素氧化酶的一項應(yīng)用，大大促進了植物生理學(xué)研究。細胞分裂素氧化酶在氧化了細胞分裂素后可被合成性氧化劑二氯靛酚(DCPIP)重新氧化。經(jīng)證實DCPIP在還原后于590nm處的光吸收值下降，這一點可經(jīng)分光光度計定量。樣品中細胞分裂素濃度可通過測定ckx1氧化樣品中存在的細胞分裂素時氧化型DCPIP的減少而間接確定。還有更靈敏的氧化還原染料可提高試驗的靈敏度。因此，本發(fā)明的另一個目標(biāo)是提供一種簡便、快速及有效的方法以分析樣品中細胞分裂素濃度。
申請人還設(shè)計了一項對植物中ckx1的修飾生產(chǎn)的應(yīng)用。細胞分裂素與好幾類植物發(fā)病機制有關(guān)，這些機制包括線蟲滋養(yǎng)細胞的形成及真菌對植物組織的入侵。故ckx1的病原體暴露性調(diào)節(jié)型生產(chǎn)可通過細胞分裂素利用機制[如根結(jié)線蟲的利用機制(Bird等，1980)或真菌如玉米黑粉菌的利用機制]改變發(fā)病機制的功效。因此，本發(fā)明的一個目的是提供通過用ckx1生產(chǎn)型DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物從而緩和細胞分裂素介導(dǎo)的發(fā)病機制的方法。
以下實施例舉例說明了本發(fā)明的原理和優(yōu)勢。
實施例實施例1ckx1的分離及其編碼序列的鑒定選擇玉米種子作為純化的原料，因為授粉大約一周時其中的細胞分裂素氧化酶濃度相對較高。經(jīng)以下過程，每kg玉米可獲得近1.66μg蛋白質(zhì)。試驗田中生長的玉米(先鋒3180或3379)人工授粉，其后第5一第8天收獲未成熟谷穗(Dietrich，1995)。迅速收獲種子，凍存于-80℃直至提取時。種子在液氮中研成粉末后，將1kg種子粉與1700ml緩沖液A(50mM Tris，5mM EDTA，抗壞血酸0.4％w/v；10mM β-巰基乙醇，pH 8.5)混合。已酸洗的PVPP(200g濕重，用緩沖液A平衡)迅速攪拌。懸浮液經(jīng)Miracloth過濾并于23,500×g離心15分鐘除去殘渣。向離心后的上清液中滴加聚乙烯亞胺溶液(5％v/v，pH8.5)至終濃度0.05％。于23,500×g再離心10分鐘后，將上清液通過600g PVPP填料(如上制備)過濾。進行硫酸銨分級分離，離心收集40％-65％飽和度之間沉淀的蛋白質(zhì)，將其溶于最小體積的緩沖液B(10mM Tris，1mM EDTA，1mM β-巰基乙醇，pH 8.5)中。不溶物經(jīng)35,000×g離心20分鐘除去。此時，可向上清液中加入甘油至10％(v/v)，使蛋白質(zhì)能在-80℃無限期保存而不失活性。
將硫酸銨分級分離后的上清液對緩沖液B透析后，以10ml/分鐘的流速上樣至DEAE-纖維素層析柱(Whatman DE-52,500ml，由Whatman集團，Clifton，新澤西提供)中。用緩沖液B洗柱后，用所含KCl經(jīng)600ml而濃度線性遞增至200mM的緩沖液B對層析柱進行洗脫。蛋白質(zhì)含量用Bradford染料結(jié)合試驗(Bradford，1976)測定。按下述方法分析各級分的氧化酶活性。
用兩個試驗檢查純化步驟中的細胞分裂素氧化酶活性。第一個為如LiberosMinotta(1995)所述的希夫氏堿形成試驗，可測定由iP產(chǎn)生的二甲基烯丙基醛(dimethylallylaldehyde)，，其中的iP經(jīng)DEAE柱層析步驟后耗盡。第二個是由申請人開發(fā)的用于剩余幾個純化步驟的試驗。在該試驗中，經(jīng)ckx1催化而將還原型等價體從異戊烯腺嘌呤轉(zhuǎn)移至二氯酚靛酚(DCPIP)使得有可能通過測定590nm處光吸收值的變化而觀察反應(yīng)性。在終體積250μl中，試驗包含100mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0；1.0mM EDTA；0.05mM DCPIP；0.1mM iP；100μg/ml BSA；及待測樣品。加入酶后，在590nm處讀取光吸收值的變化共讀10分鐘。
經(jīng)DEAE柱層析純化后，將集中的主要活性物質(zhì)對緩沖液C(20mMTris，0.5M NaCl，1.0mM CaCl2，pH 7.4)透析，再上樣于刀豆蛋白A瓊脂糖層析柱(100ml，Sigma Aldrich，St.Louis，Missouri)中，并用緩沖液C(270ml)洗柱。糖基化蛋白質(zhì)用含α-D-甲基甘露糖苷梯度經(jīng)400ml遞增至1M的緩沖液C進行洗脫。在這些條件下進行洗脫時相對較長的保留時間說明ckx1的糖基化形式已經(jīng)分離。植物血凝素親和層析所得活性級分接著對緩沖液D(10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.5)透析，然后上樣于高分辨率陰離子交換層析柱(FPLC MonoQ，1ml，Amersham Pharmacia Biotech公司，San Francisco，Califor-nia)中，用線性遞增至0.12M的KCl梯度以1ml/分鐘的流速洗脫超過24分鐘。離子交換柱層析所得活性級分經(jīng)濃縮，對緩沖液B透析，調(diào)至含1.5M硫酸銨，上樣于已用含0.6硫酸銨的緩沖液B平衡的疏水相互作用層析柱(FPLC phenylsuperose，1ml，Pharmacia)。用0.6M硫酸銨洗25分鐘后，硫酸銨濃度在15分鐘的時間里遞減至0.45M，然后在60分鐘的時間里遞減至0。
按Ornstein(1964)和Davis(1964)的說明進行非變性凝膠電泳。然后經(jīng)上述DCPIP操作對凝膠染色分析其細胞分裂素氧化酶活性。酶活性以藍色背景上的透明帶顯示。接著按Laemmli(1970)的說明進行變性SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。當(dāng)檢測級分的同質(zhì)性時，凝膠按Moller(1995)所述染色。最后一步純化時，酶用考馬斯亮藍R250染色。經(jīng)胰酶消化、HPLC分離消化物及對胰酶消化多肽的Edman降解測序即完成對純化蛋白的分析。經(jīng)此分析獲得好幾個多肽序列，包括SEQ IDNO4和5。根據(jù)這些序列設(shè)計了反向翻譯引物探針SEQ ID NO6，7，8和9，其中在高度簡變性部位有次黃嘌呤核苷的置換。接著將引物SEQID NO6和9與玉米基因組DNA組合，進行熱啟動的降落PCR(touchdownPCR)(Ault，1994)40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上分離，選出近400bp的一個片段作為雜交探針。由于它能用巢式內(nèi)部引物SEQ ID NO7和8進行PCR擴增，因而證實了該片段的性質(zhì)。然后將引物SEQ ID NO6和9擴增的片段與線性化pCRII DNA連接并轉(zhuǎn)化進大腸桿菌(INVαF’，Invitrogen公司，Carlsbad，California)。克隆并再次分離DNA后，質(zhì)粒插入物用Prism雙脫氧終止物法(Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA)測序以檢驗所測序的胰酶消化多肽由該片段編碼。
一旦證實了該大片段，就應(yīng)用DNA聚合酶的Klenow片段及引物SEQID NO6和9經(jīng)引物延伸使之標(biāo)記上32P。將玉米基因組文庫噬菌體(在λ-FIXII中，來自Stratagene，La Jolla，California)稀釋于SM緩沖液中，取適當(dāng)量加入新鮮制備的于10mM MgSO4中的大腸桿菌(XL1-Blue MRA(P2)，Stratagene)中，于37℃溫育15分鐘。加入48℃的NZY頂層瓊脂，將混合物鋪板于NZY瓊脂平板上。37℃溫育近8小時后，將平板于4℃冷卻2小時，并將噬菌體吸附在Hybond N膜(Amersham Pharmacia Biotech，San Francisco，California)上。將膜風(fēng)干10分鐘，再進行連續(xù)溫育0.5M NaOH加1.5M NaCl，500ml，5分鐘；0.5Tris-Cl pH 8.0加1.5M NaCl，500ml，5分鐘；及2×SSC，500ml，5分鐘。干印記，80℃烤干(近15分鐘)。將膜置于50％甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt’s溶液，0.2％ SDS，100-200μg/ml變性鯡魚精子或小牛胸腺DNA中于45℃預(yù)雜交不到1小時(Maniatis，1990)。
然后于100℃變性標(biāo)記的DNA片段5分鐘，加入預(yù)雜交溶液中，于45℃雜交16小時。進行第一次篩選時，將噬菌體以500pfu/cm2的密度鋪板而膜以強嚴謹條件洗滌。進行后續(xù)噬斑純化時，將候選噬菌體以70pfu/cm2和2pfu/cm2的密度鋪板而膜以中等嚴謹條件洗滌。經(jīng)過三輪純化后，經(jīng)限制酶消化從陽性噬菌體DNA中取出插入物亞片段，亞克隆至pBluescript(Stratagene)中以便經(jīng)限制酶消化及測序分析進行鑒定。重疊的兩個質(zhì)粒亞克隆pROM2(HindIII插入物)和pROM3(Xho-BamhI插入物)每個均包含ckx1基因的一部分。將這些重疊部分融合為質(zhì)?？寺ROM10。質(zhì)粒pROM2，pROM3和pROM10均已存入保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號分別為ATCC第209573、209572和209571號。pROM2和pROM3中的克隆DNA序列提供了ckx1的基因組序列SEQ ID NO.2，由該序列包含編碼上述胰酶消化片段的序列證實了這一點。
ckx1基因中內(nèi)含子的位置及ckx1編碼序列(SEQ ID NO.3)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)按以下操作進行驗證。
授粉5天后(5DAP)收獲種子的總RNA(2-4μg，經(jīng)DNA酶I處理)，以包括內(nèi)含子位點的寡核苷酸為引物引發(fā)RT-PCR。引物2031f(ckx1基因組序列第2031-2050位)和XBH1(ckx1基因組序列第2553-2570位的反向互補序列)覆蓋了第一個內(nèi)含子位點。引物3160f(ckx1基因組序列第3160-3179位)和3484r(ckx1基因組序列第3465-3484位的反向互補序列)覆蓋了第二個內(nèi)含子位點。于50℃逆轉(zhuǎn)錄50分鐘，逆轉(zhuǎn)錄混合物為總體積20μl溶液中含有Superscript II(Gibco-BRL)200U，25mM Tris-Cl，pH 8.3，37.5mM KCl，1.5mM MgCl2，0.5mM四種dNTP，5mM二硫蘇糖醇，RNAasin(Promega，Madison，Wisconsin)。以4-10％RT反應(yīng)產(chǎn)物為模板、在含有1XPCR緩沖液(RocheDiagnostics，Basel，Switzerland)、1U Taq聚合酶、四種dNTP 200μM、及引物各0.5μM的溶液中進行PCR。反應(yīng)條件為于95℃初次變性4分鐘，隨后進行35個以下循環(huán)95℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘。最后在72℃延伸4分鐘。PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠上分離。從凝膠中切出PCR產(chǎn)物并測序以確定剪切位點的連接。
用設(shè)計為跨越第一和第二個內(nèi)含子位置的引物對玉米種子RNA(授粉5天后)進行RT-PCR，證實PCR產(chǎn)物的大小與成熟氧化酶mRNA中切出這些內(nèi)含子一致?？绲谝粋€內(nèi)含子的引物在該內(nèi)含子存在時應(yīng)產(chǎn)生一段539bp的產(chǎn)物、該內(nèi)含子被切出后應(yīng)產(chǎn)生一段127bp的產(chǎn)物。同樣，跨第二個內(nèi)含子的引物在第二個內(nèi)含子存在時應(yīng)產(chǎn)生一段324bp的產(chǎn)物、該內(nèi)含子被切出后應(yīng)產(chǎn)生一段232bp的產(chǎn)物。如圖2示，PCR產(chǎn)物分別為127bp和232bp，說明內(nèi)含子都確實已經(jīng)切出。片段的序列分析證實剪切已如預(yù)期一樣發(fā)生。
ckx1蛋白和基因的性質(zhì)經(jīng)以下免疫學(xué)技術(shù)驗證。
在山羊體內(nèi)制備針對大腸桿菌內(nèi)表達ckx1基因片段所生成肽的多克隆抗體。這樣可在制備抗該基因產(chǎn)物的抗體時避免出現(xiàn)糖基化表面，并避免出現(xiàn)Burch等在制備抗天然ckx1抗體時遇到的問題。經(jīng)硫酸鈉沉淀法(Willams等，1967)部分純化來自免疫和未免疫山羊的抗體。按廠家說明將這些純化的抗體(2mg)偶聯(lián)至pH 10的Aminolink Plus凝膠(1ml，Pierce)上，制備親和柱。向每個柱加入0.2ml(27μg)刀豆蛋白A分級分離的玉米氧化酶制備物和0.8ml磷酸鹽緩沖液(PBS)進行活性損耗試驗。各柱加蓋并于室溫溫育1小時。收集洗脫物，分析其細胞分裂素氧化酶活性。
針對ckx1的抗體可識別主要的玉米細胞分裂素氧化酶。包含固定化抗ckx1片段抗體的柱能夠降低刀豆蛋白A分級分離的玉米提取物細胞分裂素氧化酶活性。作為對照的未免疫山羊抗體層析柱不能做到這點。實施例2ckx1在巴斯德畢赤酵母中的表達可用以下程序大量生產(chǎn)ckx1蛋白，以用于諸如實施例3的細胞分裂素分析等應(yīng)用中，或應(yīng)用于植物原料中。
ckx1在巴斯德畢赤酵母中的表達分四步第一步除去ckx1中的內(nèi)含子，第二步除去玉米啟動子，并用無內(nèi)含子的構(gòu)建體構(gòu)建適當(dāng)?shù)谋磉_盒，第三步將最終構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進畢赤酵母，及第四步在畢赤酵母中表達ckx1。
最右側(cè)內(nèi)含子的除去是通過重疊延伸法剪接(Horton等，1989)完成的，最左側(cè)內(nèi)含子的除去是通過連接適當(dāng)限制性片段完成的。將所得無內(nèi)含子的盒插入畢赤酵母表達載體pPICZ-A中，產(chǎn)生表達構(gòu)建體pROM24(圖9)。將此構(gòu)建體導(dǎo)入必需的畢赤酵母宿主中并在有甲醇時進行培養(yǎng)以誘導(dǎo)ckx1表達。作為適當(dāng)對照的畢赤酵母細胞系(只包含載體或包含表達人血清白蛋白的重組體)作平行培養(yǎng)。
在生長曲線的任何時間均未在含ckx1的畢赤酵母細胞裂解物或?qū)φ罩邪l(fā)現(xiàn)細胞分裂素氧化酶活性。但攜ckx1的畢赤酵母細胞系表達了高水平的細胞分裂素氧化酶活性，并將此酶分泌在培養(yǎng)基中。對照上清中未發(fā)現(xiàn)酶活性。這更證實ckx1確實編碼細胞分裂素氧化酶。
第一步.除去內(nèi)含子為限制人為引發(fā)，用選擇的ckx1限制性片段為模板，經(jīng)重疊延伸法剪接除去第二個內(nèi)含子(SEQ ID NO.2的第3219-3312位殘基)。下表列出了所用引物和模板。
反應(yīng)#1和#2的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化，用于最終PCR步驟中。對反應(yīng)#3的終產(chǎn)物進行克隆和測序，并用一個PflM1/Xba1亞片段置換pROM7中帶內(nèi)含子的PflM1/Xba1亞片段。此構(gòu)建體命名為pROM19。
然后從pROM19中除去第一個內(nèi)含子(SEQ ID NO.2的第2113-2524位殘基)，方法是用從寡核苷酸CCGGTTTTGGTACCGGT(SEQ ID NO.17)和CATGACCGGTACCAAAA(SEQ ID NO.18)構(gòu)建的接頭置換限制性位點PinA1和Nco1之間的DNA。該產(chǎn)物命名為pROM20。外源接頭相關(guān)堿基經(jīng)PinA1消化并重新連接而去除。此產(chǎn)物命名為pROM22(圖8)，它包含三個融合的ckx1外顯子及玉米ckx1啟動子。第二步.畢赤酵母表達盒用AatII對pROM22(圖8)進行部分消化、用T4 DNA聚合酶填平粘端、用Bg1II重新消化便可除去玉米啟動子。將外顯子融合體(含ckx1并包括其假定信號肽)連接至pPICZ-A的Pml1/BsmB1限制位點(Easy-Select Pichia Expression Kit versionB，Invitrogen公司)。所得質(zhì)粒命名為pROM24(圖9)。第三步.如Invitrogen實驗手冊所述向畢赤酵母菌株X33轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pROM24(圖9)(10μg)用Dra1消化，在2mm樣品槽中以1.75KV電穿孔進入X33感受態(tài)細胞中(GenePulser，Bio-Rad Laboratories，Hercules，California)。在含100μg/ml zeocin的YPDS上經(jīng)選擇得到很多菌落。擇其一(PPckx1)進行表達研究。第四步.氧化酶的表達將轉(zhuǎn)化體PPckx1接種于BMGY培養(yǎng)基(50ml)中培養(yǎng)過夜。沉淀細胞，重新懸浮于BMMY(含0.5％v/v甲醇)中，稀釋至A600＝1，于30℃猛烈振蕩培養(yǎng)。另于接種后24、48、72小時加入甲醇使?jié)舛染S持0.5％v/v。收集樣品分析細胞裂解物或培養(yǎng)物上清中細胞分裂素氧化酶活性。以畢赤酵母菌株X33(WT，無插入物)和GS115(分泌人血清白蛋白插入物)為對照。實施例3重組細胞分裂素氧化酶在細胞分裂素快速分析法中的應(yīng)用將包含磷酸鹽緩沖液(250mM，pH 7.0)、EDTA(2.5mM)和DCPIP(0.125mM)的緩沖液混合物100μl與過量的重組細胞分裂素氧化酶及各種濃度的玉米素溶液(150μl)混合以測量細胞分裂素。測量590nm處的光吸收值凈變量。
圖3示該分析法用于測定細胞分裂素玉米素時光吸收值的變化。此法能測量少至2nmol的玉米素，但此法相比于現(xiàn)有技術(shù)的主要優(yōu)點是比較快速。分析可在不到5分鐘內(nèi)完成，大大快于放射免疫分析(MacDonald和Morris，1985)。而且，此法可通過將ckx1基因偶聯(lián)至諸如ipt或tzs這樣的細胞分裂素生產(chǎn)基因中而參與細胞分裂素生產(chǎn)系統(tǒng)，從而體外分析細胞分裂素的生產(chǎn)。實施例4對煙草根部ckx1表達的不調(diào)節(jié)及組成型調(diào)節(jié)下述方法可用于生產(chǎn)經(jīng)修飾可在根部表達及組成型表達ckx1的煙草植物，該方法是對Draper等，1988所述的標(biāo)準實驗方法稍作修改。
煙草栽培品種Xanthi是標(biāo)準的煙草品系。也用到無攻擊能力的根癌土壤桿菌菌株如LBA4404等(Hoekema等，1985)。Murashige和Skoog鹽、植物瓊脂(phytagar)、蔗糖等為試劑或組織培養(yǎng)級別。
用ckx1編碼序列(SEQ ID NO.3)分別構(gòu)建三個不同構(gòu)建體，以獲得轉(zhuǎn)化煙草中ckx1表達的三種模式。構(gòu)建體是基于BIN19質(zhì)粒初級載體(其包括土壤桿菌相容性復(fù)制起點和卡那霉素選擇標(biāo)記，Bevan等，1984)。制備以下構(gòu)建體CaMV-ckx1-nospBI121(圖5)中有帶nos增強子的花椰菜花葉病毒啟動子(美國專利第5,530,196)(由Clonetech，Palo Alto，California提供)。pBI121的β-葡糖醛酸酶基因經(jīng)BamHI/EcoIcrI消化切出。ckx1編碼序列(SEQ ID NO.3)得自BglII對pROM26(圖10)(pROM24(圖9)經(jīng)定點誘變而包含另一個BglII和XhoI限制性位點)的消化。經(jīng)BamHI消化改變的pBI121并連接至ckx1編碼序列而產(chǎn)生誘導(dǎo)ckx1強組成型表達的最后構(gòu)建體pROM30(圖13。
CaMV-tet-ckx1-ocspROM26的ckx1編碼區(qū)(圖10)經(jīng)BglII消化而分離，連接至pUCA7-TX的BamHI位點(Gatz等，1992)以形成pROM32(圖14)。通過PvuII消化，從pUCA7-TX切出受四環(huán)素調(diào)節(jié)的操縱基因元件(美國專利第5,464,758號)，從pROM32(圖14)切出插入的編碼區(qū)。將片段連接于pJL7(圖4)(一種BIN19型質(zhì)粒)的SalI位點，得到最終構(gòu)建體pROM29(圖12)。將這一構(gòu)建體導(dǎo)入已轉(zhuǎn)化為可表達tet抑制蛋白的煙草中時，在加入四環(huán)素解除抑制之前沒有ckx1活性的表達。這一構(gòu)建體可能在因ckx1的強組成型表達而導(dǎo)致不正常生長的宿主生物體中具有特殊用途。
RB7-ckx1-nos經(jīng)以下方法獲得煙草RB7根特異性啟動子(美國專利第5,750,386號)。從煙草基因組DNA中用GACACCATTCCAAGCATACCCC(SEQ ID NO.19)和GTTCTCACTAGAAAAATGCCCC(SEQ ID NO.20)作引物，經(jīng)PCR擴增得到含啟動子的一個片段。將此1400bp產(chǎn)物連接于pCRII質(zhì)粒(Invitrogen)中，以產(chǎn)生pROM8(圖6)。然后將插入物中包含啟動子的線蟲特異性部分的HindIII-EcoRI區(qū)切出，連接于pBluescriptII KS+(Stratagene)的HindIII-EcoRI位點，產(chǎn)生pROM9(圖7)。將pROM24(圖9)中含ckx1編碼序列的EcoRI-NdiI片段切出，連接于pROM9的EcoRI-PstI位點，產(chǎn)生pROM28(圖11)。將pROM28中的HindIII-SacI片段連接至pBI121(圖5)的HindIII-SacI位點，產(chǎn)生最終構(gòu)建體pROM43(圖15)，當(dāng)轉(zhuǎn)化植物的根受到線蟲攻擊時其可在根中誘導(dǎo)ckx1表達。培養(yǎng)基組成 MSS PC SI MSSKMS鹽(g/l) 4.3 4.3 4.3 4.3蔗糖(g/l) 30.0 30.0 30.0 30.0Phytagar(g/l) 7.5 5.0 5.0 7.5NAA(mg/l) 01.0 1.0 0BAP(mg/l) 00.1 0.1 0Timetin(mg/l) 00200 200卡那霉素(mg/l) 0050.0 50.0pH 5.7 5.7 5.7 5.7煙草在MSS上連續(xù)進行純性莖尖培養(yǎng)，每隔4周傳代。
將上述三個雙元質(zhì)粒構(gòu)建體經(jīng)電穿孔導(dǎo)入無攻擊能力的根癌土壤桿菌宿主中，在適當(dāng)選擇下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體(An等，1985)。取對數(shù)晚期培養(yǎng)物進行轉(zhuǎn)化。
將幼齡純性煙草葉(莖尖培養(yǎng)3至4周后)切成4-6段，除去最大的維管結(jié)構(gòu)。將節(jié)段于PC上(遠軸側(cè)向上)培養(yǎng)48小時。然后將葉片于以水稀釋(1∶1)的根癌土壤桿菌培養(yǎng)物中浸泡1小時。接著將葉片置于原來的PC培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時。葉片經(jīng)水徹底清洗后置于SI培養(yǎng)基上，并每7-10天轉(zhuǎn)移至新鮮的SI培養(yǎng)基上。盡管在煙草轉(zhuǎn)化體中并未發(fā)現(xiàn)有不利于發(fā)育的影響，但培養(yǎng)某些宿主植物時必須應(yīng)用非底物細胞分裂素如芐基氨基嘌呤、或四環(huán)素的抑制。當(dāng)莖達到1cm長時將之移至MSSK培養(yǎng)基上。對莖尖培養(yǎng)連續(xù)進行2-3次轉(zhuǎn)移，此后將轉(zhuǎn)基因植物維持在MSS培養(yǎng)基上。
根據(jù)本發(fā)明上述詳述和實施例，顯然可以實現(xiàn)本發(fā)明的好幾項目標(biāo)。此處給出的解釋和舉例說明意在讓本領(lǐng)域內(nèi)的其他技術(shù)人員了解本發(fā)明、其原理、及其實踐應(yīng)用。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以多種方式修改并應(yīng)用本發(fā)明，這些方式可能是某些特殊用途所要求的最佳選擇。相應(yīng)地，在此所列本發(fā)明的特殊實施方案并不想窮盡或限制本發(fā)明。
文獻目錄An，G.等，1985“用于高等植物轉(zhuǎn)化的新克隆載體”EMBOJ.4277-84Ault，G.，1994“用降落和熱啟動PCR的型特異性病毒DNA擴增”病毒學(xué)方法雜志46145-56Bechtold，N.等，1993“植物土壤桿菌介導(dǎo)的經(jīng)對成熟擬南芥植物滲透而進行的基因轉(zhuǎn)移”CR Acad.Sci.Paris Sciences del la vie/生命科學(xué)3161194-99Bevan，M.，1984“用于植物轉(zhuǎn)化的二元土壤桿菌載體”核酸研究128711-21Bird，A.F.等，1980“細胞分裂素在土豆和線蟲之間宿主-寄生蟲關(guān)系中的角色”寄生蟲學(xué)80497-505Bradford，M.，1976“應(yīng)用蛋白質(zhì)-染料結(jié)合原理定量測定微克級蛋白質(zhì)的一種快速靈敏的方法”分析生物化學(xué)72248-54Brownlee，B.G.等，1975“3-甲基-2-丁烯醛細胞分裂素N6-(Δ2-異戊烯基)腺嘌呤的酶解產(chǎn)物”加拿大生物化學(xué)雜志5337-41Burch，L.R.等，1992“細胞分裂素氧化酶及細胞分裂素的降解代謝”在kaminek等植物中細胞分裂素的生理學(xué)和生物化學(xué)一書中第229-32頁，STP學(xué)術(shù)出版社，the Hague，荷蘭Chen，H.等，1996“產(chǎn)生病毒聚合酶的特異性寡核苷酸抑制物的新方法”酶學(xué)方法275503-20Davis，B.，1964“人血清蛋白質(zhì)的盤狀電泳II方法及應(yīng)用”紐約科學(xué)院年鑒121404Dietrich，J.T.等，1995“玉米種子發(fā)育過程中細胞分裂素和細胞分裂素氧化酶活性的變化以及外源細胞分裂素對種子發(fā)育的影響”植物生理學(xué)與生物化學(xué)33327-36Draper，J.等，1988植物的遺傳轉(zhuǎn)化與表達實驗室手冊Blackwell科學(xué)出版社Gatz，C.等，1992“四環(huán)素對完整煙草植物中已修飾的CaMV35S啟動子的嚴謹阻遏及同系去阻遏作用”植物雜志2(3)397-404Hare，P.D.等，1994“細胞分裂素氧化酶生物化學(xué)特點及生理學(xué)意義”植物生理學(xué)91128-35Hoekema，A.等，1985“非致癌性植物載體在土壤桿菌二元系統(tǒng)中的應(yīng)用”植物分子生物學(xué)585-89Horton，R.M.等，1989“不用限制酶加工雜合基因”基因7761-8Koziel等，1993“表達蘇云金芽孢桿菌殺昆蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米植物的大田生產(chǎn)”生物/技術(shù)11194Laemmle，U.K.等，1970“噬菌體T4頭部裝配時結(jié)構(gòu)蛋白的切割”自然227680-685Liberos-Minotta，C.等，1995“細胞分裂素氧化酶的比色分析”分析生物化學(xué)231339-341MacDonald，E.M.S.等，1985“細胞分裂素的免疫親和層析分離及HPLC-放射免疫分析分離”酶學(xué)方法110347Maniatis，T.等，1990分子克隆實驗室手冊第二版，冷泉港實驗室出版社Moller，H.J.等，1995“改良的糖蛋白薄層十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠銀染法”分析生物化學(xué)226371-74Odell等，1985“對花椰菜花葉病毒35S啟動子活性必需的DNA序列的鑒定”自然313810Ooms，G.等，1987“土壤桿菌T-DNA在兩種土豆培養(yǎng)物中的遺傳轉(zhuǎn)化”理論與應(yīng)用遺傳學(xué)73744-50
Ornstein，L.，1964“盤狀電泳I，背景及理論”紐約科學(xué)院年鑒121321Potrykus，1991“植物基因轉(zhuǎn)移對公開方法及結(jié)果的評價”植物生理學(xué)年鑒，植物分子生物學(xué)42205Singer，B.S.等，1996“基因組SELEX文庫”核酸研究25781-86Skory，C.D.等，1996“Candida wickerhamii胞外β-糖苷酶基因bgls在釀酒酵母中的表達和分泌”當(dāng)代遺傳學(xué)30417-422Smith，C.T.S.等，1988“轉(zhuǎn)基因西紅柿中多聚半乳糖醛酸酶基因表達的反義RNA抑制”自然334724-26Su，W.等，1996“擬南芥硝酸鹽還原酶第一鉸鏈區(qū)翻譯后調(diào)節(jié)位點的體外鑒定”植物細胞8519-27Van der Krol，A.R.等1990“反義CHS基因?qū)ㄉ爻林囊种茊幼蛹胺戳x效應(yīng)必需的最小序列”植物分子生物學(xué)14457-66Williams，C.A等，1967免疫學(xué)與免疫組織化學(xué)的方法，I，第319頁序列表<110>Morris Ph.D.，Roy O.<120>細胞分裂素氧化酶<130>UMO 1491<140><141><150>06/054，268<151>1997-07-30<160>20<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>534<212>PRT<213>玉米<400>1Met Ala Val Val Tyr Tyr Leu Leu Leu Ala Gly Leu Ile Ala Cys Ser1 5 10 15His Ala Leu Ala Ala Gly Thr Pro Ala Leu Gly Asp Asp Arg Gly Arg20 25 30Pro Trp Pro Ala Ser Leu Ala Ala Leu Ala Leu Asp Gly Lys Leu Arg35 40 45Thr Asp Ser Asn Ala Thr Ala Ala Ala Ser Thr Asp Phe Gly Asn Ile50 55 60Thr Ser Ala Leu Pro Ala Ala Val Leu Tyr Pro 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1.一種基本純化的有細胞分裂素氧化活性的蛋白質(zhì)，其選自下組(a)SEQ ID NO.1，(b)所具氨基酸序列包含SEQ ID NO.1氨基酸序列的一種蛋白質(zhì)，(c)所具氨基酸序列包含SEQ ID NO.1氨基酸序列一部分的一種蛋白質(zhì)，所包括部分至少約20個氨基酸殘基長并賦予該蛋白質(zhì)有細胞分裂素氧化活性，和(d)所含的一段氨基酸序列與SEQ ID NO.1有至少約65％序列相同、其余的氨基酸殘基被保守置換的一種蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)已純化。
3.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，它是SEQ ID NO.1。
4.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，它是用包含編碼權(quán)利要求1蛋白質(zhì)之核酸聚合物的載體轉(zhuǎn)化了的宿主細胞產(chǎn)生的。
5.編碼權(quán)利要求1之蛋白質(zhì)的基本分離的核酸聚合物。
6.權(quán)利要求5的基本分離的核酸聚合物，它編碼SEQ ID NO.1。
7.編碼有細胞分裂素氧化活性之蛋白質(zhì)的基本分離的核酸聚合物，其中該核酸聚合物選自下組(a)SEQ ID NO.2，(b)SEQ ID NO.3，(c)具有SEQ ID NO.10所述序列的一段核酸聚合物，(d)其序列包含選自下組的一段序列的核酸聚合物，所述組由SEQID NO.2、SEQ ID NO.3或具有SEQ ID NO.10所述序列之核酸聚合物組成，(e)包含選自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或具有SEQ ID NO.10所述序列之核酸聚合物的核苷酸序列中至少一個60個堿基對部分的核酸聚合物，該部分編碼的氨基酸序列賦予所編碼蛋白質(zhì)以細胞分裂素氧化活性，(f)編碼所含的一段氨基酸序列與SEQ ID NO.1有至少約65％序列相同、其余氨基酸殘基被保守置換的蛋白質(zhì)的核酸聚合物，(g)可與選自下組的核苷酸序列在相當(dāng)于0.5X-2X SSC緩沖液，0.1％ SDS，55-65℃的嚴謹洗滌條件下雜交的核酸聚合物，該組由SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和具有SEQ ID NO.10所述序列之核酸聚合物組成，和(h)具有互補于(a)-(g)中任一項之核酸序列的核苷酸序列的核酸聚合物。
8.權(quán)利要求7的基本分離的核酸聚合物，其中所述聚合物包含SEQID NO.10所述序列或互補于SEQ ID NO.10所述序列的序列。
9.權(quán)利要求7的基本分離的核酸聚合物，其中所述聚合物是SEQ IDNO.2或其互補序列。
10.權(quán)利要求7的基本分離的核酸聚合物，其中所述聚合物是SEQ IDNO.3或其互補序列。
11.被含編碼權(quán)利要求1之蛋白質(zhì)的脫氧核糖核酸聚合物的載體轉(zhuǎn)化了的宿主細胞。
12.權(quán)利要求11的宿主細胞，其中該宿主細胞為植物細胞。
13.權(quán)利要求12的宿主細胞，其中該宿主植物細胞選自下組(a)煙草，(b)擬南芥，(c)玉米，(d)蕓苔屬植物，(e)稻。
14.權(quán)利要求11的宿主細胞，其中該宿主細胞選自下組(a)巴斯德畢赤酵母，(b)大腸桿菌。
15.由權(quán)利要求12的宿主植物細胞再生的植物。
16.權(quán)利要求15的再生植物的植物產(chǎn)物。
17.權(quán)利要求16的植物產(chǎn)物，其中該植物產(chǎn)物選自下組種子、葉、莖培養(yǎng)物、根莖和鱗莖。
18.在宿主細胞中產(chǎn)生權(quán)利要求1之蛋白質(zhì)的方法，其基本包括(a)構(gòu)建含有編碼權(quán)利要求1之蛋白質(zhì)的DNA及可在宿主細胞中操作的表達調(diào)節(jié)序列的載體。(b)用該載體轉(zhuǎn)染適于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的宿主細胞；和(c)在該宿主細胞中表達該蛋白質(zhì)。
19.權(quán)利要求18的方法，其中該載體選自下組(a)含DNA的質(zhì)粒，(b)根癌土壤桿菌。
20.權(quán)利要求18的方法，其中該宿主細胞選自下組(a)巴斯德畢赤酵母，(b)大腸桿菌。
21.權(quán)利要求18的方法，其中該宿主細胞將該蛋白質(zhì)分泌在培養(yǎng)基中，該方法進一步包括自培養(yǎng)基中純化該蛋白質(zhì)。
22.權(quán)利要求18的方法，其進一步包括將該宿主細胞重建成生物體的步驟。
23.權(quán)利要求18的方法，其中該宿主細胞為植物細胞。
24.權(quán)利要求23的方法，其中該宿主植物細胞選自下組(a)煙草，(b)擬南芥，(c)玉米，(d)蕓苔屬植物，(e)稻。
25.緩和植物中與細胞分裂素有關(guān)的發(fā)病機制的方法，包括用包含下列成分的核酸聚合物構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞(a)編碼權(quán)利要求1之蛋白質(zhì)的核酸聚合物，和(b)可在宿主植物中操作的表達調(diào)節(jié)序列；以及由轉(zhuǎn)化的植物細胞再生植物。
26.權(quán)利要求25的方法，其中表達調(diào)節(jié)序列選自下組組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、阻遏蛋白和增強子。
27.檢測樣品中細胞分裂素濃度的方法，其主要包括(a)向緩沖的樣品中加入已知量的二氯靛酚和過量IU活性產(chǎn)生量的權(quán)利要求1之蛋白質(zhì)；(b)測量590nm處光吸收值的凈變值；和(c)將此凈吸收值與由細胞分裂素已知濃度所得的標(biāo)準曲線進行比較。
全文摘要
一種分離的、具有細胞分裂素氧化活性的蛋白質(zhì),此蛋白質(zhì)選自下組:SEQ ID NO.1;所具氨基酸序列包含SEQ ID N0.1氨基酸序列的一種蛋白質(zhì);所具氨基酸序列包含 SEQ ID NO.1氨基酸序列一部分的一種蛋白質(zhì),所包括部分至少約20個氨基酸殘基長并賦予該蛋白質(zhì)以細胞分裂素氧化活性;和所含氨基酸序列與 SEQ ID NO.1有至少約65%序列相同、其余的氨基酸殘基被保守置換的一種蛋白質(zhì)。編碼有細胞分裂素氧化活性的蛋白質(zhì)的核酸及相關(guān)產(chǎn)物和方法也在公開之列。
文檔編號C12N15/29GK1265146SQ98807668
公開日2000年8月30日 申請日期1998年7月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月30日
發(fā)明者R·O·莫里斯 申請人:密蘇里大學(xué)