專利名稱：酰胺的制備工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)、擬無枝酸菌屬(Amycolatopsis)或紅球菌屬(Rhodococcus)微生物，以及使用這些微生物或這些微生物的酶提取物制備酰胺的新工藝。
對于酰胺，例如煙酰胺，一種動物和人必需的維生素B復合體，已知許多生物工藝過程。通常，已知含有腈水合酶的微生物能將腈類轉(zhuǎn)化成相應的酰胺。因而，EP-A-0188316公開了一種使用紅球菌屬微生物用3-氰基吡啶制備煙酰胺的工藝。該工藝的缺點是這些微生物將3-氰基吡啶轉(zhuǎn)化成煙酰胺的活性低。
EP-A-0307926公開了通過使用紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)J1微生物將3-氰基吡啶轉(zhuǎn)化成煙酰胺。為了使這些微生物催化希望的轉(zhuǎn)化，必需誘導它們。
該工藝的另一缺陷是紫紅紅球菌J1是紅色的，因此需要對產(chǎn)物進行褪色。此外，這種微生物具有低熱穩(wěn)定性并能被例如底物3-氰基-吡啶所抑制。
EP-A-0362829公開了另一種使用紫紅紅球菌J1種微生物從3-氰基吡啶開始制備煙酰胺的工藝。為了增加含腈水合酶的微生物的比活性，向培養(yǎng)基中加入脲或脲衍生物作為誘導劑。如上文所述工藝，在這一工藝中也需要對產(chǎn)物進行褪色。
此外，WO 95/17505公開了一種通過紫紅紅球菌M33種微生物從相應的腈類開始制備芳香族酰胺的工藝。該工藝的缺陷是紫紅紅球菌M33的紅色以及底物3-氰基吡啶的高Km值。
本發(fā)明的目的是消除這些缺陷并提供一種制備酰胺的工藝，能高產(chǎn)量和高純度地分離其中相應的酰胺。
這一目的可通過根據(jù)權利要求1和3的新微生物以及根據(jù)權利要求6的工藝來達到。
根據(jù)本發(fā)明，所述工藝是用馬杜拉放線菌屬、擬無枝酸菌屬或紅球菌屬微生物，使用這些微生物的酶提取物或用純化了的馬杜拉放線菌屬或擬無枝酸菌屬微生物腈水合酶將腈(作為底物)轉(zhuǎn)化成相應的酰胺。
用于生物轉(zhuǎn)化的腈類如3-氰基吡啶是市場上可買到的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的微生物能將底物腈類轉(zhuǎn)化成相應的酰胺。這些微生物優(yōu)選具有能依靠腈類或酰胺作為唯一的碳源或氮源的能力。
根據(jù)本發(fā)明，微生物可從例如土壤樣品、污泥或廢水中借助于通常的微生物技術進行適當?shù)姆蛛x獲得。在鈷離子的存在下，以腈類或酰胺作為優(yōu)選的唯一碳源和氮源進行生長而可方便地對微生物進行選擇。適用于選擇的腈類和酰胺類，特別是在后面的生物轉(zhuǎn)化中也被用作底物的腈類，以及可從中獲得的相應的酰胺。適宜的培養(yǎng)基對本領域技術人員來說同樣是已知的，例如在表1中描述的培養(yǎng)基就可使用。
通常，即使在實際的生物轉(zhuǎn)化之前，可使用上述培養(yǎng)基以同樣的方式培養(yǎng)(生長)微生物。
如本專業(yè)所知，腈水合酶只有在培養(yǎng)基中含有鈷離子作為輔助因子時才能形成。適宜的“能產(chǎn)生鈷離子的鈷化合物”是Co2+或Co3+鹽。Co2+或Co3+鹽的實例為氯化鈷、硫酸鈷和乙酸鈷。
可方便使用的鈷化合物是Co2+鹽，如CoCl2。然而生長也可在維生素B12與在原位能產(chǎn)生鈷離子的金屬鈷或其他鈷化合物共同存在下進行。鈷化合物方便用量是1-10mg/L，優(yōu)選1-3mg/L。
通常生長溫度為20-50℃，pH值在pH5和pH8之間，優(yōu)選溫度是30-45℃，優(yōu)選pH值在pH5.5和pH7.5之間。
可使用馬杜拉放線菌屬、擬無枝酸菌屬微生物，使用這些微生物的酶提取物或使用來自這些微生物的純化的腈水合酶進行實際的生物轉(zhuǎn)化?？煞奖愕厥褂脧腿~馬杜拉放線菌進行生物轉(zhuǎn)化，例如復葉馬杜拉放線菌E3733、復葉馬杜拉放線菌E3736、復葉馬杜拉放線菌45A32、復葉馬杜拉放線菌4501或復葉馬杜拉放線菌C15的分離物。進行生物轉(zhuǎn)化優(yōu)選使用相應于擬無枝酸菌NE31和擬無枝酸菌NA40或它們的功能相當?shù)淖兎N或突變種的微生物。特別優(yōu)選使用與擬無枝酸菌NA40種相應的微生物。根據(jù)布達佩斯條約，上述種的微生物已于1997年6月3日以擬無枝酸菌NE31和擬無枝酸菌NA40的名稱保藏在DeutschenSammlung von Mikroorganisms und Zellkulturen GmbH [ GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH]，Mascheroderweg1b，D-38124 Brunswick，保藏號分別為DSMZ 11616和DSMZ 11617。這兩種微生物已經(jīng)更精確地鑒定，并將被分配至文獻尚未公開的擬無枝酸菌屬的種中。
因此，本發(fā)明還涉及能將酰胺轉(zhuǎn)化成腈的擬無枝酸菌屬或馬杜拉放線菌屬微生物，特別是名為擬無枝酸菌NA40(DSMZ 11617)和擬無枝酸菌NE31(DSMZ 11616)的微生物。
此外，已發(fā)現(xiàn)紅球菌屬的特殊微生物比公開于EP-A-0362829中的紫紅紅球菌J1具有更好的將腈類轉(zhuǎn)化成酰胺的性能。這些微生物是紅球菌GF674、紅球菌GF578、紅球菌GF473、紅球菌GF270(DSMZ 12211)和紅球菌GF376(DSMZ 12175)或它們的功能相當?shù)淖兎N或突變種。根據(jù)布達佩斯條約，微生物DSMZ 1275于1998年5月15日、微生物DSMZ12211于1998年6月8日保藏在Deutschen Sammlung vonMikroorganisms und Zellkulturen GmbH [ German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures GmbH]。
紅球菌屬菌株GF270、GF376、GF473、GF578和GF674已根據(jù)鑒定被分配至文獻尚未公開的紅球菌屬的種中。因此，本發(fā)明還涉及微生物紅球菌GF270、紅球菌GF376、紅球菌GF473、紅球菌GF578和紅球菌GF674。
不象馬杜拉放線菌屬或擬無枝酸菌屬微生物，紅球菌屬微生物可方便地在實際的生物轉(zhuǎn)化前被誘導。適宜的誘導劑是EP-A-0307926中公開的，例如乙酰胺、丁酰胺、甲基丙烯酰胺、丙酰胺、丁烯酰胺和戊酰胺。
“功能相當?shù)淖兎N和突變種”是指來源于上述原始有機體并且實質(zhì)上與其具有同樣的特性和功能的微生物。這種變種和突變種可例如通過UV照射或誘變化合物偶然形成。
擬無枝酸菌NA40的鑒定氣生菌絲體的顏色 白色基內(nèi)菌絲體顏色 橙色擴散色素的顏色 -糖譜ARA+GAL+MAD-XYL-GLUtrRIB+類型 ADAPDL維生素K2類(％)8/4-9/0(+)9/2+9/4+++9/6-9/8-16S rDNA同源性 96.9％磷脂如 未調(diào)查PE，OH-PE，lyso PE，metPE，PC，NPG，PI，PIM，PG，DPG，GL脂肪酸iso 16 +++
iso 15 +iso 17 (+)anteiso 15 (+)anteiso 17 (+)10-Me 16 -10-Me 17 +2-OH 15 +2-OH 16 +類型 3fMS -擬無枝酸菌NE31的鑒定氣生菌絲體的顏色 白色基內(nèi)菌絲體的顏色 橙色擴散色素的顏色 -糖譜ARA +GAL +MAD -XYL -GLU trRIB +類型 ADAP DL維生素K2類(％)8/4 -9/0 (+)9/2 +9/4 +++9/6 -
9/8 -16S rDNA同源性 96.1％磷脂如 未調(diào)查PE，OH-PE，lyso PE，metPE，PC，NPG，PI，PIM，PG，DPG，GL脂肪酸iso 16 +++iso 15 +iso 17 (+)anteiso 15 (+)anteiso 17 (+)10-Me 16-10-Me 17+2-OH 15 +2-OH 16 +類型3fMS -鑒定中使用的縮寫和解釋(+) 1-15％+ 5-15％++ 15-30％+++ ＞30％DAP 二氨基庚二酸ARA 阿拉伯糖GAL 半乳糖MAD 北美放線菌粘糖XYL 木糖GLU 葡萄糖
RIB 核糖糖類型根據(jù)Lechevalier等，1971。
脂肪酸類型根據(jù)Kroppenstedt 1985和1982。
9/4 MK-9(H4)9/6 MK-9(H6)9/8 MK-9(H8)MS 霉菌酸PE 磷脂酰乙醇胺OH-PE羥基-PEmet PE 磷脂酰甲基乙醇胺PC 磷脂酰膽堿NPG 磷脂酰葡萄糖胺PI 磷脂酰肌醇PIM 磷脂酰肌醇甘露糖苷PG 磷脂酰甘油DPG 磷脂酰甘油GL 糖酯脂肪酸iso-16 異十六烷酸或14-甲基十五烷酸10-Me-18 結(jié)核硬脂酸2-OH-16 2-羥基棕櫚酸GF270、GF376、GF473、GF578和GF674的鑒定鑒定這些菌株是基于五個彼此獨立的特征。
1.菌落形態(tài)和顏色短分支菌絲，分裂成棒狀和孢子狀單元。GF270和GF376的菌落是橙紅色(RAL 3022)，GF578和GF674的菌落是淺紅色(RAL 3012)。
2.酞聚糖的二氨基酸內(nèi)消旋二氨基庚二酸3.霉菌酸紅球菌屬霉菌酸用高溫氣相色譜進行長鏈霉菌酸的測定。GF270和GF376的霉菌酸的洗脫曲線與GF473、GF578和GF674相同。GF270和GF376的霉菌酸長度為C38-C46，而GF473、GF578和GF674是C40-C48。與紅球菌屬菌株的霉菌酸構(gòu)型比較。GF270被鑒定為以非常低的相關系數(shù)(0.086)屬于紫紅紅球菌；不可能用這種方法鑒定GF376。鑒定其他三種GF473、GF578和GF674的分離物也以非常低的相關系數(shù)屬于赤紅球菌(Rhodococcus ruber)。
4.脂肪酸構(gòu)型無支鏈的、飽和的和不飽和的脂肪酸包括結(jié)核硬脂酸。脂肪酸構(gòu)型是所有紅球菌屬屬的特征并與分支桿菌屬(Mycobacterium)，土壤絲菌屬(Nocardia)，迪茨氏菌屬(Dietzia)，冢村氏菌屬(Tsukamurella)和一些棒狀桿菌(Corynebacteria)密切相關。通過GF270、GF376、GF473、GF578和GF674與紅球菌種的脂肪酸構(gòu)型的定性和定量差別可在種水平上進行鑒定。
5.盡管GF270和GF376與紅球菌屬菌株的比較表明與最密切相關的紫紅紅球菌的相似度為99.1％，GF270和GF376的16S rDNA序列相同(100％)。GF473和GF578的16S rDNA序列也相同(100％)。GF674與GF578的500個堿基對中只有一對不同(99.8％)。三個分離物都表示與嗜糞紅球菌屬(Rhodococcus coprophilus)關系較遠(98.4％)。
根據(jù)趨化性和分子生物學結(jié)果，可以斷定一方面的GF270和GF376，另一方面的GF473、GF578和GF674是兩種新的紅球菌屬菌株。GF270和GF376的16S rDNA與紫紅紅球菌的關系密切(99.1％)，而GF473、GF578和GF674與嗜糞紅球菌屬只有較遠的關系(98.4％)。
可通過本專業(yè)常規(guī)方法破碎微生物獲得酶提取物，例如通過超聲波破碎、French press method或溶菌酶法。這種酶提取物和當然還有完整的微生物細胞可固定在適宜的支持物上，通常是嵌入聚合物以進行本發(fā)明工藝，或吸附在適宜的支持物上。
根據(jù)本發(fā)明具有腈水合酶活性的酶可從擬無枝酸菌屬微生物中獲得，并能將腈轉(zhuǎn)化成酰胺，特別是它們可從擬無枝酸菌NA40(DSMZ11617)中獲得。
這些酶特別具有下列性能a)最適pH為pH6.5±1.0
b)當pH7.0時最適溫度是35-40℃c)底物3-氰基吡啶的Km值為41.7mM±7.7mM(20℃，45mM磷酸緩沖液，pH7.0)特別是酶具有d)106KDa分子量，例如，通過SDS-PAGE測定。
腈類通常用作生物轉(zhuǎn)化的底物。方便使用或者含有1-10個碳原子的，可任選被羥基、氨基、鹵素或羧基取代的脂肪腈，或者在芳環(huán)系統(tǒng)中有4-10個碳原子的取代或未取代的芳腈?？墒褂玫暮?-10個碳原子的脂肪腈是二腈類、羥基腈類、氨基腈類，例如正辛腈、氰基乙酸、異乙腈、正戊腈、己二腈、戊二腈、丁二腈、癸二腈、丙腈、丁烯腈、丙烯腈、甲基丙烯腈、正丁腈或壬二腈(azelanitrile)?？墒褂玫暮?-10個碳原子的芳腈是下面式代表的腈類
其中R1和R2是氫原子、鹵素原子或C1-4烷基。鹵素原子可使用F、Cl、Br或I。C1-4烷基可使用甲基、乙基、丙基、異丙基、叔丙基、丁基、異丁基或叔丁基。通式I或II的芳腈的適宜代表是2-、3-或4-氰基吡啶，芐腈、氟-、氯-或溴-芐腈，例如，鄰-、間-或?qū)?氯芐腈或2-氯-3-氰基吡啶。含有4-10個碳原子的芳腈優(yōu)選使用3-氰基吡啶。
一次性或連續(xù)加入底物使底物濃度不超過40％(重量)，優(yōu)選30％有利于生物轉(zhuǎn)化的進行。
用靜息(不生長)細胞有利于本工藝的實施。
適用于生物轉(zhuǎn)化的介質(zhì)是本專業(yè)領域常用的，例如低分子量磷酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、根據(jù)表1至3的介質(zhì)或它們的修改型，例如實施例8(1)中所述的或TRIS/HCl緩沖液。
進行生物轉(zhuǎn)化的有利溫度是0-50℃，有利pH值是pH4.5-pH10，優(yōu)選溫度是20-40℃，優(yōu)選pH值是pH4.5-pH10.0。
在特別優(yōu)選的實施方案中，可在C1-4-醇的存在下進行生物轉(zhuǎn)化。使用的C1-4-醇可以是甲醇、乙醇、丙醇或丁醇。優(yōu)選使用甲醇。
反應后，相應的酰胺可用常規(guī)的加工方法，如結(jié)晶作用來進行分離。
實施例實施例1馬杜拉放線菌屬或擬無枝酸菌屬微生物的生長a)用各種腈類或酰胺類作為根據(jù)表1的富集培養(yǎng)基的碳源和氮源接種入各種土壤樣品中并在37℃或45℃培養(yǎng)7-10天。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至相同的培養(yǎng)基中，再在37℃培養(yǎng)7-10天。整個過程重復三次。然后將培養(yǎng)物稀釋并鋪板以獲得單個菌落。將平板在37℃培養(yǎng)5天。然后測試不同的菌落是否具有需要的活性。
以這種方式分離到擬無枝酸菌NA40(DSMZ 11617)和擬無枝酸菌NE31(DSMZ 11616)，然后在最適培養(yǎng)基(表3)上37℃下振搖培養(yǎng)90-100小時。
己二腈作為擬無枝酸菌NE31(DSMZ 11616)、復葉馬杜拉放線菌E3733和復葉馬杜拉放線菌E3736的碳和氮源，壬二腈作為擬無枝酸菌NA40(DSMZ 11617)、復葉馬杜拉放線菌45A32的碳和氮源，正辛腈作為復葉馬杜拉放線菌4501的碳和氮源以及氰基乙酸作為復葉馬杜拉放線菌C15的碳和氮源。
b)在表3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)擬無枝酸菌NA40。在37℃有氧條件下在次培養(yǎng)基(4ml/管)和“主要培養(yǎng)基”(500ml/瓶)中培養(yǎng)2或3-4天。用濁度計在610nm測量細胞生長并以下面的方法計算細胞干重干細胞重mg/ml＝OD610×0.277。
表1富集培養(yǎng)基腈 2.0gKH2PO47.0gMgSO4.7H2O0.1g維生素混合物1.0mlCoCl2.6H2O2.0mgFeSO4.7H2O2.0mg加水至1L(pH6.7-7.3)表2基礎培養(yǎng)基麥芽糖 2.0gNaNO3 1.0gK2HPO40.1gMgSO4.7H2O0.05g加水至100ml(pH7.0)表3最適培養(yǎng)基D-葡萄糖4.5g肉浸膏 0.5gK2HPO40.1gMgSO4.7H2O0.05gCoCl2.6H2O1.0mg加水至100ml(pH7.0)實施例2馬杜拉放線菌屬或擬無枝酸菌屬微生物的生物轉(zhuǎn)化(1)為了測定腈水合酶的活性，將含有3-氰基吡啶(1.0M，1.0ml)、磷酸鉀緩沖液(pH7.0，0.1M，0.5ml)和0.5ml細胞懸浮液的反應混合物(2ml)在20℃攪拌培養(yǎng)30分鐘。加入0.2ml 3N HCl使反應中止。經(jīng)過短暫離心后，用HPLC(使用C18柱(Develosil ODS-HG-5，4.6×250cm)的ShimadzuSPD 6A系統(tǒng)；洗脫液10mM KH2PO4/H3PO4(pH2.8)/乙腈9∶1(v/v)；流速1ml/min；在230nm測定吸收)測定形成的煙酰胺。具體活性用形成的煙酰胺的μmol/ml/min/OD610nm表示。
在富集培養(yǎng)基(表1)中脂肪腈與分離出的細菌的反應速率概括于表5，基礎培養(yǎng)基(表2)中誘導物和輔助因子的影響概括于表4，在基礎培養(yǎng)基(表2)中擬無枝酸菌屬與紅球菌屬的活性比較概括于表6。表4的結(jié)果表明擬無枝酸菌NA40的腈水合酶是持續(xù)表達的，但輔助因子鈷是活性所必需的。
(2)溫度對NA40生長的影響次代培養(yǎng)物于37℃下在表3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)移至含有20ml表3培養(yǎng)基的搖瓶中。在37℃、40℃、45℃、50℃和55℃振搖培養(yǎng)3-4天。測量細胞的生長并在20℃測定腈水合酶的活性。表7表示溫度對腈水合酶活性和細胞生長的影響。
表4基礎培養(yǎng)基中誘導物和輔助因子對具體活性的影響誘導物 生長總活性 比活性(OD610nm) (μmol/ml/min) (μmol/ml/min/OD)- 1.26 20.9 16.6ε-己內(nèi)酰胺0.66 9.52 14.5丁烯酰胺 3.41 22.9 6.72甲基丙烯酰胺 3.33 2.46 0.74丁酰胺 2.19 0.19 0.88丙酰胺 1.91 0.92 0.48脲 1.72 2.97 1.73輔助因子 生長 總活性 比活性(OD610nm) (μmol/ml/min)(μmol/ml/min/OD)- 7.97 0.10 0.01FeSO4.7H2O 8.32 3.36 0.40CoCl2.6H2O 8.41 47.8 5.68
表5使用分離細菌的脂肪腈的轉(zhuǎn)化率菌株 底物 生長總活性比活性(OD610nm) (μmol/ml/min) (μmol/ml/min/OD)擬無枝酸菌屬NE31 己二腈2.68 0.377 0.141(DSMZ 11616)馬杜拉放線菌E3733己二腈1.62 0.347 0.214復葉馬杜拉放線菌″ E3736己二腈1.36 3.00 2.21″ 45A32壬二腈5.81 18.8 3.23″ 4501 正辛腈7.24 32.2 4.45″ C15 氰基乙酸 2.04 7.01 3.43擬無枝酸菌屬NA40 壬二腈5.92 33.0 5.57(DSMZ11617)表6擬無枝酸菌屬與紫紅紅球菌J1活性比較微生物 微生物擬無枝酸菌屬 NA40 紫紅紅球菌J1(DSMZ 11617)(μmol/ml/min)3-氰基吡啶的活性 303 314來自NA40的純化酶 來自J1的純化酶(μmol/min/mg蛋白)(μmol/min/mg蛋白)3-氰基吡啶的活性 1110 371(3)為了測定NA40相對于許多底物的活性，將干重0.0388mg的細胞在上述緩沖液中培養(yǎng)。加入適當?shù)牡孜锲饎臃磻⒃?0℃振搖培養(yǎng)10分鐘。加入0.2ml 2N HCl中止反應并將反應混合物進行短暫離心。用HPLC或氣相色譜分析上清液。表8表示底物特異性的試驗條件。表9表示靜息NA40細胞對各種底物的底物特異性。
各試驗條件概括于表8，結(jié)果概括于表9。
表7生長溫度對腈水合酶活性和細胞生長的影響溫度 生長總活性活性 相對活性(mg/ml)(μmol/ml/min) (μmol/ml/min/mg)(％)37℃ 6.16 4.69 0.761 10040℃ 5.79 9.89 1.7122545℃ 6.56 4.83 0.736 9750℃ 5.96 1.16 0.195 26表8底物特異性的試驗條件底物 底物(mM)分析方法 形成的酰胺3-氰基吡啶1.0 HPLC 煙酰胺2-氰基吡啶0.25HPLC 吡啶酰胺4-氰基吡啶0.25HPLC 吡啶-4-羧酰胺丁烯腈0.4 HPLC 丁烯酰胺芐腈 0.03HPLC 苯甲酰胺丙烯腈0.4 HPLC 丙烯酰胺鄰-氯芐腈 0.15HPLC 鄰-氯苯甲酰胺間-氯芐腈 0.15HPLC 間-氯苯甲酰胺對-氯芐腈 0.15HPLC 對-氯苯甲酰胺2-氯-3-氰基吡啶 0.15HPLC 2-氯-3-煙酰胺乙腈 0.4 GC 乙酰胺丙腈 0.4 GC 丙酰胺甲基丙烯腈0.4 GC 甲基丙烯酰胺正丁腈0.4 GC 正丁酰胺將鄰-、間-、對-氯芐腈和2-氯-3-氰基吡啶加入到溶解在甲醇中的反應混合物中。
表9NA40腈水合酶的底物特異性底物 相對活性(％) 底物 相對活性(％)3-氰基吡啶100 間-氯芐腈 752-氰基吡啶168 對-氯芐腈 164-氰基吡啶128 2-氯-3-氰基吡啶 126丁烯腈51乙腈 -芐腈 52丙腈 105丙烯腈115 甲基丙烯腈130鄰-氯芐腈 96正丁腈194(4)靜息細胞的最適溫度和熱穩(wěn)定性在標準反應混合物中進行10分鐘反應。最適溫度是35-40℃(圖5)。然后將細胞在各種溫度下培養(yǎng)30分鐘并在標準反應條件下測試活性。從圖4中可看出，熱穩(wěn)定性是40℃。
(5)靜息細胞的最適pH和pH穩(wěn)定性為了這一目的，在用各種0.1M緩沖液代替了磷酸鉀緩沖液的標準反應混合物中進行10分鐘反應。從圖6中可看出，最適pH是4.5-10。在20℃時各種pH下培養(yǎng)細胞懸浮液30分鐘，將細胞離心。然后清洗細胞并重新懸浮于0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中。在標準條件下加入3-氰基吡啶進行10分鐘反應。酶在pH4.5-10.0間是穩(wěn)定的(圖7)。
(6)通過NA40從3-氰基吡啶積累煙酰胺在包含500mM 3-氰基吡啶、40mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)和靜息細胞(ganzhong 2.3mg)的反應混合物(30ml)中進行反應。在反應中，只要被消耗，就加入3-氰基吡啶(500mM)，共加7次。以這種方式，在15小時的反應過程中加入4.0M 3-氰基吡啶并形成3.89M(475g/L)煙酰胺，相對的產(chǎn)率是97.3％。沒有形成煙酸。
實施例3擬無枝酸菌屬微生物的鑒定下列5個化學分類標志保證了鑒定1.特征酞聚糖氨基酸內(nèi)消旋二氨基庚二酸
2.特征糖阿拉伯糖和半乳糖3.霉菌酸霉菌酸缺乏4.維生素K2類MK-9(H4)5.脂肪酸構(gòu)型異/反異分支的和2-羥基脂肪酸，檢測到少量10-甲基-分支的脂肪酸。擬無枝酸菌屬的所有代表中均發(fā)現(xiàn)了這種脂肪酸構(gòu)型(脂肪酸構(gòu)型3f)。
這些化學特征的組合是擬無枝酸菌屬所有種類的特征。
借助于主要成分分析使用脂肪酸數(shù)據(jù)庫中的記錄比較兩種培養(yǎng)物的脂肪酸數(shù)據(jù)。使用這種方法，可能將NE31和NA40都分配至擬無枝酸菌屬，然而，由于相關系數(shù)太低，不可能鑒定種類。然而，兩種菌株的脂肪酸構(gòu)型的比較表明它們是兩種不同類型的菌株。
這一結(jié)果被16S rDNA序列分析的結(jié)果證實。這時也將其劃分至擬無枝酸菌屬，但沒有具體到已描述的任何擬無枝酸菌屬種。在這一方法中，通過PCR-放大的16S rDNA基因的直接定序測定16S rDNA的序列。將16S rDNA序列的特征部分與擬無枝酸菌屬和相關分類群的典型種的序列進行比較。結(jié)果表明該菌株屬于擬無枝酸菌屬。發(fā)現(xiàn)與嗜甲基擬無枝酸菌的一致性最高，是96.9％(NA40)和96.1％(NE31)。其中，兩個分離物的序列一致性為99.0％。我們對擬無枝酸菌屬的代表的調(diào)查表明，對于良好的種鑒定來說，相關系數(shù)必需高于99.5％。由于96.9％明顯低于99.5％，可以假定這兩種分離物都不是已知的擬無枝酸菌屬種的代表。
根據(jù)本結(jié)論，不可能將分離物分配至任何已知的擬無枝酸菌屬種中。據(jù)此我們假定NA40和NE31是兩種新的、以前未公開的擬無枝酸菌屬的種類的菌株。
擬無枝酸菌屬微生物的鑒定特征氣生菌絲的顏色基內(nèi)菌絲的顏色擴散色素的顏色糖譜
ARA +GAL +MAD -XYL -GLU vRIB +類型 ADAP DL維生素K2類(％)8/4 -9/0 (+)9/2 +9/4 +++9/6 -9/8 -16S rDNA同源性＞99.5％磷脂PE +OH-PE+lyso PE -met PE -PC -NPG -PI +PIM vPG +DPG +GL -類型 II+OH-PE
脂肪酸iso 16+++iso 15+iso 17(+)anteiso 15+anteiso 17(+)10-Me 16 (+)10-Me 17 +2-OH 15 +2-OH 16 +類型 3fMS-實施例4微生物菌株NA40的腈水合酶的純化將菌株在表3的培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)3天。通過離心收獲2L培養(yǎng)物細胞，然后重新懸浮于0.85％NaCl溶液中。然后將細胞轉(zhuǎn)移至含有44mM正丁酸的0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中并用超聲波處理。將細胞提取物離心并除去細胞碎片。這一提取物用于酶純化。
在整個純化過程中，使用含有44mM正丁酸的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)。從表10中可看出，用三步純化酶至同質(zhì)。
表10NA40腈水合酶的純化總活性 總蛋白 比活性 濃縮(單位)(mg) (U/mg)無細胞提取物 73300 102071.91DEAE-Sephacel 68000 110 620 8.62苯基-TOYOPEARL64800 61.4110515.41單位在20℃催化形成1μmol煙酰胺/min的酶量。
實施例5腈水合酶的特性(1)測定分子量、亞單元結(jié)構(gòu)和鈷離子含量使用含有0.2M KCl和44mM正丁酸的0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)在TSK凝膠柱G3000 SW(0.75×60cm)上色譜法測定分子量為106KDa。確定了酶是有兩種不同的亞單元α和β組成，各自的分子量是30000和26000。


圖1表示通過TSK凝膠G3000 SW色譜法測定分子量圖2表示用SDS-PAGE法測定分子量圖3表示純化酶的吸收譜。觀察到在300-400nm有寬吸收。
(2)純化酶的底物特異性底物特異性的測定類似于實施例2(1)。結(jié)果概括于表11。
表11純化的NA40腈水合酶的底物活性底物 (M)總活性 相對活性(％)(μmol/ml/min)酶反應與靜息細胞的反應3-氰基吡啶1.0 17.7 100 1002-氰基吡啶0.25 39.1 221 1284-氰基吡啶0.25 31.6 179 168丁烯腈0.4 11.9 67 52芐腈 0.03 11.3 64 51丙烯腈0.4 16.6 94 115鄰-氯芐腈 0.15 22.4 127 96間-氯芐腈 0.15 15.9 90 75對-氯芐腈 0.15 2.30 13 162-氯-3-氰基吡啶 0.15 16.0 90 126乙腈 0.4 - --丙腈 0.4 39.3 222 105甲基丙烯腈0.4 22.1 125 130正丁腈0.4 17.9 101 194向反應混合物(2.0ml)中加入1.7單位酶。反應混合物含有在45mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中的各底物。
(3)KM值的測定用Lineweaver-Burk圖表測定對3-氰基吡啶的KM值是41.7mM，對丙烯腈的KM值是3.7mM。與紫紅紅球菌J1比較，其相對于3-氰基吡啶的KM值是200mM，而NA40的明顯要低。這是NA40的主要優(yōu)點之一。
(4)熱穩(wěn)定性的最適溫度將純化的酶在pH7.0、不同溫度下培養(yǎng)30分鐘，然后在20℃測定1分鐘的3-氰基吡啶轉(zhuǎn)化煙酰胺。當溫度高于40℃，酶失去活性。在靜息細胞中熱穩(wěn)定性是約40℃，最適溫度是35-40℃(圖5)。
(5)最適pH和pH穩(wěn)定性為了這一目的，20℃下在含有各種緩沖液(42.5mM)、1.71單位純化的酶和500mM3-氰基吡啶的反應混合物(2.0ml)中進行3-氰基吡啶向煙酰胺的轉(zhuǎn)化。最適pH是約pH6.5±1.0(圖8)。
為了測定pH穩(wěn)定性，將4.2單位的純化酶在20℃于各種緩沖液(45mM)中培養(yǎng)1小時。向標準反應混合物(蠶繭，實施例2(1))中加入部分培養(yǎng)溶液和1.71單位酶。測定殘余活性。酶在pH5-9時穩(wěn)定。結(jié)果示于圖9。
(6)抑制物測定各種抑制物的影響。結(jié)果概括于表12。
表12各種抑制物對純化的酶的影響抑制物 mM 相對活性(％)- 100N-乙基馬來酰亞胺 1 97碘乙酸 1 394-氯亞汞苯甲酸 0.169疊氮化鈉 1 59羥胺 1 37苯肼 1 8氨基脲 1 82Tiron(4，5-二羥基-1，3-苯-二磺酸二鈉鹽)1 110菲咯啉 1 89聯(lián)吡啶 1 1008-羥基喹啉 1 110EDTA(乙二胺四乙酸) 1 115二乙基二硫代氨基甲酸酯 1 89實施例6甲醇對NA40靜息細胞的影響根據(jù)表13，在0-20％(v/v)甲醇的存在下進行10分鐘反應。如表14所示，加入5-15％的甲醇使活性增加。
表13與靜息細胞的反應方法① ② ③ ④⑤1.0M 3-氰基吡啶1.0ml1.0ml1.0m11.0ml1.0ml0.1M KPB*(pH7.0) 0.9ml0.8ml0.7ml0.6ml0.5ml甲醇- 0.1ml0.2ml0.3ml0.4ml細胞懸浮液 0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml(0.388mg/ml)總體積 2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml*KPB＝磷酸鉀緩沖液表14甲醇對擬無枝酸菌NA40的影響方法 甲醇[％(v/v)]相對活性[％]① 0 100② 5 123③ 10 128④ 15 130⑤ 20 105實施例7紅球菌屬微生物的富集向各種土壤樣品中加入氰基乙酸作為根據(jù)表1的富集培養(yǎng)基的碳源和氮源并根據(jù)實施例1分離微生物紅球菌GF270、GF578、GF473和GF376。
實施例8使用紅球菌屬微生物的生物轉(zhuǎn)化(1)與紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)J1相比，紅球菌GF674、紅球菌GF578、紅球菌GF270和紅球菌GF376的熱穩(wěn)定性為了測定熱穩(wěn)定性，將上述微生物培養(yǎng)于下列培養(yǎng)基中。
紫紅紅球菌J1在EP-A0307926公開的培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時。紅球菌屬GF674、GF578、GF270和GF376在下列培養(yǎng)基中pH7.0時培養(yǎng)至96小時紅球菌屬GF674所在培養(yǎng)基含有酵母膏1.0g/l、果糖5.0g/l、麥芽膏10.0g/l、乙酰胺5.0g/l、KH2PO42.0g/l、MgSO4.7H2O 0.5g/l和CoCl2.6H2O10.0mg。紅球菌屬GF578所在培養(yǎng)基含有酵母膏1.0g/l、果糖15.0g/l、麥芽膏10.0g/l、乙酰胺25.0g/l、KH2PO42.0g/l、MgSO4.7H2O 0.5g/l和CoCl2.6H2O 5.0mg。紅球菌GF270所在培養(yǎng)基含有酵母膏12.5g/l、檸檬酸鈉5.0g/l、甲基丙烯酰胺7.5g/l、KH2PO42.0g/l、MgSO4.7H2O 0.5g/l和CoCl2.6H2O 30.0mg。紅球菌GF376所在培養(yǎng)基含有酵母膏1.0g/l、檸檬酸鈉10.0g/l、麥芽膏15.0g/l、丁酰胺7.5g/l、KH2PO42.0g/l、MgSO4.7H2O0.5g/l和CoCl2.6H2O 15.0mg。
然后將靜息細胞在各種溫度下培養(yǎng)15分鐘，并在根據(jù)實施例2(1)的標準反應條件下測定剩余活性。
在這一過程中發(fā)現(xiàn)紅球菌GF674在50℃的相對活性接近100％并且在60℃仍有大約10％的活性。紅球菌GF578同樣在50℃有100％的相對活性并且在60℃有20％的相對活性。紅球菌GF376在直至50℃有100％的相對活性，在60℃有70％的相對活性并在70℃仍有接近5％的相對活性。紅球菌GF270在直至60℃有100％的相對活性并同樣在70℃仍有5％的相對活性。與此相比較，紫紅紅球菌J1在直至50℃有100％的相對活性，60℃有80％并且70℃不再有任何活性。
總之，因此可以強調(diào)說紅球菌GF270和GF376的熱穩(wěn)定性比J1好且GF270的熱穩(wěn)定性最好。
(2)紅球菌屬菌株的最適pHpH對紅球菌屬菌株GF674、GF578、GF270和GF376的腈水合酶的影響是如實施例2(5)中所述進行測定。
紅球菌GF674的最適pH是pH7.5-9.5，GF578的最適pH是pH8-8.5，GF270的最適pH是pH6-7.0和GF376的最適pH是pH6-8。
(3)紅球菌屬菌株的底物特異性底物特異性以相對活性表示概括于表15。
(4)紅球菌屬菌株的煙酰胺累積類似于實施例2(6)，用3-氰基吡啶(約500mM)培養(yǎng)紅球菌屬菌株GF674、GF578、GF270和GF376。在這一過程中，紅球菌GF674在25小時內(nèi)形成6M煙酰胺，GF578于10小時內(nèi)形成5.5M煙酰胺，GF270于20小時內(nèi)形成8.5M煙酰胺，GF376于20小時內(nèi)形成7.5M煙酰胺。
(5)3-氰基吡啶對紅球菌屬菌株活性的耐受性為了測試3-氰基吡啶的耐受性，將靜息細胞在20℃下在3-氰基吡啶的濃度為1-10％(w/v)時培養(yǎng)15分鐘，然后離心移去細胞。用0.85％的NaCl清洗細胞后，測定剩余活性。
在各種底物濃度下測試3-氰基吡啶作為底物的耐受性。發(fā)現(xiàn)當?shù)孜餄舛葹?％(w/v)時，紫紅紅球菌J1的腈水合酶活性降低1.4倍，紅球菌GF674的腈水合酶活性在4％(w/v)底物濃度時降低1.4倍，紅球菌GF578的腈水合酶的活性幾乎保持恒定直至底物濃度為8％，紅球菌GF270的腈水合酶活性當?shù)孜餄舛葹?％(w/v)時降低1.17倍，紅球菌GF376的腈水合酶活性當?shù)孜餄舛葹?0％(w/v)時降低1.25倍。
與其他紅球菌屬菌株相比，紫紅紅球菌J1對3-氰基吡啶的耐受性最差。表1權利要求
1.擬無枝酸菌屬或馬杜拉放線菌屬微生物，其特征在于所述微生物能將腈轉(zhuǎn)化成酰胺，和它們的酶提取物。
2.根據(jù)權利要求1所述微生物的擬無枝酸菌NA40和擬無枝酸菌NE31種，例如以保藏號DSM 11617和DSM 11616保藏的微生物，和其功能相當?shù)淖兎N和突變種。
3.紅球菌GF270和GF376種微生物，例如以保藏號DSM 12211和DSM 12175保藏的微生物，和其功能相當?shù)淖兎N和突變種，其特征在于所述微生物能將腈轉(zhuǎn)化成酰胺，和它們的酶提取物。
4.具有腈水合酶活性的酶，可從根據(jù)權利要求1和2的微生物中獲得。
5根據(jù)權利要求4所述的酶，其特征在于a)最適pH為pH6.5±1.0b)pH7.0時的最適溫度為35-40℃c)對底物3-氰基吡啶的KM值為41.7mM±7.7mM。
6.制備酰胺的工藝，其特征在于，用根據(jù)權利要求1-3中任一項的微生物，使用這些微生物的酶提取物或用根據(jù)權利要求4的酶將底物腈轉(zhuǎn)化成相應的酰胺。
7.根據(jù)權利要求6的工藝，其特征在于所用的腈是含有1-10個碳原子的可任選取代的脂肪腈。
8.根據(jù)權利要求6的工藝，其特征在于所用的腈是在芳環(huán)體系中含有4-10個碳原子的可任選取代的芳腈。
9.根據(jù)權利要求8的工藝，其特征在于所述芳腈選自通式
的化合物，其中R1和R2是氫原子、鹵素原子或C1-4烷基。
10.根據(jù)權利要求6-9中任一項的工藝，其特征在于所述反應是在0-50℃和pH4.5-10的條件下進行。
11.根據(jù)權利要求6-10中任一項的工藝，其特征在于所述反應是使用名為NA40(DSMZ 11617)或NE31(DSMZ 11616)的擬無枝酸菌屬微生物或使用其功能相當?shù)淖兎N和突變種來進行的。
全文摘要
公開了一種新的從酰胺開始制備腈的生物技術工藝。該工藝使用擬無枝酸菌屬、馬杜拉放線菌屬或紅球菌屬微生物。
文檔編號C12N9/88GK1265154SQ98807505
公開日2000年8月30日 申請日期1998年7月22日 優(yōu)先權日1997年7月22日
發(fā)明者卡倫·特雷絲·羅賓, 長澤透 申請人:隆薩股份公司